Aus der Klinik für Plastische Chirurgie der Universität zu Lübeck ...

3.1.7 FACS – Analyse
Zur Messung der Transfektionsrate von GFP-und bicistronisch GFP/VEGF 165 transfizierten
Zellen wurde in der GBF/Braunschweig eine FACS – Analyse der modifizierten Zellen
durchgefÄhrt.
3.2 Methoden
3.2.1 Implantation von Silastik und Gewinnung der Fibroblasten
Zuerst wurden 10 weibliche Sprague Darley Ratten ë 225g mit CO2 begast und anschlieÖend
eine intraperitoneale Narkose mit 0,05ml Rompun und 0,325ml Ketanest gesetzt. Nachdem
die Tiere ausreichend narkotisiert waren, wurde auf dem RÄcken kranial ein 2cm langer
Schnitt gemacht und von da aus die Subkutis von der Muskelfaszie gelÑst, um eine kleine
HÑhle zu schaffen fÄr die anschlieÖende Einlage von einem 5cm langen und 1cm breiten
StÄck Silastik. Danach wurde der Schnitt zugenÅht und die Tiere zurÄck in die KÅfige gesetzt.
Eine Woche spÅter wurden die Tiere wieder wie oben narkotisiert und anschlieÖend das
Fibroblastenkonglomerat, das sich als Folge der FremdkÑrperreaktion um das Silastik gebildet
hatte, entnommen und in ein mit 20 ml DMEM gefÄlltes 50ml Falcon gelegt. Danach wurden
die Tiere euthanasiert. Dann wurde das Konglomerat in einem Labor der gentechnischen
Sicherheitsstufe 1 unter sterilen Bedingungen von der Silastikmembran abgelÑst. Das Material
wurde ausgiebig gewaschen in insgesamt 10 x 50ml Falcons mit 20ml PBS, wobei es 10mal
60 Sekunden lang krÅftig geschÄttelt wurde. Nach dem Waschen wurde das Material in einer
Petrischale mit zwei Skalpellen klein geschnitten. Danach wurde das Material in eine sterile
25ml Monovette gegeben und 60 min bei 37äC mit 10ml einer CollagenaselÑsung (2mg
Collagenase/ ml PBS) und 5ml DMEM ohne ZusÅtze enzymatisch behandelt, um die
Fibroblasten aus dem Kollagenverband zu lÑsen. AnschlieÖend wurde der âberstand mit den
Zellen durch sterile Gaze gefiltert und mit dem Äbrigen Gewebe noch einmal gleichsinnig
verfahren. Danach wurde die so gewonnene Suspension 4 min lang bei 1200 U/ min
zentrifugiert, sodass sich die Fibroblasten am GefÅÖboden als Pellet abgesetzt haben. Nach
Suspension in 10 ml DMEM wurden 20 êl abpipettiert, um die Zellzahl in einer
ZellzÅhlkammer zu bestimmen. Anschliessend wurden die Fibroblasten kryoasserviert oder
weiter kultiviert.
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