1 1. Leuchtbakterientest nach DIN 38412 Prinzip: Bestimmung der ...

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
1. Leuchtbakterientest nach DIN 38412
Prinzip:
Bestimmung der akuten Toxizität (G-Wert) auf flüssiggetrocknete Leuchtbakterien. Die
Leuchthemmung durch die Probe wird gegen einen nicht toxischen Kontrollansatz bestimmt.
Materialien:
Lumistox 300 der Fa. Dr. Lange
flüssiggetrocknete Leuchtbakterien Vibrio fischeri
Probe: 20 % NaCl
2%ige NaCl als Verdünnungsmedium
Durchführung:
- Reaktivierung der Leuchtbakterien (Auftauen, mit Nährlösung temperieren)
- Herstellen einer geometrischen Verdünnungsreihe bzw. Verdünnungsreihe nach
DIN entsprechend Herstellerangaben (Originalprobe, 8 Verdünnungen und eine
Kontrolle)
- Testdurchführung siehe Geräteanweisungen; angezeigte Werte sicherheitshalber
mitschreiben
Auswertung:
Bewerten Sie den erzielten G-Wert.
Welche Aussage läßt sich über die Toxizität der Probe treffen?
Wodurch wird eine toxische Wirkung allgemein und speziell im Fall von 20%iger NaCl
verursacht?
Inwieweit ist dieses Ergebnis auf andere Bakterien bzw. andere trophische Ebenen übertragbar?
2. Gewinnung von Bodenmikroorganismen
2.1. Qualitativer Nachweis von Bodenmikroorganismen
(ver. nach KLUGE / MENZEL)
In der flüssigen und festen Phase des Bodens liegen Mikroorganismen (MO) in unterschiedlicher
Menge vor. In Untersuchungen wurde beispielsweise festgestellt, daß 1 ml
Bodenlösung 7300 MO, 1 g lufttrockene Bodensubstanz aber 2,5 * 10 6 MO enthielt. Jeder
Bodenkrümel ist dicht von MO besiedelt, die ihrerseits zu Stabilisierung des Krümels
beitragen.
Material:
3 verschiedene gesiebte Böden: z.B. Garten- und Sandboden, Ufersediment , Kompost
flüssiger sterilisierter Nährboden
3 sterilisierte Objektträger
Petrischale mit Filterpapier
steriles Wasser
Holzzange, Spatel
Durchführung:
- Tauchen Sie nacheinander die Objektträger in den flüssigen Nährboden, dazu Holzzange
benutzen.
1

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
- Legen Sie die Objektträger auf eine Schale, lassen Sie den Agarfilm erstarren und
reinigen Sie die Unterseite der Objektträger vorsichtig mit einem angefeuchteten
Papiertuch.
- Streuen Sie mit einem Spatel auf die Agaroberfläche einige wenige, möglichst kleine
Bodenkrümel (eine Bodenart je Objektträger)
- Befeuchten Sie das Filterpapier in der Petrischale mit wenig sterilem Wasser und
legen Sie die Objektträger mit der Agarseite nach oben hinein
- die Schalen werden beschriftet (Name der Gruppe) und verschlossen 24 Stunden
bei 28 °C bebrütet
Auswertung:
1. Betrachten Sie bei geringer mikroskopischer Vergrößerung die Präparate und stellen
Sie fest, ob sich um die Krümel Höfe von Bakterien gebildet haben und Pilzhyphen
sichtbar sind.
2. Setzen Sie die Ergebnisse zu dem Gehalt an organischen Stoffen in den unterschiedlichen
Böden in Beziehung.
2.2. Quantitative Bestimmung von Bodenbakterien
(ver. nach DUNGER (Hrsg.): Methoden der Bodenbiologie)
Agar-Platten-Methode für wachstumsfähige Zellen:
Die Agarplatten-Zählung ist das am meisten angewandte Verfahren zur Bestimmung
der Zahl lebenden Mikroorganismen in Böden.
Prinzip: Die Bodenprobe wird in einem Dispersionsmittel dispergiert und ein aliquoter
Teil in ein Agarmedium geimpft. Die Bebrütung erfolgt solange, bis jede lebende Zelle
(Bakterie) eine separate Kolonie gebildet hat. Man nimmt an, daß jede Kolonie aus einer
einzigen Zelle hervorging.
Geräte und Chemikalien:
sterile Glasgeräte, steriles Wasser
Petrischalen mit Nährboden, Schüttelmaschine
Bodenprobe, gesiebt (nach Wahl)
Durchführung:
1. Anlegen einer Verdünnungsreihe
⇒ 1 g Boden im Kolben auswägen, 99 ml steriles Wasser dazugeben
(entspricht 10 -2 )
⇒ 10 min schütteln lassen, 1 min absetzen
⇒ Verdünnungsröhrchen 10 -3 , 10 -4 und 10 -5 beschriften und mit der 10 ml - Pipette je 9
ml steriles Wasser vorlegen
⇒ aus dem Bodeneluat (Überstand) mittels 1 ml - Pipette 1 ml in Röhrchen 10 -3 geben,
Röhrchen verschließen und leicht schwenken
⇒ daraus mit neuer Pipette 1 ml in Röhrchen 10 -4 geben, Röhrchen verschließen und
leicht schwenken
⇒ mit 10 -5 bzw. folgenden Stufen ebenso verfahren
2

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
2. Platten beimpfen:
− beginnen mit Verdünnungsfaktor 10 -5 !
− je 0,1 ml auf die Platte aufgeben und mit Drigalsky-Spatel verteilen
− (für den Parallelansatz sowie in aufsteigender Konzentration kann derselbe Spatel
verwendet werden)
− Platten beschriften: Name, Verdünnungsstufe; Nährbodentyp
− dieselbe Spitze kann für die weiteren Verdünnungsstufen genutzt werden
− entsprechend Platten mit 10 -4 und 10 -3 beimpfen
Auswertung:
1. Kolonien auszählen und Zahl der koloniebildenden Einheiten (KBE)/g TS berechnen:
N
KBE = in KBE / g feuchter Boden
f × V
N ... Kolonien pro Platte
f .... Verdünnung, z.B. 1 / 10000
V ... ausgespateltes Volumen 0,1 ml
Hinweis: - nur die Platten auswerten, wo N = 20 .... 200 beträgt
- wenn möglich, Mittelwert mehrerer Platten bilden
2. Vergleichen Sie die verschiedenen Böden hinsichtlich ihrer Besiedlung! (Anhand der
Ergebnisse der anderen Versuchsgruppen)
2.3. Nachweis von Pilzen
Geräte und Chemikalien:
3 Würzeplatten, steriles Wasser
sterile Pipetten und Geräte, Verdünnungsreihe aus 2.2.
Durchführung:
− Verdünnungsreihe aus Versuch 2.2. verwenden
− die Platten mit 0,1 ml der entsprechenden Konzentration (10 -5 , 10 -4 , 10 -3 ) beimpfen,
beschriften und 6 Tage bei 25°C bebrüten
Auswertung:
− Zählen Sie die gewachsenen Kolonien auf jeder Platte und berechnen Sie die Gesamtzahl.
Vergleichen Sie die verschiedenen Böden hinsichtlich ihrer Besiedlung !
− Beschreiben Sie Form und Farbe der gewachsenen Kolonien.
− Fertigen Sie von 2 unterschiedlichen Kolonien ein mikroskopisches Präparat an und
skizzieren Sie die Form von Hyphen und Sporen.
3. Isolierung
3.1. Isolierung von Bodenbakterien, Gewinnung von Reinkulturen
Geräte:
3 Platten DEV-Nähragar
Impföse, Brenner
3

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
Durchführung:
Wählen Sie einen beliebigen Bakterienstamm aus den Bodenplatten vom letzten Versuch
aus und stellen Sie einen „fraktionierten Ausstrich“ her:
- einen Teil der Agarplatte bestreichen (s. Beispiel)
- Impföse ausglühen, erkalten lassen
- aus dem 1. Impfstrich Mikroorganismen in den 2. Impfstrich ziehen
- Impföse ausglühen, erkalten lassen
- den dritten Impfstrich ziehen
- Impföse ausglühen
� Mit zwei weiteren Stämmen wiederholen. Die Platten mit A, B, C beschriften. Diese
werden in den folgenden Versuchen weiterverwendet.
Auswertung:
Stellen Sie fest, in welcher Weise das Wachstum erfolgt ist (dick bewachsener Impfstrich,
Einzelkolonien) !
1. Kontrollieren Sie die beimpfte Nähragarplatte auf das Vorhandensein von Fremdinfektionen
(Form und Farbe bei Bakterien und Pilzkolonien, Mycelbildung usw.) !
3.2.Isolierung von Aktinomyceten
Als Antibiotikabildner haben Aktinomyceten (z.B. Streptomyces) eine große Bedeutung.
Sie leben im Boden, wo sie neben verzweigten Hyphen ein hochentwickeltes Luftmycel
bilden. Ziel dieses Versuches ist es, einige antibiotikaproduzierende Aktinomyceten zu
isolieren.
Materialien:
Bodenplatten aus Versuch 2.2.
3 Platten DEV-Nähragar
Durchführung:
Zunächst erfolgt eine Beobachtung eines Lebendpräparates verdächtiger Kolonien im
Mikroskop. Aktinomyceten können durch Pigmentabscheidung in den Agar und durch
eine gipsartige Kolonieoberfläche auffallen. Im Mikroskop sind unseptierte Hyphen mit
0,8 – 1,5 µm Durchmesser zu erkennen.
Erstellen Sie von drei verdächtigen Kolonien Reinkulturen mittels fraktioniertem Ausstrich.
(s. 3.1.)
4. Zählung von Denitrifikanten mittels MPN - Methode (most probable number)
(ver. nach Trolldenier, Bodenbiologische Arbeitsmethoden,
Springer Verlag 1993)
Grundlagen:
Die MPN - Methode ist ein statistisch abgesichertes Schätzverfahren, bei der aus der
Zahl von positiven Röhrchen (= Wachstum, Gasbildung) die wahrscheinliche Keimzahl
pro ml oder g TS bestimmt wird. Neben Stoffwechselleistungen können auch andere
Prozesse nach dieser Methode bestimmt werden.
4

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
Als Denitrifikation wird die Reduktion von Nitrat über Nitrit zu gasförmigen Stickstoffverbindungen
bezeichnet. Bei den Denitrifikanten, die in fast allen Bakteriengattungen vorkommen,
handelt es sich um aerobe Bakterien, die bei Sauerstoffmangel Nitrat als
Wasserstoffakzeptor verwenden.
Die Denitrifikation ist sowohl im Wasser (Abwasserreinigung) als auch im Boden (z.B.
Abbau von Düngemitteln) von Bedeutung.
Prinzip:
Eine dezimal verdünnte Bodensuspension wird in Kulturröhrchen übertragen, die mit
einer nitrathaltigen Nährlösung gefüllt sind und zur Gassammlung Durham-Röhrchen
enthalten.
Aus der Anzahl der Röhrchen, in denen bei verschiedenen Verdünnungsstufen Gasbildung
auftritt, wird die „wahrscheinlichste Zahl“ der Denitrifikanten in der Bodenprobe
ermittelt.
Material und Geräte:
verschließbare Kulturröhrchen mit Durhamröhrchen
Chemikalien und Reagenzien:
Dispergierungslösung 0,2 % Natriumpolyphosphat oder Ringer - Lösung
Nährlösung für Denitrifikanten: 8,0 g Nährbouillon (Merck 5443) werden mit 1,5 g Kaliumnitrat
in 1000 ml dest. Wasser gelöst, davon je 9 ml luftblasenfrei in Kulturröhrchen
gefüllt und autoklaviert
Nitrat-Test: z.B. Merckoquant-Teststäbchen
Ausführung der Bestimmung:
Herstellen einer dezimalen Verdünnungsreihe des Bodens:
- 1g Boden in 100 ml Dispergierungslösung suspendieren, 30 min schütteln (10 -2 )
- aus dem Überstand 1 ml in 9 ml Dispergierungslösung übertragen (10 -3 ) usw. bis
10 -5
Je nach zu erwartender Keimdichte werden 5 Kulturröhrchen pro Verdünnungsstufe mit
1 ml verdünnter Bodensuspension beimpft. Man beginnt bei der höchsten Verdünnungsstufe
(z.B. 10 -5 ) und verwendet alle Verdünnungen bis zur Stufe 10 -2 .
Die Röhrchen werden 2 Wochen bei 28 °C bebrütet.
Danach wird die Zahl der Röhrchen je Verdünnungsstufe vermerkt, in denen Gasbildung
auftritt. In den 3 höchsten Verdünnungsstufen mit Gasbildung wird der Inhalt auf
Anwesenheit von Nitrat geprüft. Röhrchen mit Gasbildung müssen noch NO3-positiv
sein.
(Test mit Merckoquant - Teststäbchen)
Berechnung der Zahl der Denitrifikanten:
Aus der Zahlenkombination der positiven Röhrchen wird mit Hilfe der Tabelle die wahrscheinlichste
Zahl an Denitrifikanten ermittelt.
Unter Berücksichtigung der Verdünnungsstufe wird die Zahl der Denitrifikanten pro g
Boden (feucht) errechnet.
Rechenbeispiel MPN-Methode:
Werden bei der Verdünnung 10 -4 5 (p1 = 5) positive, bei der Verdünnung 10 -5 3 (p2 =
3) und bei der Verdünnung 10 -6 2 (p3 = 2) positive, aber bei 10 -7 keine positiven Röhr-
5

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
chen registriert, dann findet man für die Zahlenkombination 5 – 3 – 2 in der Tabelle „1.4“
als die wahrscheinliche Zahl an Organismen.
mittlere positive Verdünnung 10 -5 ---> Verdünnungsfaktor 10 5
= 1.4 x 10 5 Organismen / g Boden (feucht) o. umrechnen auf TS
Tabelle 1:
Tafel der wahrscheinlichsten Zahlen bei Anwendung zehnfacher Verdünnungsstufen und 5 Röhrchen je
Stufe
p1 p2 wahrscheinlichste Zahl für nachgewiesene Werte von p3
0 1 2 3 4 5
0 0 n.a. 0.018 0.036 0.054 0.072 0.090
0 1 0.018 0.036 0.055 0.073 0.091 0.11
0 2 0.037 0.055 0.074 0.092 0.11 0.13
0 3 0.056 0.074 0.093 0.11 0.13 0.15
0 4 0.075 0.094 0.11 0.13 0.15 0.17
0 5 0.094 0.11 0.13 0.15 0.17 0.19
1 0 0.020 0.040 0.060 0.080 0.10 0.12
1 1 0.040 0.061 0.081 0.10 0.12 0.14
1 2 0.061 0.082 0.10 0.12 0.15 0.17
1 3 0.083 0.10 0.13 0.15 0.17 0.19
1 4 0.11 0.13 0.15 0.17 0.19 0.22
1 5 0.13 0.15 0.17 0.19 0.22 0.24
2 0 0.045 0.068 0.091 0.12 0.14 0.16
2 1 0.068 0.092 0.12 0.14 0.17 0.19
2 2 0.093 0.12 0.14 0.17 0.19 0.22
2 3 0.12 0.14 0.17 0.20 0.22 0.25
2 4 0.15 0.17 0.20 0.23 0.25 0.28
2 5 0.17 0.20 0.23 0.26 0.29 0.32
3 0 0.078 0.11 0.13 0.16 0.20 0.23
3 1 0.11 0.14 0.17 0.20 0.23 0.27
3 2 0.14 0.17 0.20 0.24 0.27 0.31
3 3 0.17 0.21 0.24 0.28 0.31 0.35
3 4 0.21 0.24 0.28 0.32 0.36 0.40
3 5 0.25 0.29 0.32 0.37 0.41 0.45
4 0 0.13 0.17 0.21 0.25 0.30 0.36
4 1 0.17 0.21 0.26 0.31 0.36 0.42
4 2 0.22 0.26 0.32 0.38 0.44 0.50
4 3 0.27 0.33 0.39 0.45 0.52 0.59
4 4 0.34 0.40 0.47 0.54 0.62 0.69
4 5 0.41 0.48 0.56 0.64 0.72 0.81
5 0 0.23 0.31 0.43 0.58 0.76 0.95
5 1 0.33 0.46 0.64 0.84 1.1 1.3
5 2 0.49 0.70 0.95 1.2 1.5 1.8
5 3 0.79 1.1 1.4 1.8 2.1 2.5
5 4 1.3 1.7 2.2 2.8 3.5 4.3
5 5 2.4 3.5 5.4 9.2 16 n.a.
6

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
5. Stoffwechselleistungen von Mikroorganismen
5.1. Aerobe Cellulosezersetzung (ver. nach SCHINNER (Hrsg.) u.a.: Bodenbiologische
Arbeitsmethoden)
Grundlagen:
Cellulose ist ein schwerer zersetzbares, aus Glucoseeinheiten zusammengesetztes
Polysaccharid, das jährlich in großen Mengen in Form von Ernterückständen und Streu
in und auf den Boden gelangt (z.B. Kompostierung ). Der Abbau ist für den C - Kreislauf
der Erde von außerordentlicher Bedeutung. Der Abbau findet meist unter aeroben Bedingungen
statt, einige Organismen zersetzen Cellulose aber auch unter anaeroben
Bedingungen. Cellulose wird enzymatisch in Cellobiose und diese in Glucose gespalten.
5.1.1. Ermittlung der Cellulosezersetzer
Prinzip:
Man ermittelt die Koloniezahl auf einem Agarmedium, in dem Cellulose die einzige Kohlenstoffquelle
ist.
Geräte und Chemikalien:
sterile Pinzette, Spatel, Pipetten, Kolben
steriles Wasser
sterile Filterpapierscheiben
kohlenstofffreier Nähragar: 3 Platten
Bodenprobe
Teil A:
- Herstellen einer Boden - Verdünnungsreihe bis 10 -3
- 0,2 ml Bodensupension (10 -2 , 10 -3 ) werden auf den Agar pipettiert und durch Hin-
und Herbewegen über die Oberfläche verteilt. Mittels Pinzette legt man auf den Agar
eine sterile Filterpapierscheibe und drückt diese mit einem sterilen Drigalskispatel
vorsichtig an. so daß das Papier dem Agar dicht anhaftet.
- Die Schalen werden bei 22 - 25 °C bebrütet.
Auswertung:
Nach 10 - 15 Tagen zählt man die auf der Cellulose herangewachsenen Kolonien von
Bakterien: schleimige farblose oder farbige Flecke
Aktinomyceten: kleinere, dichte, feinfaserige Kolonien (weiß bis grau)
Pilzen: faserige Kolonien, Faserdurchmesser über 1 µm
Die Ergebnisse werden auf 1 g trockenen Boden umgerechnet.
Stellen Sie je ein mikroskopisches Präparat von einer Aktinomyceten- und einer Pilzkultur
her und skizzieren Sie das mikroskopische Bild.
Teil B:
Die 3. Platte wird mit den Stämmen A, B, C strichförmig beimpft. Danach wird wie oben
Filterpapier aufgelegt und dieses mit wenig sterilem Wasser befeuchtet.
Auswertung:
In welchem Umfang ist ein Wachstum (=Celluloseabbau) erfolgt ?
7

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
5.1.2. Ermittlung der Intensität der Cellulosezersetzung im Laborversuch
Prinzip:
Auf die Bodenprobe wird steriles Filterpapier gedrückt. Der Besiedelungsgrad durch
Bakterien oder Pilze und der Zersetzungsgrad der Cellulose sind zu ermitteln.
Geräte und Chemikalien:
2 sterile Petrischalen
Filterpapier in Streifen 1 cm x 5 cm
Objektträger, steriler Spatel, Pinzette
steriles Wasser
Lupe oder Stereomikroskop
Ausführung:
Eine etwa 6 mm hohe Schicht Feinerde wird in der Petrischale ausgebreitet, mit sterilem
Wasser angefeuchtet und mit einem Objektträger oder Spatel eingeebnet. Auf die
Oberfläche drückt man 3 Streifen Filterpapier.
Die Bebrütung erfolgt bei Zimmertemperatur im Dunklen.
Auswertung:
Nach 1 und 2 Wochen wird die Streifenoberfläche beobachtet und die Anteile der mit
Bakterien, Aktinomyceten und Pilzen bewachsenen Fläche (bzw. die Abbaurate) ermittelt.
Als Hilfsmittel zur Abschätzung der Flächenanteile kann eine Schablone verwendet
werden, die über dem Papierstreifen auf den Deckel gelegt wird.
5.2. Nachweis der Antibiotikabildung von Aktinomyceten
Die in Aufgabe 3.2. isolierten MO werden auf ihre antibiotische Wirkung hin an den
Stämmen A,B und C aus Versuch 3.1. getestet.
Material:
Impfösen,
DEV-Nähragar : 2 Platten, Doppelbestimmung
Stämme A, B, C
Durchführung:
Wählen Sie aus den Platten „Aktinomycet-Verdächtiger“ die am besten gewachsene
aus und kontrollieren mittels mikroskopischem Präparat, ob es sich um Aktinomyceten
handelt (Hyphenbildung).
Die Agarplatten werden mit je 3 Teststämmen und dem Aktinomyceten beimpft.
Dazu wird von einer Reinkultur ein Teil strichartig auf eine Platte aufgetragen. Parallel
dazu werden die beiden anderen Reinkulturen aufgetragen.
Dann wird senkrecht dazu ein Teil Aktinomycet aufgestrichen.
Auswertung:
Es wird beobachtet, auf welchen Testorganismus eine Hemmwirkung zu beobachten
ist.
8

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
5.3. Zuckervergärung mit Bodenisolaten
(ver. nach DUNGER und FIEDLER: Methoden der Bodenbiologie)
Prinzip:
Kommt es nicht zur unmittelbaren Assimilation einfacher Kohlenhydrate, so werden diese
enzymatisch durch Bodenmikroorganismen je nach den Umweltbedingungen zu
CO2, H2, CH4 oder Säuren umgesetzt. Da verschiedene Organismen verschiedenartig
mit Enzymen ausgestattet sind und folglich unterschiedliche Endprodukte bilden, werden
diese Reaktionen zur Bakteriendiagnostik herangezogen.
Geräte und Chemikalien:
10 Röhrchen mit Kulturlösung (mit Indikator für pH-Bereich 7,0 bis 7,2 und Durhamröhrchen)
sterile Pipetten, Geräte zur Sterilfiltration
verschiedene 7,5 %ige Zuckerlösungen (Saccharose, Fructose, Glucose),
3 Reinkulturen von Bodenmikroorganismen (A, B, C)
Durchführung:
− die Zuckerlösungen werden sterilfiltriert
− in 3 Röhrchen werden 1 ml Saccharoselösung pipettiert und die Röhrchen beschriftet
(Zucker, Stamm)
− danach wird ein Röhrchen mit Stamm A, das 2. mit Stamm B und das 3. mit Stamm
C beimpft (nach jedem Schritt Impföse ausglühen!)
− in weitere 3 Röhrchen 1 ml Fructoselösung pipettieren und ebenfalls mit den 3 Teststämmen
beimpfen
− in weitere 3 Röhrchen 1 ml Glucoselösung pipettieren und ebenfalls mit den 3 Teststämmen
beimpfen
− ein Röhrchen verbleibt ohne Zucker und unbeimpft als Kontrolle
− die Röhrchen werden 2 - 6 Tage bei 30 °C bebrütet
Auswertung:
Die Testergebnisse für Säurebildung (bläuliche Verfärbung) und Gasbildung stellt man
in einer Tabelle mit den Bezeichnungen positiv +, sehr schwach ± oder negativ - zusammen.
5.4. Stärkeabbau (ver. nach SCHINNER (Hrsg.) u.a.: Boden biologische Arbeitsmethoden)
Prinzip:
Stärke ist ein Gemisch von Vorratspolysacchariden (Amylose und Amylopektin), das
nach deren Absterben durch die Bodenmikroflora verhältnismäßig schnell zersetzt wird.
Zahlreiche Bakterien, Aktinomyceten und niedere Pilze produzieren das Enzym Amylase,
das eine Stärkehydrolyse in Glucose bewirkt. Einem mineralischen Nährmedium
gibt man Stärke als einzige Kohlenstoffquelle zu. Die Stärkehydrolyse wird durch Reaktion
mit einer Jod-Lösung (Lugolscher Lösung) nachgewiesen.
Geräte und Chemikalien:
Bodenprobe
5 sterile Petrischalen, Kolben, Röhrchen, Wasser
Stärkeagar, frisch autoklaviert
Lugolsche Lösung
9

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
Durchführung:
Teil A:
- Herstellen einer Verdünnungsreihe bis zur Stufe 10 -5
- 1 ml Bodensuspension, z.B. der Verdünnungsstufe 10 –5 werden in eine Petrischale
pipettiert und mit einer dünnen Schicht sterilem Nähragar (2-5 mm) überschichtet
- mit 10 –4 , 10 –3 und 10 –2 genau so verfahren
- (Inkubation: 6 Tage bei 30 °C )
Teil B:
- eine Platte gießen und erstarren lassen
- Beimpfen der Stärkeplatte mit Stamm A, B, C mit einfachem Ausstrich
- 6 Tage bei 30 °C bebrüten (Vorsicht, Agar ist sehr weich!)
Auswertung:
Nach Überschichten der Platte mit einigen Tropfen Lugolscher Lösung kann man verschiedene
Abbauphasen feststellen:
Um die Kolonien der stärkehydrolysierenden Mikroorganismen bilden sich farblose oder
rotbraun gefärbte Zonen. Die farblosen Zonen zeigen eine Stärkehydrolyse zu Zuckern,
die rotbraunen zu Erythrodextrin (Zwischenstufe des Abbaus) an.
Bewerten Sie die Reaktion auf der Platte und das Stärkeabbaupotenzial der Bodenmikroorganismen
allgemein (Teil A) und der Teststämme (Teil B).
5.5. Bestimmung der Konzentration von Fettspaltern in einem Boden
Fettspaltung durch Teststämme
Prinzip:
In diesem Versuch sollen Mikroorganismen, die Lipasen bilden, nachgewiesen werden.
Lipasen sind Enzyme, die Fette in Glycerin und Fettsäuren spalten. Dadurch verursachen
sie Ranzigkeit von Speisefetten oder fetthaltigen Cremes. Auf diesem Wege werden
im Boden Mineralölkontaminationen abgebaut.
Geräte und Chemikalien:
Bodenprobe bzw. Verdünnungen aus V 5.4, Stämme A, B, C
sterile Röhrchen und Petrischalen (5), Spatel, Pipetten
Tributyrin – Agar, steril, flüssig
1 Platte DEV – Nährboden zur Stammhaltung
Durchführung:
Teil A:
- analog V 5.4 1 ml der entsprechenden Konzentration in die Petrischale pipettieren
- 10 min auf 37 °C erwärmen (Brutschrank)
- in die vorgewärmten Petrischalen etwa 6 ml Tributyrin – Agar gießen (nicht höher als
2 mm) und durch vorsichtiges Schwenken mit der Probe vermischen
- Achtung: Wegen der geringen Agarmenge und der niedrigen Temperatur des Agars
muß zügig gearbeitet werden, um ein vorzeitiges Erstarren zu vermeiden. Das
Durchmischen von Probe und Agar muß jedoch gründlich erfolgen, damit die in der
Probe enthaltenen MO gleichmäßig verteilt werden.
Bebrütung: 3 Tage, aerob, dunkel
10

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
Teil B:
- Gießen Sie in eine Petrischale ca. 10 ml Tributyrinagar
- nach dem Erstarren wird diese mit den Stämmen A, B, C strichförmig beimpft (Striche
auf dem Boden der Platte vorzeichnen und beschriften)
Bebrütung: 3 Tage bei 30 °C, aerob, dunkel
Auswertung:
A: Fettspalter spalten das Tributyrin (mittels Lipase) in Glycerin und Buttersäure. Diese
Stoffe sind im wäßrigen Medium löslich, es bildet sich ein klarer Aufhellungshof um die
Kolonien. Dieser ist bei der geringen Schichtdicke gut zu erkennen. Berechnen Sie die
Zahl der Fettspalter pro g Probe und treffen Sie eine Aussage über die Fettspaltungskapazität
der Bodenmikroorganismen.
B: Befindet sich um den Impfstrich der Stämme A, B, C ein aufgehellter Bereich, ist der
jeweilige Stamm in der Lage, Lipasen zu bilden.
5.6. Gelatineverflüssigung
(verändert nach ALEXANDER & STRETE: Mikrobiologisches Grundpraktikum PEARSON 2006)
Prinzip:
Gelatine ist ein Protein (denaturiertes Kollagen), das von extrazellulären bakteriellen
Enzymen, so genannten Gelatinasen, aufgelöst werden kann. Die Endprodukte dieses
Abbaus sind Aminosäuren, die in die Zelle transportiert und dort verstoffwechselt werden.
Geräte und Chemikalien:
Stämme A, B, C
4 Röhrchen mit Gelatine-Agar
Impfnadel
Durchführung:
Je ein Röhrchen mittels steriler Impfnadel mit einem Stamm beimpfen. Das 4. Röhrchen
bleibt unbeimpft als Kontrolle.
Bebrütung: 24 - 48 Stunden (evtl. länger) bei 35 °C , dann in den Kühlschrank stellen!
Auswertung:
Wachsen Bakterien mit Gelatinasen auf einem Gelatinemedium, verliert dieses nach
einiger Zeit die Festigkeit, weil die Gelatine in ihre einzelnen Aminosäuren zerlegt wurde.
Daher gilt dieser Test als positiv, wenn das Medium auch nach dem Abkühlen im
Kühlschrank flüssig bleibt und als negativ, wenn es seine feste Konsistenz auch beim
Schräghalten des Röhrchens behält.
Bilden die 3 Stämme Gelatinasen? Wofür ist diese Eigenschaft von Bedeutung?
(Stammhaltung:
Stellen Sie von Ihren 3 Stämmen A, B, C einen Ausstrich auf DEV – Agar zur Stammhaltung
her!)
11

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
6.Gram-Färbung: der Stämme A, B, C
Wirkungsweise:
Anilinfarbstoffe werden in der Zellwand von Mikroorganismen bei nachfolgender
Jodeinwirkung zu einem Farbe-Jod-Komplex gebunden.
Bei grampositiven Mikroorganismen kann der Farbe-Jod-Komplex nicht mehr durch Entfärbemittel
wie Alkohol oder Aceton aus der Zelle gelöst werden. Die Zelle bleibt blauviolett
angefärbt.
Bei gramnegativen Mikroorganismen wird der Farbe-Jod-Komplex gelöst und die Zelle
durch Gegenfärbung rosa bis rot angefärbt.
Vorbereitung - Herstellung eines Ausstriches:
Auf einen sauberen (fettfreien) Objektträger wird ein sehr kleiner Tropfen Leitungswasser
aufgebracht (im Becherglas).
Mittels der ausgeglühten Impföse wird eine kleine Menge Koloniematerial im Tropfen
verstrichen.
Dann den Ausstrich lufttrocknen lassen (dauert ca. 10 min !, auf die Heizung legen)
Den getrockneten Ausstrich hitzefixieren, indem man den Ausstrich (Ausstrichseite
nach oben) dreimal langsam durch den oberen Teil der Bunsenbrennerflamme zieht.
Dazu Holzklammer benutzen! Danach erkalten lassen und färben.
Färbung:
1. Ausstrich mit einigen Tropfen Kristallviolett (Lsg. I) vollständig bedecken,
2. 2 min färben, abgießen
3. Reste kurz mit Lugols-Lösung (II) abspülen
4. Ausstrich völlig mit Lugols-Lsg. (II) bedecken und 5 min einwirken lassen
5. mit dest. Wasser etwa 5 sec. vorsichtig abspülen
6. Ausstrich mit Entfärbelösung (Ethanol, III) mittels Tropfpipette solange abspülen, bis
keine Farbwolken mehr abgehen und der Ausstrich graublau erscheint
7. mit dest. Wasser etwa 5 sec. vorsichtig abspülen
8. Ausstrich mit Safraninlösung (IV) bedecken , 1 min färben
9. mit dest. Wasser etwa 5 sec. vorsichtig abspülen
10.trocknen lassen, mikroskopieren: ohne Deckglas bei 40-Objektiv Bild einstellen
11.Objektiv wegdrehen, 1 Tropfen Immersionsöl auf beleuchtete Stelle im Ausstrich geben
12.Immersionsobjektiv (100x) in den Tropfen hineindrehen
Auswertung:
Welche gram-Reaktion zeigen die Zellen?
Zum Abschluss der Versuche 3 – 6: Stellen Sie in einer Tabelle alle untersuchten
Stoffwechselleistungen Ihrer 3 Stämme dar und beschreiben Sie wichtige Eigenschaften.
Versuch Stamm A Stamm B Stamm C
5.1.1 Teil B Celluloseabbau
5.2 Hemmung durch Aktinomyceten
5.3 Umsatz von Zuckern
5.4 Teil B Stärkeabbau
5.5 Teil B Fettabbau
5.6 Gelatineverflüssigung
6. Gram-Reaktion
12

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
7. Vergärbarkeit verschiedener Zucker durch Hefen
Vereinfachter Ablauf bei Einfachzuckern: C6H12O6 ���� 2 C2H5OH + 2 CO2
(12 enzymatisch katalysierte Teilschritte und ATP-Bildung)
Geräte und Materialien:
Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae)
verschiedene Zucker: Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Lactose
Hefeextrakt, Kaliumdihydrogenphosphat
Gärröhrchen (nach EINHORN)
Bechergläser, Meßzylinder, Pipetten
Durchführung:
Hefesuspensionen werden jeweils mit einem anderen Zucker versetzt. Der Ansatz wird
in ein Gärröhrchen gebracht. Die Vergärbarkeit des Zuckers wird durch die
CO2 – Bildung nachgewiesen und quantitativ erfaßt.
1. Herstellen der Gärlösung (Nährlösung ohne Zucker): 0,5 g Hefeextrakt + 0,5 g Kaliumdihydrogenphosphat
+ 100 ml Leitungswasser in einem 250 ml – Erlenmeyerkolben
ansetzen
2. Herstellen der Hefesuspension: 5 g Hefe zur Gärlösung (1) geben und ca. 5 min bei
150 U/min schütteln, bis die Hefe „gelöst“ ist
3. Bechergläser und Gärröhrchen beschriften
4. Zuckerlösungen in einem kleinen Becherglas herstellen:
1 g des Zuckers + 20 ml Wasser
5. in 5 weitere kleine Bechergläser je 10 ml Hefesuspension (2) pipettieren
5. 10 ml der betreffenden Zuckerlösung zusetzen � Ansatz mischen
6. Gärröhrchen mit dem Ansatz befüllen: Lösung in kugelförmigen Teil füllen, drehen
und klopfen, bis geschlossener Teil blasenfrei gefüllt ist
7. Kontrolle: Gärröhrchen mit 10 ml Hefesuspension + 10 ml Leitungswasser
8. Gärröhrchen bei 30 °C (Bruthaube) aufstellen und 1,5 h alle 10 min das entstehende
Gasvolumen ablesen
9. Mikroskopieren Sie die Hefe in den Ansätzen bei Beginn des Versuches und bei
einsetzender Gärung. Skizzieren Sie das mikroskopische Bild.
Auswertung:
- Welche Zucker kann Saccharomyces vergären, welche nicht (warum ) ?
- Tragen Sie die CO2-Bildung graphisch auf und berechnen Sie, wieviel Zucker im
Untersuchungszeitraum zu CO2 umgesetzt wurde!
13

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
8. Nachweis von Sporen
Grundlagen:
Unter den Bakterien sind Vertreter der Bacillaceae (Bac. subtilis, Bac. stearothermophilus
u.a.) in der Lage, z.B. bei Nährstoffmangel im Inneren ihrer Zellen dickwandige Sporen
als Überdauerungsformen zu differenzieren. Die Sporen zeichnen sich durch eine
hohe Thermoresistenz aus. Vertreter der Gattung werden genutzt, um Sterilisationsverfahren
auf ihre Wirksamkeit zu testen.
Material:
2 Kartoffelknollen
Messer
sterile Pinzette, sterile Petrischalen
Impfösen
Malachitgrün - Lösung
Safranin - Lösung
Arbeitsgang:
Kartoffel schälen, in Stücke schneiden und in Leitungswasser 15 Minuten kochen. Danach
das Kochwasser abgießen und die Stückchen mit einer sterilen Pinzette in eine
sterile Petrischale legen. Anschließend 2-3 Tage bei 30 °C bebrüten.
Die Erhitzung tötet alle vegetativen Zellen von Bakterien und Pilzen ab. Durch das
Schälen sind aber auch hitzeresistente Endosporen auf die Kartoffeln gelangt. Diese
bleiben keimungsfähig.
Färbung:
1. Ausstriche von älteren Zellen (Koloniemitte) und jüngeren Zellen (Kolonierand) herstellen,
trocknen lassen, hitzefixieren
2. Fixierte Organismen mit Malachtigrün - Lösung bedecken und den Farbstoff 10 Minuten
einwirken lassen
3. Überschüssige Farblösung mit Wasser abspülen
4. Safranin - Lösung auftropfen und 30 Sekunden einwirken lassen
5. Farblösung kurz abspülen
6. Das trockene Präparat bei 1000 - facher Vergrößerung (Immersion) mikroskopieren
Auswertung:
1. Prüfen Sie, ob Endosporen gebildet worden sind (Spore grün, Mutterzelle rot).
2. Vergleichen Sie beide Präparate hinsichtlich ihres Sporenanteils.
3. Charakterisieren Sie die Lage der Bacillus - Sporen (zentral, terminal, kellenförmig,
spindelförmig).
14

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
9. Isolierung von Thiobacillus thioparus (farblose schwefeloxidierende Bakterien)
(ver. nach: Bast, E.: Mikrobiologische Methoden)
Standorte:
Weit verbreitet an Standorten, an denen gleichzeitig molekularer Sauerstoff und reduzierte
anorganische Schwefelverbindungen (Schwefelwasserstoff, Elementarschwefel
oder Thiosulfat) zugegen sind: feuchte Böden, Schlamm, Grenzfläche zwischen (aerobem)
Süßwasser und seinen (anaeroben) Sedimenten, Kanalwasser, geschichtete
Seen.
Selektive Bedingungen:
- T. thioparus ist obligat chemolithoautotroph, daher wirken selektiv:
- Mineralsalzlösung ohne organische Verbindungen, mit Kohlendioxid als einziger
Kohlenstoffquelle
- Thiosulfat als einzige oxidierbare Substanz (Energie – und Elektronenquelle)
- pH – Wert im neutralen Bereich
- Bebrütung aerob und im Dunkeln
Nährlösung:
Das Medium enthält in 1000 ml Wasser:
- Na2S2O3 * 5 H2O 10,0 g
- KH2PO4 4,0 g
- K2HPO4 4,0 g
- MgSO4 * 7 H2O 0,8 g
- NH4Cl 0,4 g
- CaCl2 * 2 H2O 0,05 g
- Spurenelement- 1,0 ml
lösung
Die Nährlösung ist gut gepuffert, um die aus Thiosulfat gebildete Schwefelsäure abzufangen. Das
Wachstum von T. thioparus kommt bei pH 4,5 zum Stillstand.
Arbeitsgang:
- 25 ml Nährlösung in einen 250 ml – Erlenmeyerkolben füllen; die Dicke der Flüssigkeitsschicht
soll nicht mehr als 1 cm betragen. Die Nährlösung braucht nicht sterilisiert
zu werden.
- Nährlösung mit einigen Tropfen eines Gemisches aus frischem Teichwasser und
schwarzem Teichschlamm beimpfen.
- Kultur 14 Tage bei 28 – 30 °C im Dunkeln als Standk ultur bebrüten.
Auswertung:
T. thioparus scheidet bei der Oxidation von Thiosulfat vorübergehend elementaren
Schwefel in die Nährlösung aus. Man erkennt deshalb den Erfolg der Anreicherung an
einer kalkig – weißen Trübung der Nährlösung und einer Kahmhaut aus Schwefelschüppchen
und Zellen auf der Flüssigkeitsoberfläche.
Zellen: gramnegativ, klein und kurzstäbchenförmig : ca. 0,5 µm breit und 1,7 µm lang;
einzeln oder in Paaren, selten in kurzen Ketten; beweglich durch monopolare, monotriche
Begeißelung.
Die Nährlösung enthält auch heterotrophe Bakterien, die sich von den Ausscheidungsprodukten der Thiobacilli
ernähren.
15

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
10. Wirksamkeit verschiedener Desinfektionsmittel
Grundlagen:
Desinfektion bedeutet, daß Mikroorganismen auf / in totem oder lebendem Material
durch Behandlung mit keimvermindernden oder keimtötenden chemische Substanzen
in einen Zustand versetzt werden, in dem sie nicht mehr infizieren können. Die Beseitigung
aller pathogenen Mikroorganismen muß gewährleistet sein. Zur Desinfektion werden
geeignete chemische Substanzen eingesetzt. Die Wirkungsweise beruht auf:
− Oxidationsvorgängen innerhalb der Zelle ( z.B. durch Halogene, H2O2, Ozon),
− auf Zerstörung der Cytoplasmamembran ( Phenole, Alkohole, oberflächenaktive
Substanzen),
− oder auf Strukturveränderungen von Proteinen (Schwermetalle, Aldehyde)
Mittels Agar - Diffusionstest (Lochplattentest) kann die Wirkung von verschiedenen Desinfektionsmitteln
auf unterschiedliche Stämme getestet werden.
Material:
verschiedene Desinfektionsmittel (gebrauchsfertig) z.B. :1. Lyso AM - Flächendesinfektionsmittel
für Fußböden, 2. Lyso Rapid - Arbeitsflächen- und Gerätedesinfektion,
3. Mentex HD -Händedesinfektionsmittel, 4. 70 % - Ethanol – Arbeitsflächenreinigung,
5. Sprühdesinfektionsmittel für Laminarboxen, 6. Spülmittel-Lösung
sterile Pipetten, Spatel, Korkbohrer
3 Platten DEV - Nähragar
Übernachtkulturen von Bac. subtilis, E. coli, Micrococcus oder Stämme A, B, C in Flüssigkultur
Durchführung:
1. je eine Platte mit 0,1 ml Testorganismus beimpfen und mit Drigalsky - Spatel sorgfältig
ausplattieren
2. die Platten gut trocknen lassen
3. die Platten in 6 Sektoren teilen und in jeden mittels ausgeglühten Korkbohrer ein
Loch stanzen, Agar mittels Impfnadel aus den gestanzten Löchern heben
4. 0,1 ml eines Desinfektionsmittels in die Löcher pipettieren, vorher beschriften
5. die Proben werden 24 h bei 36 °C bebrütet
Auswertung:
Messen Sie den Hemmhofdurchmesser und stellen Sie in tabellarischer Form zusammen,
welches Desinfektionsmittel bei welchem Stamm Wirkung zeigt. ( - ... keine Wirkung,
+ ... schwache Wirkung, ++ ...gering gehemmtes Wachstum, +++ ... vollständig
gehemmtes Wachstum, 0 ... kein eindeutiges Ergebnis)
Desinfektionsmittel Stamm 1 Stamm 2 Stamm 3
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Dicke des Hemmhofes
s
0 mm: keine Wirkung
0-1 mm: schwache Wirkung
1-4 mm: mäßige Wirkung
>4 mm: starke Wirkung
16

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
Bewerten Sie die Wirkung auf die verschiedenen Stämme und schätzen Sie die generelle
Eignung der Desinfektionsmittel ein.
11. Wachstumskurve von Escherichia coli
Aufgabe:
Aufnahme einer Wachstumskurve von E. coli im Vollmedium (EC - Bouillon)
Pro Zeitpunkt wird die optische Dichte (OD) photometrisch gemessen, die Lebendzellzahl
mittels Plattenverfahren ermittelt und die Zellzahl mittels Thoma-Zählkammer bestimmt.
Material:
− Übernachtkultur E. coli, Kolben mit 100 ml steriler Nährlösung
− DEV - Nähragar - Platten
− sterile Geräte: Pipetten, Eppendorf-Hütchen als Verdünnungsröhrchen, Spatel
− steriles Wasser, dest. Wasser
− Photometer
− Thoma-Zählkammer
Durchführung:
Aus der Übernachtkultur 2 ml / 100 ml Medium animpfen, danach Nullprobe entnehmen.
Die Probenahme erfolgt nach folgendem Schema:
Uhrzeit Stunde
8.00 0
9.00 1
10.00 2
11.00 3
12.00 4
13.00 5
Zu jedem Zeitpunkt werden 3 ml Kulturflüssigkeit in ein steriles kleines Röhrchen pipettiert
und bei 600 nm gegen unbeimpfte Nährlösung als Nullwert vermessen.
Aus 0,1 ml Kulturflüssigkeit wird eine Verdünnungsreihe ( 0,9 ml steriles Wasser und
0,1 ml Lösung der höheren Konzentration) zur Zellzahlbestimmung angelegt. Die Zahl
der Verdünnungsstufen richtet sich nach der Versuchsdauer.:
Stunde Verdünnungen ausplattieren
0 - 2 10 -4 , 10 -5 , 10 -6
3 - 5 10 -5 , 10 -6 , 10 -7
Platten beimpfen: aus den angegebenen Verdünnungen je 0,1 ml auf einen Nährboden
pipettieren und ausspateln
Beschriftung: Gruppe, Verdünnungsstufe, Zeitpunkt
Bei 36 °C 48 Stunden inkubieren.
Auswertung von Plattentests:
Kolonien auszählen und Zahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) berechnen:
17

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
KBE = N N ... Kolonien pro Platte
f * V f .... Verdünnung, z.B. 1 / 10000
V ... ausgespateltes Volumen 0,1 ml
Hinweis: - nur die Platten auswerten, wo N = 20 .... 200 beträgt
- bei mehreren Verdünnungsstufen mit sinnvollem Ergebnis, Mittelwert bilden
Berechnung der Zellzahl der Thoma-Zählkammer:
Prinzip Thoma – Kammer: Der mittlere Steg wird mit 1-2 Tropfen gefüllt, dann das Deckglas aufgelegt. Je
nach Konzentration werden max. 256 Kleinquadrate gezählt.
Berechnung: Zellzahl = durchschnittliche Zahl pro Kleinquadrat * 4 * 10 6 [Zellen / ml]
Auswertung:
1. Darstellung und Erläuterung folgender Funktionen
OD = f ( t )
KBE = f ( t ) ; KBE = f (OD)
NThoma = f ( t )
NThoma = f ( OD )
2. Berechnung der Wachstumsrate für jede Stunde aus den Ergebnissen der Plattentests
und der Thomazählkammer
µ1 = ln KBE 1 - ln KBE 0 [ h -1 ]
t 1– t 0
µ2 = ln KBE 2 - ln KBE 1 [ h -1 ] usw.
t 2– t 1
Messwerte
Uhrzeit Stunde OD
bei 600 nm
8.00 0
9.00 1
10.00 2
11.00 3
12.00 4
13.00 5
Zellzahl
Thoma-
Zählkammer
Zellzahl nach Plattentest
Konz.1 / N Konz.2 / N Konz. 3 / N
18

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
12 . Bakteriologische Wasseruntersuchungen
Bakteriologische Wasseruntersuchungen sind für die Kontrolle der Einhaltung von Grenzwerten für verschiedene
Einsatzzwecke nötig. Diese sind in entsprechenden Verordnungen (Badegewässer-Richtlinie
und Trinkwasserverordnung) festgelegt.
Tab 1: EG-Richtlinie über die Qualität der Badegewässer vom 15.02.2006 (2006/7/EG)
Parameter Ausgezeichnete Gute Ausreichende Referenzanalyse-
Qualität Qualität Qualität methode 2
Escherichia
coli
(cfu/100 ml) 3
500 (95) 1 000 900 (90) ISO 7899-1:
(95)
MPN-Verfahren in
Mikrotiterplatten
ISO 7899-2:
Membranfiltration
Intestinale
Enterokokken 1
200 (95) 400 (95) 330 (90) ISO 9308-3:
MPN-Verfahren in
(cfu/100 ml)
Mikrotiterplatten
ISO 9308-1:
Membranfiltration
1 = Fäkalstreptokokken
2 Alternative Verfahren möglich, Gleichwertigkeit nachweisen!
3 cfu = colony formed units = KBE
(95) bzw. (90): Auf der Grundlage einer 95 - bzw. 90-Perzentil-Bewertung
Tab. 2: Grenzwerte nach Trinkwasserverordnung (Auszug) TrinkwV 2001
Koloniezahl bei
22°C
Koloniezahl bei
36°C
Allgemeine Anforderungen
an Wasser für
den menschlichen
Gebrauch
Anforderungen an Wasser für den
menschlichen Gebrauch, das zur Abfüllung
in Flaschen oder sonstige Behältnisse
zum Zwecke der Abgabe bestimmt
ist
Grenzwert Grenzwert
-
(≤ 100 / ml Richtwert
alte TWVO)
100 / ml
-
(≤ 100 / ml Richtwert
20 / ml
alte TWVO)
0 / 100 ml 0 / 250 ml
Coliforme Bakterien
E. coli 0 / 100 ml 0 / 250 ml
Aufgabe: Beurteilen Sie die Einhaltung der Grenzwerte der jeweiligen Verordnungen für verschiedene
Wässer!
Materialien:
Proben: mind. 1l Oberflächenwasser, Trinkwasser
Nährböden und –medien: 8 PC-Nähragar – Platten, 10 Fluorocult – Bouillon (Röhrchen), 1 Dip Stick Envirocheck-Contact-C,
1 ENDO-Nährkartonscheibe, 1 Azid-NKS
sterile Geräte: Flasche, Meßzylinder, Pipetten und –spitzen, Röhrchen, 2 Filtrationsgeräte, Pinzette
steriles Wasser, 100 ml Vollpipette, kleines Becherglas für DipStick-Test, Digalsky-Spatel
19

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
Durchführung
1. Oberflächenwasser
Stellen Sie eine Verdünnungsreihe aus dem Oberflächenwasser bis 10 –2 her. (9 ml steriles Wasser und 1
ml Probe bzw. vorhergehende Konzentration).
1.1 Ermitteln Sie Koloniezahlen (22°C, 36°C) durch das Plattenverfahren.
Beschriften Sie 3 Platten PC – Nährmedium: Name / Vers. 1.1 / 22°C / 10 0 (bzw. 10 –1 u. 10 –2 ).
Beschriften Sie 3 Platten PC – Nährmedium: Name / Vers. 1.1 / 36°C / 10 0 (bzw. 10 –1 u. 10 –2 ).
Beimpfen Sie die Platten mit je 0,1 ml der entsprechenden Konzentration und spateln Sie die Flüssigkeit
mittels Drigalsky – Spatel aus.
1.2 Bestimmen Sie Gesamtcoliforme und E. coli mittels MPN-Verfahren.
Je 3 Röhrchen Fluorocult – Bouillon mit 10 0 beschriften und mit je 1 ml dieser Konzentration beimpfen.
Mit den Konzentrationen 10 – 1 und 10 –2 genauso verfahren.
Ein 10. Röhrchen als Kontrolle aufstellen und mit 1 ml sterilem Wasser beimpfen.
1.3 Bestimmen Sie die Zahl der intestinalen Enterokokken mittels Filtrationsverfahren und Azid-
Agar-NKS
Beschriften Sie die Schale mit der Nährkartonscheibe (NKS: Azid-Agar nach SLANETZ und BARTLEY)
(Name, Vers. 1.3).
Pipettieren Sie ca. 3 ml steriles Wasser auf die Nährkartonscheibe, so dass diese gut angefeuchtet ist.
Legen Sie mit einer sterilen Pinzette einen sterilen Filter in das aufgeschraubte Filtrationsgerät ein und
bauen dieses wieder zusammen.
Entnehmen Sie mittels Vollpipette 100 ml Probe, pipettieren Sie diese in das Filtrationsgerät und filtrieren
Sie die Probe durch das Gerät. Nach dem Belüften („Abzug“ an Pumpe betätigen) wird mit etwas sterilem
LW gespült und wiederum filtriert. Nach erneutem Belüften wird der Filter entnommen und mit der karierten
Seite nach oben auf die NKS gelegt.
1.4 Verwenden Sie für weitere Bestimmungen das Dip-Stick-Verfahren:
Für Koloniezahlen, Gesamtcoliforme und E. coli: Envirocheck Contact C
Den Deckel des Röhrchens abschrauben und den Nährbodenträger entnehmen, ohne die Agarflächen zu
berühren.
Den Nährbodenträger 5 – 10 Sekunden in die Testflüssigkeit tauchen, so dass beide Agarflächen vollständig
benetzt sind. Überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen.
Den Nährbodenträger zurück in das Röhrchen geben und den Deckel zuschrauben, beschriften.
2. Trinkwasser
Entnehmen Sie mittels steriler Flasche ca. 400 ml Trinkwasser aus einem desinfizierten Wasserhahn.
(Nach DIN 38411 Teil 1 und DIN EN 25667 müssen Hähne abgeflammt werden. Hier: Desinfektion)
2.1 Ermitteln Sie Koloniezahlen (22°C, 36°C) durch das Filtrationsverfahren.
Beschriften Sie 2 PC-Platten: Name / Vers. 2.1. / 22°C bzw. 36 °C.
Legen Sie mit einer sterilen Pinzette einen sterilen Filter in das aufgeschraubte Filtrationsgerät ein und
bauen dieses wieder zusammen.
Messen Sie im Meßzylinder 100 ml Trinkwasser Ihrer Probe ab und pumpen Sie es durch das Gerät.
Nach dem Belüften („Abzug“ an Pumpe betätigen) wird der Filter entnommen und mit der karierten Seite
nach oben auf einen PC – Nährboden gelegt.
Für die 2. Inkubationstemperatur den gesamten Vorgang wiederholen.
2.2 Bestimmen Sie Gesamtcoliforme und E. coli mittels Filtrationsverfahren unter Verwendung einer
ENDO-Nährkartonscheibe.
Beschriften Sie die Schale mit der ENDO-Nährkartonscheibe (Name, Vers. 2.2.).
Pipettieren Sie ca. 3 ml steriles Wasser auf die Nährkartonscheibe, so daß diese gut angefeuchtet ist.
Filtrieren Sie 100 ml Trinkwasser (wie bei 2.1.) und legen Sie den Filter auf die Nährkartonscheibe.
Inkubation:
Koloniezahlen bei 22°C und 36 °C: 68 ± 4 h
Gesamtcoliforme, E. coli und int. Enterobakterien bei 36 °C: 24 bis max. 72 h
20

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
Auswertung:
1. Oberflächenwasser:
Berechnen Sie die Bakterienzahlen und beurteilen Sie die erzielten Ergebnisse. Entspricht das Gewässer
in allen Punkten der Badegewässer-Verordnung (Tab.1)? Diskutieren Sie mögliche Fehlerquellen.
zu 1.1.)
Ergebnis in KBE / ml angeben:
N..... Zahl pro Platte
f ..... Verdünnung, z.B. 10 -2
V .... Volumen (0,1 ml)
N
KBE = , Mittelwert der verwendeten Konzentrationen bilden
f * V
zu 1.2.)
Coliforme Bakterien: Die Anzahl gaspositiver Röhrchen pro Konzentration wird ermittelt und nach Tab. 3
das Ergebnis berechnet. Ergebnis: Anzahl / ml
E. coli: Durch Bestrahlung mit UV-Licht wird in den gaspositiven Röhrchen E. coli nachgewiesen. Zum
Vergleich immer die mitgeführte Kontrolle betrachten. Für die UV-positiven Röhrchen ebenfalls den MPN-
Wert nach Tab. 3 ermitteln. Ergebnis: Anzahl/ ml
zu 1.3.)
Zählen Sie die Anzahl der Kolonien (Enterokokken sind braunrot, bis 1mm Durchmesser) auf dem Filter.
Ergebnis: cfu/ 100 ml
zu 1.4.)
Den Envirocheck – Nährbodenträger mit der Auswertetafel vergleichen (s. Abb. 1), ohne die Kolonien zu
zählen. (semiquantitatives Ergebnis, KBE / ml)
Envirocheck Contact C:
Seite 1: Plate – Count - Agar zur Bestimmung der Koloniezahl (bei 36 °C)
Seite 2: Chromocult – Coliformen – Agar: dunkelblaue bis violette Kolonien: E. coli
rosa bis rote Kolonien: Coliforme Bakterien
Vergleichen Sie die Ergebnisse mit denen von 1.1 und 1.2!
2. Trinkwasser:
Berechnen Sie die Bakterienzahlen und beurteilen Sie die erzielten Ergebnisse. Entspricht das Gewässer
in allen Punkten der TrinkwV (Tab. 2)? Diskutieren Sie mögliche Fehlerquellen.
zu 2.1.)
Ermitteln Sie die KBE durch Auszählen der Kolonien auf den Filtern. Das Ergebnis bezieht sich auf die
filtrierte Menge, also 100 ml.
Begründen Sie Unterschiede der Bakterienzahlen bei unterschiedlichen Bebrütungstemperaturen.
zu 2.2.)
Zählen Sie rosa - rote Kolonien als Gesamtcoliforme Bakterien und grünmetallisch glänzende Kolonien
als E. coli aus. Das Ergebnis bezieht sich auf die filtrierte Menge, also 100 ml.
21

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
Tab. 3: Die „wahrscheinliche Keimzahl“ (most probable number) bei drei aufeinanderfolgenden
Dezimalverdünnungen und drei Parallelröhrchen pro Verdünnungsstufe
(nach BAST: Mikrobiologische Methoden, 1999)
Zahl der positiven Röhrchen Verdünnungsstufe
MPN pro ml der Verdün-
- x
nung 10
Kategorie 1) ≥ 95% Konfidenzintervall
10 – x 10 – (x+1) 10 – (x+2) µu µo
3 3 3 > 110
3 3 2 110 1 20 400
3 3 1 46 1 9 198
3 3 0 24 1 4 99
3 2 2 21 2 3 40
3 2 1 15 1 3 38
3 2 0 9,3 1 1,8 36
3 1 1 7,5 1 1,7 19,9
3 1 0 4,3 1 0,9 18,1
3 0 1 3,8 1 0,9 10,4
3 0 0 2,3 1 0,5 9,4
2 2 0 2,1 1 0,5 4,0
2 1 1 2,0 2 0,5 3,8
2 1 0 1,5 1 0,4 3,8
2 0 1 1,4 2 0,4 3,5
2 0 0 0,9 1 0,2 3,5
1 2 0 1,1 2 0,4 3,5
1 1 0 0,74 1 0,13 2,0
1 0 1 0,72 2 0,12 1,7
1 0 0 0,36 1 0,02 1,7
0 1 1 0,30 2 0,01 1,0
0 0 0 < 0,3 0,00 0,94
1) Die Tabelle enthält die mit einer Gesamtwahrscheinlichkeit von 99 % vorkommenden Röhrchenkombinationen. Andere Kombinationen
dürfen wegen ihrer geringen Wahrscheinlichkeit (zusammen nur 1 %) nicht benutzt werden.
Kategorie 1 umfaßt die wahrscheinlichsten, in 95 % aller Fälle auftretenden,
Kategorie 2 enthält die in nur 4 % aller Fälle auftretenden Röhrchenkombinationen, solche Ergebnisse sollte man nicht als
Grundlage wichtiger Entscheidungen verwenden.
Die angegebenen MPN-Werte beziehen sich auf die niedrigste der ausgewählten Verdünnungsstufen (10 – x ). Um die MPN pro ml
oder g der unverdünnten Originalprobe zu erhalten, multipliziert man den Wert mit dem Verdünnungsfaktor 10 x .
Abb. 1: Auswertung Envirocheck Contact C
22

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
Versuch 13: Ermittlung der Luftkeimbelastung mittels Luftkeimsammler
Prinzip:
Im Luftkeimsammler wird ein definiertes Luftvolumen über eine rotierende Agarplatte
geleitet. Die sedimentierenden Bakterien oder Pilze (bzw. Sporen) können dadurch
quantitativ erfasst werden.
Gesetzliche Regelungen:
Bestimmte MO (Cladosporum spp.) können bei erhöhter Konzentration bei empfindlichen
Personen Allergien, z.B. Asthma, auslösen Nach Gefahrstoffverordnung existieren
z.Z. keine biologischen Grenzwerte (BGW) für Bakterien und Pilze in der Raumluft.
Die Baubiologischen Richtwerte beschreiben folgende Größenordnungen für eine Sporenbelastung
von Wohn- und Schlafbereichen:
< 200 KBE / m³ : keine Anomalie
< 500 KBE / m³ : schwache Anomalie, langfristiger Handlungsbedarf
500 - 1000 KBE / m³ : starke Anomalie, Handlungsbedarf
> 1000 KBE / m³ . extreme Anomalie, sofortiger Sanierungsbedarf
Als technischer Kontrollwert (TKW) gilt für Arbeiter in biologischen Abfallbehandlungsanlagen
eine Konzentration von < 50.000 KBE / m³ (mesophile Schimmelpilze).
Geräte und Materialien:
Spin Air Luftkeimsammler Firma IUL
PC-Platten
Würze-Platten
Hinweis zur Messung:
- Fenster 12 h vor Messung geschlossen
halten
- Messung in Höhe > 1 m über Boden
- Wenn erforderlich, Außenluftmessung
als Vergleich
Durchführung:
Wählen Sie die gewünschten Parameter aus: Untersuchungsvolumen, Volumenstrom,
Umdrehungsgeschwindigkeit. Untersuchen Sie in 3 verschiedenen Räumen die Bakterienzahl
(PC-Agar) und die Pilz- (Sporen)zahl (Würzeagar).
Bebrütung: 7 Tage bei 25 °C
Auswertung:
Zählen Sie die KBE / Platte aus und tragen Sie die Ergebnisse für alle Räume in die
Tabelle ein. Berechnen Sie den jeweiligen Mittelwert (KBE / m³). Besteht in den unter-
23

Studiengang Ingenieurökologie Praktikum Umweltbiotechnologie Dr. Uta Langheinrich
suchten Räumen eine erhöhte Bakterien- bzw. Pilzkonzentration? Bitte auch weitere
Recherchen zu Grenzwerten usw. durchführen.
Raum 1: Volumenstrom = 100 l/min, Umdrehung: 2 rpm
KBE KBE
Bakterien 300 l Pilze 300 l
500 l 500 l
800 l 800 l
Mittelwert:
KBE / m³
Mittelwert:
KBE / m³
Raum 2: Volumenstrom = 100 l/min, Umdrehung: 2 rpm
KBE KBE
Bakterien 300 l Pilze 300 l
500 l 500 l
800 l 800 l
Mittelwert:
KBE / m³
Mittelwert:
KBE / m³
Raum 3: Volumenstrom = 100 l/min, Umdrehung: 2 rpm
KBE KBE
Bakterien 300 l Pilze 300 l
500 l 500 l
800 l 800 l
Mittelwert:
KBE / m³
Mittelwert:
KBE / m³
24