HPLC für Neueinsteiger - bei NOVIA

Was ist überhaupt HPLC?HPLCTrennungs-;mobile Phase,stationärePhaseIn den 60er Jahren datieren die Anfänge der HPLC, High PressureLiquid Chromatography (Hochdruck(flüssigkeits)chromatographie).Dank der verbesserten Säulenmaterialien und Geräten ist seit Endeder 70erJahre die Rede von High Performance LiquidChromatography (Hochleistungs(flüssigkeits)chromatographie). DenBoom erlebte diese Trenntechnik Anfang der 80er Jahre.Die HPLC ist eine schnelle Trenntechnik. Dabei wird das zutrennende Gemisch mit Hilfe eines Lösungsmittels oderLösungsmittelgemisches (Eluent/Mobile Phase) zur Säulegebracht. Das ist ein Rohr, meist aus rostfreiem Stahl, das mit derso genannten stationären Phase gefüllt ist. Die stationäre Phase(sie wandert im Gegensatz zur mobilen Phase nicht, deswegen„stationär“) besteht meist aus Kieselgel an dessen Oberflächebestimmte Gruppen gebunden sein können. Diese Gruppenfungieren als „Austauschplätze“ für die zu trennenden Substanzen.Je nach Art der Substanz wird sie unterschiedlich lang festgehalten.Durch verschiedene Trennmechanismen, bedingt durch die auf demKieselgel gebundenen Gruppen, findet so die Trennung derSubstanzen des zu untersuchenden Gemisches statt. Abhängig vonder Probe kommt als Mechanismus z. B. Adsorption durch Van derVaals-Kräfte, Ionenaustausch, Ausschluss in die Frage. DieProbensubstanzen werden – hoffentlich – unterschiedlich lang amSäulenmaterial festgehalten und verlassen die Säule nachunterschiedlichen Zeiten. Die Trennung kann durch den Einsatzverschiedener stationärer Phasen (Säulenmaterialien sieheAbschnitt 12) und Lösungsmittelgemische beeinflusst werden. Dieeinzelnen Probekomponenten werden anschließlich vom Detektorregistriert, er gibt diese Informationen an die Auswerteinhalte weiter,das Ergebnis ist ein Chromatogramm. Die Anzahl der Peaksentspricht der Anzahl der aufgetrennten Probekomponenten, dieFläche ist deren Menge proportional.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 4

Aus welchen Teilen besteht eine HPLC-Anlage?Aufbau einerHPLC-AnlageSie besteht aus 5 Modulen:• Eine oder mehrere Pumpen zur Förderung des Eluenten durchdie Anlage,• Injektor (Hand- oder Autoinjektor) mit Hilfe dessen die Probe indie Anlage gelangt• Säule an der die Trennung stattfindet,• Detektor zur Registrierung der Probenkomponenten,• Rechner zum Steuern der Anlage und als Auswerteeinheit© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 5

Wie funktionieren die einzelnen Teile einer HPLC-Anlage?PumpeInjektorDas Lösungsmittel bzw. Laufmittelgemisch wird aus einemVorratsgefäß angesaugt und gelangt durch ein Einlassventil in denKolbenraum der Pumpe. Der Kolben komprimiert den Eluenten unddrückt ihn durch das Auslassventil in den Teil der HPLC-Anlage, dieden Injekor, die Säule und den Detektor enthält. Eine Pumpe enthältoft zwei Kolben (Doppelkolbenpumpe). Während der eine dasLaufmittel ansaugt, drückt der zweite Kolben das zuvor angesaugteLaufmittel durch das Auslassventil in die HPLC-Anlage. DieserVorgang wird mittels modernster Mechanik und Elektronik exaktgesteuert, sodass ein konstanter Fluss möglichst ohneDruckveränderungen gewährleistet wird. Vor Verlassen der Pumpewird das Laufmittel noch durch einen Druckaufnehmer geleitet. Dortwird der Druck gemessen. Der Druckbereich variiert je nach Säuleund eingesetztem Laufmittel von 50 bis 350 bar (70 bar= 1000 PSI).In Spezialfällen (dünne Säulen, kleines Säulenmaterial) kann dieserDruckbereich aber auch überschritten werden. Dieser Druck solltebei Betrieb im Auge behalten werden, da durch ihn indirektVerstopfungen, Flussschwankungen oder Leckagen erkannt werdenkönnen.Mittels des Injektors wird die Probe in die HPLC-Anlageeingebracht. Er befindet sich im Eluentenstrom direkt hinter derPumpe. Die Probe muss dabei mit „Normaldruck“ in denDruckbereich der Anlage gebracht werden. Der am häufigsteneingesetzte Handinjektor ist das so genannte Rheodyneventil. Es istim Prinzip ein Sechswegeventil. An zwei Einlässen ist eine Schleifeangebracht. Sie kann zum einem eine fest definierte Menge (meist10 oder 20 µl) fassen und wird mit der Probe überfüllt, oder man gibtmit einer exakten Spritze definierte Probenvolumina in die Schleife.Durch umlegen eines Hebels wird der Eluentenstrom durch dieAufgabeschleife geleitet und spült so die Probe auf die Säule.Bei einem Autoinjektor ist dieser Vorgang automatisiert. Wie dasgenau geschieht unterscheidet sich allerdings von Hersteller zuHersteller.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 6

UV-DetektorFestwellendetektorVariablerDetektorPDA/DADDer am häufigsten in der HPLC eingesetzte Detektor ist der UV-Detektor. Die Einsatzgebiete reichen von Applikationen in derPharmaindustrie, über die klinische Chemie, Lebensmittelchemie,Umweltanalytik bis hin zur Biochemie.Arbeitsweise:UV Licht einer bestimmten Wellenlänge wird in eineDurchflussküvette eingestrahlt und dahinter auf einer Photodiodewieder aufgefangen und als elektrisches Signal ausgegeben. DerLichtstrahl wird durch Spiegel durch die Messküvette und eineVergleichsküvette gelenkt. Eluent und Probe absorbieren das Lichtunterschiedlich, das ergibt ein sich veränderndes elektrischesSignal. Diese Differenz wird als Peak angezeigt. Aus diesen Peakssetzt sich das entstehende Chromatogramm zusammen. Je nachUV-Absorptionsverhalten (chromophore Gruppe) der Probe wird dieWellenlänge des eingestrahlten Lichtes ausgewählt.Den UV-Detektor gibt es in vielen Ausführungen: Festwellendetektor:Als Lichtquelle wird meist eine Quecksilberlampe, seltener aucheine Zink- oder Kadmiumlampe eingesetzt. Die für die jeweiligeApplikation benötigte Wellenlänge wird mittels geeigneter Filtereingestellt. Die gebräuchlichste Wellenlänge ist hierbei 254 nm,da die Quecksilberlampe hier ein sehr intensives Maximum hat,was eine sehr gute Nachweisgrenze bedingt. Dank seiner hohenEmpfindlichkeit bei dieser Standardwellenlänge eignet sich dieseForm des Detektors besonders für Arbeiten im Spurenbereich.Ansonsten wird er kaum noch eingesetzt. Variabler Detektor:Die Lichtquelle hierbei ist eine Deuteriumlampe. Nur wird hier diegewünschte Wellenlänge mit einem optischen Gitter aus demKontinuum gefiltert. Der variable UV-Detektor kann alsStandarddetektor für einen Großteil der HPLC-Anwendungenangesehen werden. Photodiodenarraydetektor (PDA oder DAD)Die Lichtquelle ist auch hierbei eine Deuteriumlampe. Aber hierwird keine einzelne Wellenlänge herausgefiltert, sondern dergesamte Wellenlängenbereich (oder ein vom Anwender zubestimmender Bereich) wird durch die Messküvette geschickt.Im Gegensatz zu den „normalen“ UV-Detektoren wird dasgesamte aus der Küvette austretende Licht nicht durch eineeinzelne Diode aufgefangen, sondern von einer ganzen Reihevon Photodioden (die Anzahl unterscheidet sich bei denverschiedenen Herstellern). Das Licht wird nach Verlassen derDurchflussküvette mit Hilfe eines Gitters so aufgespalten, dassnur ein oder genau definierte Wellenlängenbereiche auf einePhotodiode fallen. Nach wiederum fest definierter Zeit (meisteinstellbar, im Millisekundenbereich) werden die Diodenausgelesen und die Daten gespeichert. Es entsteht so übereinen Wellenlängenbereich ein dreidimensionalesChromatogramm.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 7

Brechungsindexdetektor(RI)FluoreszenzdetektorElektrochemischerDetektor(ECD)Für Substanzen, die keine UV-Absorption zeigen, wie z. B. füraliphatische Polymere, wird dieser Detektor eingesetzt. Er misst denUnterschied des Brechungsindexes zwischen reinem Laufmittel undmit Probe vermischtem Laufmittel. Die Lichtquelle ist auch hier eineHalogenlampe. In eine Vergleichsküvette wird reines Laufmittelgespült. Durch die Messküvette wird der Eluentenstrom geleitet. MitHilfe eines Spiegelsystems wird der Lichtstrahl abwechselnd durchdie Vergleichsküvette und die Messküvette geleitet. Befindet sichProbe im Eluentenstrom ändert sich der Brechungsindex desLaufmittel/Probegemischs. Dieses wird registriert. So entstehthierbei das Chromatogramm. Das Haupteinsatzgebiet diesesDetektors ist in der Polymerchemie, Mineralöl- und Zuckeranalytikzu finden.Dieser Detektor nützt die Fähigkeit bestimmter Substanzen undVerbindungen aus, Fluoreszenzsignale auszusenden. Abhängig vonder zu detektierenden Verbindung wird mit einer bestimmtenWellenlänge eingestrahlt, die die Verbindung zur Fluoreszenzanregt. Die eingestrahlte Wellenlänge wird mit Hilfe von Filtern odereinem Gitter aus einem Lichtkontinuum (welche Lampe eingesetztwird ist abhängig von der benötigten Wellenlänge) herausgefiltert.Ein bekanntes Einsatzgebiet des Fluoreszenzdetektors ist dieBestimmung von PAK’s. Er wird auch oft nachNachsäulenreaktionen (z. B. Aminosäuren-Bestimmung) eingesetzt.Bei dieser Variante von Detektor handelt es sich um eine Rarität.Durch Anlegen eines Potentials werden hierbei dieProblemkomponenten oxidiert oder in Ausnahmefällen auchreduziert. Die Veränderung des Potentials zeigt dann dieAnwesenheit einer Problemkomponente an. Das Einsatzgebietdieses Detektors findet sich hauptsächlich in der klinischen Chemie,z. B. zur Bestimmung der Katecholamine.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 8

Der Aufbau einer GesamtanlagemodulareAnlageHerstellerabhängig sind die HPLC-Anlagen unterschiedlichaufgebaut. Zu Beginn der HPLC gab es meist modulare Anlagen.Bei dieser Bauweise sind Pumpe, Injektor, Detektor als einzelneGeräte hintereinander angeordnet.Kompaktgerät Eine weitere Möglichkeit besteht darin die einzelnen Bestandteileeiner HPLC-Anlage in einem Gerät unterzubringen. Dann sprichtman von einer Kompaktanlage. Diese sind in letzter Zeit etwasbeliebter geworden.Neben den rein bautechnischen Unterschieden einer HPLC-Anlagemuss man noch Unterschiede in der Arbeitsweise beachten.IsokratischeHPLC-AnlageGradientNiederdruckgradientHochdruckgradientMan unterscheidet hierbei zwischen isokratischen und GradientenBetrieb einer Anlage.Bei einer isokratischen Anlage wird während eines HPLC-Laufesnur mit einer Zusammensetzung des Eluenten gearbeitet. D. h. dieWechselwirkung zwischen Laufmittel und stationärer Phase ist überdie gesamte Zeit der Trennung konstant. Man kann damit vor allemähnliche Substanzen gut trennen. Diese Art der Durchführung ist vorallem in der Routine besonders robust und sollte, so es möglich ist,für alle Trennaufgaben angestrebt werden. Ein weiterer Vorteil ist,dass man für diese Arbeitsweise nur eine Pumpe zurEluentenförderung benötigt.Bei einer Gradiententrennung wird die Zusammensetzung desEluenten kontinuierlich über die Zeit geändert. Man erreicht so einepermanente Verstärkung der Wechselwirkung zwischen Eluent undstationärer Phase. Die Probesubstanzen werden so schneller vonden Austauschplätzen an der stationären Phase verdrängt. Man istdamit in der Lage auch Substanzkomponenten sehrunterschiedlicher Polarität noch in akzeptabler Zeit zu trennen. Dabei dieser Arbeitsweise am Anfang einer Trennung eine andereZusammensetzung des Eluenten vorliegt als am Ende muss manstets darauf achten, dass am Anfang einer Trennung das System imGleichgewicht ist (=Equilibrierung)Die Mischung des Laufmittels kann gerätetechnisch aufverschiedene Arten durchgeführt werden.a) Die Mischung der verschiedenen Eluenten wird durch einProportionierventil vor einer Pumpe durchgeführt, die Mischungmit einer Pumpe durch die Anlage gefördert. Man spricht dannvon einem Niederdruckgradienten. (Die Mischung geschieht aufder Normaldruck- oder Niederdruckseite der Anlage, also vor derPumpe.)b) Jeder Eluent wird von einer Pumpe gefördert und die Mischungerfolgt auf der Druckseite der Anlage. Eine Mischkammer stehtdafür zur Verfügung. Eine solche Anlage wird alsHochdruckgradient bezeichnet.Wieso „Druck“?Bei der Förderung des Eluenten durch die HPLC-Anlage baut sichDruck auf. Den Hauptanteil bewirkt hierbei die Säule. Abhängig vomSäulenmaterial, dessen Größe und Form, der Säulenlänge und deseingesetzten Eluenten (unterschiedliche Viskosität) ergeben sich© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 9

SäuleDetektorProbeaufgabesystemAuswertesystemqualitativeAnalysequantitativeAnalyseDrücke von 50 bis ca. 350 bar.Das Probeaufgabesystem kann entweder ein Handinjektor odermanuelles Ventil (meist von der Firma Rheodyne) oder einautomatischer Probengeber (Autosampler) sein.In der Abfolge kommt dann die Säule, das Herzstück der Aufgabe,an der die Trennung nach verschiedenen Mechanismen stattfindet.Die Säulen können mit den unterschiedlichsten Materialien gefülltsein. Die Art der stationären Phase wird nach dem von Ihnen zubearbeitenden Trennproblem ausgesucht. Möglicherweise arbeitenSie mit einer „C 18 -Säule“. Die stationäre Phase ist in diesem Fall einchemisch modifiziertes Kieselgel. Hierbei sind auf der Oberflächedes Kieselgels C 18 -Ketten aufgebaut.Es sollte immer eine konstante Temperatur gewährleistet sein, umreproduzierbare Ergebnissen zu erhalten.Als Detektor finden Sie meist einen UV Detektor vor, manchmal inder Variante eines Diodenarray Detektors (DAD oder PDA). InAbschnitt 2 finden Sie eine Auflistung der gebräuchlichstenDetektoren und die Grundsätze deren Arbeitsweise.Als Auswertesystem steht heute meist ein Rechner mitentsprechender Software hinter der Anlage, Integratoren gehören zuder älteren Generation der Auswertesysteme. Führen Sie einequalitative Analyse durch, so müssen Sie „nur“ alle Peaks(=Substanzen), die in Ihrer Probe enthalten sind, trennen. Soll einequantitative Analyse durchgeführt werden, muss mit Hilfe vonStandards die genaue Konzentration bzw. Menge der einzelnen inder Probe vorliegenden Substanzen bestimmt werden. DieAuswertung wird meist über die Fläche, selten über die Höhe derPeaks durchgeführt.Neben seiner Aufgabe als Auswertegerät steuert der Rechner oftauch die gesamte Anlage, angefangen von den Pumpen, über denProbengeber bis zum Detektor und evtl. andere Peripheriegerätewie Fraktionssammler und Säulenofen.Für weitergehende Informationen und Übungenbieten wir Ihnengerne unsere Seminare „HPLC-Basiskurs“ und „HPLC-Fortgeschrittenenkurs“ an.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 10

Notwendige Arbeiten vor den MessungenVerkabelungeiner HPLC-AnlageKapillarenVerbindungsstückeBevor man nun eine erste Messung starten kann, müssen einigegrundsätzliche Arbeiten durchgeführt werden. Das Gerät sollte aneinem Ort aufgestellt sein, an dem es auch leicht von hintenzugänglich ist. Die elektrische Verkabelung der einzelnen Moduleuntereinander sollte an beiden Enden der Kabel beschriftet werden,so dass bei späteren eventuell nötigen Umbauten ein problemloserZusammenbau möglich ist. Ändern Sie vorerst nichts an diesenVerbindungen! Grundsätzlich sollten Sie die elektrischeVerkabelung im Auge behalten, es können sich schon malVerbindungen lockern und so zu Wackelkontakten oderTotalausfällen führen („Spikes“ oder Geisterpeaks).Der Eluent wird von Kapillaren von einem Modul zum nächstengeführt. Sie können aus Stahl oder PEEK (Polyetheretherketon)sein. Der Innendurchmesser dieser Kapillaren sollte zwischenPumpe und Injektor 0,5 – 1 mm betragen, ab Ausgang Injektor nurnoch maximal 0,2 mm. Manche Detektoren, wie z. B.Fluoreszenzdetektoren, benötigen zum problemlosen Arbeiten einengewissen Rückdruck. Dieser wird durch eine dem Detektornachgeschaltete Kapillare mit 0,1 oder 0,2 mm Innendurchmesseraufgebaut. Dadurch bleiben evtl. vorhandene Luftbläschen imEluenten, die Chromatographie bleibt ohne störende Luftpeaks. Dasist die so genannte Restriktorkapillare oder Restriktor.Die Verbindungsstücke, Ferrules und Fittings, sollten alle von einemHersteller stammen, da die verschiedenen Marken sich dochgeringfügig in den Dimensionen unterscheiden können. Das führt zukleinen Totvolumina, die die gewünschte Trennung unnötigverschlechtern. Grundsätzlich muss dazu betont werden, dass mannur mit „Gefühl“ Verschraubungen anziehen soll, da sonst dasGewinde abbrechen kann und dann nach Murphy’s Gesetz imDetektor stecken bleibt. Wenn Sie schon Gewalt anwendenmüssen, um ein Leck abzudichten, dann bitte nur sanfte Gewalt.Jetzt kann’s endlich losgehen …, oder doch noch nicht?Zustand einerHPLC-AnlageSäubern/SpülenAls erstes muss sichergestellt werden, dass die Anlage sauber ist.Folgende Fragen dazu: Hat jemand vor Ihnen mit der HPLC-Anlagegearbeitet, wenn ja, mit welchem Lösungsmitteln, hat er eine Säuleim System gelassen, oder sie ausgebaut?Wenn Sie nicht wissen was vor Ihnen mit der Anlage geschehen ist,sollten Sie diese ohne Säule mit einer 50/50 Mischung ausIsopropanol(IsoOH)/Wasser bei einem Fluss von 1 ml/min für ca. 10min spülen. Dabei sollten Sie einige Male auch den Eluenteninjizieren, um sicherzustellen, dass auch kein alter Eluent mehr imProbeaufgabesystem ist. Jetzt können Sie den in Ihrer Methodevorgeschriebenen Eluenten in die Anlage bringen.Nachfolgend werden die wichtigsten HPLC-Tätigkeiten etwasgenauer beschrieben, für den Fall, dass Sie keinerlei Beschreibungzur Hand haben. Ansonsten gilt generell folgende Prämisse: Wenn© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 11

Sie nach einer existierenden Methode arbeiten müssen, halten Siezunächst stur an der Beschreibung fest!!! Ihre Kreativität undExperimentierfreude können im HPLC-Labor von unschätzbaremNutzen sein, aber bitte, alles zu seiner Zeit.Welche Säule? Welche Säule muss ich in die HPLC-Anlage einbauen?ReversedPhaseNormal PhaseDie zu verwendende Säule steht sicherlich in der Beschreibung dervon Ihnen zu bearbeitenden Methode. Steht Ihnen diese Hilfe nichtzur Verfügung, s. Kapitel „Bezeichnung von HPLC Materialien“. Dasam häufigsten verwendete Säulenmaterial (stationäre Phase) ist mitC 18 modifiziertes Kieselgel. Man spricht dann von Reversed Phase-Chromatographie. Die hierbei am meisten verwendeten Eluentensind Mischungen aus Wasser und Methanol bzw. Acetonitril. Hinzukommen oft Additiva (=Zusätze) oder Puffer.Müssen Sie auf Grund Ihrer Probe nichtmodifizierts Kieselgel alsSäulenmaterial einsetzen, so arbeiten Sie mit „Normal Phase". Dasist allerdings nur in ca. 5 – 10% der Routinemethoden der Fall. Diewichtigsten Eluenten sind hier Hexan und Heptan mitentsprechenden Mischungen und Additiva. Was andereTrennmechanismen betrifft, seien hier nur einige Namen erwähnt:Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie,Ausschlusschromatographie.Herstellung Wie stelle ich den Eluenten her?des Laufmittels(Eluent) Welche Eluenten Sie brauchen, steht in Ihrer Methode. Auch welcheChemikalien und welche hochreinen Lösungsmittel Sie zu seinerHerstellung verwenden müssen. Die Bezeichnung solcherLösungsmittel ist meist „HPLC-grade“. Sie sind von verschiedenenFirmen erhältlich, wie z. B. Baker, Merck, Promochem, Riedel deHaen, usw.Elutionskraft In der HPLC werden verschiedene Eluenten eingesetzt, um die(siehe Anhang) Stärke der Wechselwirkung zwischen Probe und stationärer Phasebeeinflussen zu können. Ist die Elutionskraft eines Eluenten stärker,kommen die Peaks der zu trennenden Substanzen früher. In derReversed Phase Chromatographie nimmt die Stärke eines Eluentenvon Wasser über Methanol, Acetonitril, THF zu. Die Eluenten solltenSie immer auf die gleiche Art und Weise herstellen. Wenn in IhrerVorschrift nicht genau steht, wie Sie den Eluenten herstellenmüssen, dann achten Sie dabei bitte bei der Herstellung eines RP-Eluenten auf folgende Reihenfolge:Fließschema:Pufferherstellung• Den Puffer (p. a. Qualität) in der gewünschten Konzentrationherstellen (den Messkolben noch nicht auffüllen),• den pH-Wert einstellen (Achtung: nur zwischen pH 2 und 8, dabei höheren pH-Werten sich das Säulengrundmaterial auflöstund im stark Sauren sich die Bindungen zwischen Basismaterialund C 18 Kette lösen.• Messkolben genau auffüllen,• Puffer in einem Messzylinder in der gewünschten Menge© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 12

abfüllen,• Methanol bzw. Acetonitril in einem anderen Messkolbenabmessen,• erst dann mischen.EntgasenDiese Vorgehensweise garantiert, dass Sie Ihre Eluenten immerreproduzierbar herstellen und keine Probleme mit derVolumenkontraktion bekommen. Eluenten sollten immer ingenügender Menge (ca. 1 Liter) hergestellt und entgast werden. DasEntgasen ist mit Helium möglich oder durch den in die HPLC-Anlage eingebauten Degasser. Wenn Sie Puffer einsetzen, solltenSie diese membranfiltrieren. Das Vorratsgefäß sollte gut abgedecktsein, um nicht als Falle für im Raum vorhandenen „Dreck“ zufungieren.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 13

Die erste MessungEquilibrierenProbenvorbereitungStandardchromatogrammSequenzNachdem Sie Ihre Anlage, wie beschrieben, vorbereitet haben, kannIhr Eluent an Ihre Anlage angeschlossen werden. Jetzt müssen SieIhrer Anlage etwas Zeit lassen, ins Gleichgewicht zu kommen(equilibrieren). Dabei werden noch von der Herstellung der Säulevorhandene Verunreinigungen ausgespült, auch sonstiger „Dreck“verlässt die Anlage. Während dieser Zeit können Sie Ihre Probenvorbereiten. Wenn Sie Glück haben, müssen Sie diese nur imEluenten lösen, ansonsten müssen Sie die in Ihrer Methodebeschriebene Prozedur möglicherweise im Eluenten wieder ausfällt.Sollte das nämlich in der Anlage passieren, dann haben Sie eineWeile mit deren Reinigung zu tun oder müssen sogar teure Teileauswechseln.In der Zwischenzeit ist Ihr System equilibriert. Die hierfür benötigteZeit bewegt sich zwischen einigen Minuten (einfache Analyse, z. B.UV-Detektion) und einigen Stunden (Spurenanalyse, z. B.elektrochemischer Detektor). Um zu testen, ob die gesamte Anlagevoll funktionsfähig ist, injizieren Sie am besten eine Standardlösung.Diese ist in der Regel vorgegeben, falls nicht, nehmen Sie eineMischung aus Nitromethan, Crysen, Perylen. (Säule: C 18 , Eluent:MeOH/H 2 O, 50/50 v/v). Betrachten Sie nun das Chromatogramm.Ist die Basislinie ruhig, zeigt sich keine Drift, sind die Peakssymmetrisch und sieht das Chromatogramm nach der nochmaligenInjektion genauso wie bei der ersten aus, dann können Sie davonausgehen, dass Ihr Gesamtsystem in Ordnung ist.Aber jetzt geht’s los.Gemäß der vorliegenden Vorschrift injizieren Sie jetzt, nach einerbestimmten Reihenfolge („Sequenz“), Vergleichsproblem, Probenund Standards und werten die sich ergebenden Chromatogrammeaus. Nehmen Sie sich Zeit, wenn Ihre Methode einenGradientenlauf enthält. Ein neuer Lauf sollte frühestens erst nach 5– 10 min gestartet werden. Sie sichern so, dass Ihr System bei jederInjektion im Gleichgewicht ist.Müssen Sie eine neue RP-Säule einsetzen, so spülen Sie diese vordem ersten Einsatz mit Methanol oder Acetonitril. Beachten Sie bittedabei, dass Ihre Anlage pufferfrei ist. Am Besten, Sie spülen dieAnlage erst mit einem Isopropanol/Wassergemisch und stellen dannauf Methanol um. Genauso verfahren Sie, wenn Sie wieder zu IhrenOriginalbedingungen zurückkehren wollen.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 14

Verlassen einer HPLC AnlageEnde einerMessserieEluentenKreislaufStilllegen einerHPLC-AnlageZum Schluss geben wir Ihnen noch einige Tipps für das richtigeVerlassen einer Anlage:1. Wenn Sie wissen, dass Sie am nächsten Tag weiterarbeiten, istes am sinnvollsten, dass Sie alle Geräte bis auf die Pumpeausstellen, evtl. muss der PC auch eingeschaltet bleiben. DiePumpe lassen Sie bei einem kleinen Fluss von 0,1 bis 0,3ml/min weiterlaufen. Dabei sollten Sie für genügend Eluentsorgen, damit die Anlage nicht trockenläuft, oder noch besserden Eluenten im Kreislauf pumpen. D. h. Sie führen dieAuslasskapillare des Detektors in das Vorratsgefäß zurück. Amnächsten Morgen müssen Sie nur Ihren Fluss einstellen undkönnen mit der Arbeit beginnen.2. Möchten Sie Ihre Anlage für längere Zeit stilllegen, so spülenSie – bei Bedarf – zuerst mit Wasser Ihren Puffer aus dergesamten Anlage, anschließend spülen Sie mit ca. 20-30 mlMethanol oder Acetonitril. Jetzt können Sie die Säuleausbauen, mit Endstücken verschließen, damit sie nichtaustrocknet, und unter diesem Lösungsmittel längere Zeitlagern.Damit Sie das Wichtigste auf einen Blick haben, folgt eineCheckliste „Was muss ich vor Beginn der Messung beachten?“ undein Fließschema „Wie fange ich die Arbeit mit einem HPLC-Gerätan?“ Vielleicht sind bei Ihnen zusätzliche, andere Schrittenotwendig. Fügen Sie diese in die zwei Schemata ein odermodifizieren Sie diese einfach. Vielleicht hat Ihr(e) Vorgänger(in)diese Schritte irgendwo schriftlich festgehalten. Entwickeln Sie Ihreeigenen Arbeitshilfen, mit denen Sie sich sicher fühlen. Bereits nachkurzer Zeit werden diese Schritte für Sie zur Selbstverständlichkeit.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 15

Checkliste für die RP-HPLCWas muss ich vor Beginn der Messung beachten?Elektrische VerkabelungKapillarenSchläuche undEluentengefäßePumpenEluentInjektor• Hat sich nichts gelockert?• Tropft es irgendwo?• Luftblasen aus den Einlassschläuchen entfernen,indem man das Lösungsmittel mit einer Spritzeansaugt, dabei „Purgeventil“ öffnen.• Abdeckbares Eluentengefäß verwenden, damitnichts hineinfallen kann und die Verdunstung desEluenten minimiert wird.• Pumpe einschalten und einen Blick auf dasAbfallgefäß werfen. Tropft es dort hinein? Wenndies nicht der Fall ist, überprüfen Sie, ob derEluent durch den Einlassschlauch fließt.Häufigste Ursache für fehlenden Fluss ist Luft inder Pumpe.• Tropft es irgendwo oder ist es feucht (Dichtstellenanfassen), sieht man Kristallablagerungen beipufferhaltigen Eluenten? Sind diePumpengeräusche die gewohnten?• Immer mit HPLC-grade Lösungsmittel ansetzen.• Genügende Menge vorbereiten.• Pufferkonzentrationen sollten in der Regelzwischen 20 und 50 mMol liegen.• Eluenten mit Puffer immer membranfiltrieren, mitHelium entgasen oder Degasser verwenden.• Möglichst keine aggressiven Komponenten (z. B.Trichloressigsäure) dem Eluenten zusetzen.• Beim manuellen Injektor sicherstellen, dass einGefäß unter dem Überlauf steht.Injektionsspritzen sauber halten, umKontaminationen zu vermeiden, ggf. mit Iso-OHspülen.• Bei manchen Probengebern (Autosampler) musseine Waschflüssigkeit angeschlossen sein. BeiRP-Trennungen am besten 10 – 20 % Methanolin das Wasser zusetzen, um Pilzwachstum zuverhindern.Säule • Immer nach einem konstanten Schemaeinfahren.Detektor• Wenn Sie mit einem UV-Detektor arbeiten,© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 16

kontrollieren Sie, ob die Lampe genügendEnergie hat. Beachten Sie dabei dieHerstellerangaben.AbfallAuswerteeinheit• Genügend großes Auffanggefäß bereitstellen.• Sind die eingestellten Integrationsparmeter sowieDatenaufnahmegeräte (sample-rate) OK?© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 17

Checkliste:Das muss ich immer machenArbeitsweise konstant haltenVom Einschalten des Gerätes bis zum Ausschalten,immer alles gleich machen, bzw. Änderungennotieren.z. B.:• Eluent gleich ansetzen (zuerst das Wasser, dannden organischen Anteil).• Säule gleich anfahren, auch Reihenfolge undKonzentration streng beachten.• „Gleiche“ Chemikalien verwenden (gleich heißt indiesem Fall: Hersteller, Qualität, Charge usw.,auch auf eingesetztes Spülmittel, Wasserachten).• Bei Änderungen alles notieren.Puffer filtrieren immer die gleichen Filter verwenden (sieheHerstellung eines Eluenten)Eluent entgasen(siehe Herstellung eines Eluenten)Diagnostik-Werte überprüfen In Geräte eingebaute Diagnosemöglichkeitennutzen, überprüfen ob sie in Ordnung sind(festgelegte Werte)Häufiges Überprüfen derAnlage aufFunktionstüchtigkeitAm einfachsten durch Vergleichschromatogramm© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 18

Checkliste:Das darf ich nie tunDruck über 400 bar Es können Leckagen entstehen, diePackungsqualität kann nachlassen.Puffer in der Anlage stehenlassenVerschraubungen (Fittings) zufest anziehenZu schnell reagierenReversed Phase Säulen inWasser lagernSalze können ausfallen, Verstopfung der AnlageFittings können abbrechenkein Aktionismus, erst mal Gleichgewicht einstellenlassen und sich folgende Frage stellen:- Habe ich irgendetwas – auch eine winzigeKleinigkeit – anders gemacht?- Ist das Problem wiederholbar?- Was und warum kann ich etwas definitivausschließen?In folgender Reihenfolge aktiv werden:- Problem einkreisen, fragen, reagieren.-Bakterienwachstum© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 19

Fließschema:Wie wird eine HPLC-Anlage in Betrieb genommen?Zuerst checken, in welchem Zustand das System ist.Ist der für Ihre Methode geeignete Eluent schon eingefahren (unten), muss dasSystem auf die gewünschte Methode umgestellt werden? Oder ist Ihnendiesbezüglich nichts bekannt?Spülen Sie im letztgenannten Fall die Anlage mit einem Gemisch aus Wasser undIsopropanol bei ausgebauter Säule, dabei machen Sie nichts Verkehrtes. DannWasser/Methanol- oder Acetonitrilgemisch (je ca. 10 ml) einfahren, von dieserMischung auf Ihren benötigten Eluenten übergehen. Wenn Sie mit organischenLösungsmitteln arbeiten werden, ist ein Zwischenspülschritt mit Methanol undMethylenchlorid notwendig. Vorsicht: Bei Puffern nie direkt auf reines organischesLösungsmittel umstellen – oder umgekehrt! Ansonsten fällt das Puffersalz aus und eskommt zu Verstopfungen in der Anlage.Falls die Anlage umgefahren werden muss, zuerst den im System vorhandenenEluenten ausspülen. Ist es Puffer, mit Wasser spülen, ansonsten GemischWasser/Methanol oder Wasser/Acetonitril.Benötigte Säule einbauen.Ist es eine neue RP-Säule mit Methanol konditioniert? Enthält Ihr Eluent Puffer,wieder zuerst ein Wasser/Methanol oder Wasser/Acetonitril-Gemisch durch dieAnlage pumpen, erst dann kommt der Eluent.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 20

Falls Ihr System einsatzbereit war, können Sie hier weitermachen.Benötigte Eluenten nach Vorschrift vorbereiten, bei Puffer membranfiltrieren,entgasen an den Einlassschlauch der Pumpe anschließen, evtl. vorhandeneLuftblasen mit Spritze ansaugen oder „purgen“.Kontrollieren, ob Abfallgefäß hinter dem Detektor vorhanden ist. Beim Injektor prüfen,ob Abfallgefäß unter dem Überlauf steht, bei automatischem Probengeber – fallserforderlich – Spülflüssigkeit anschließen.Die Geräte in der Reihenfolge Pumpe, Injektor, Detektor, Auswerteeinheitanschalten.Pumpe immer in 0,2 ml/min-Schritten auf gewünschten Fluss bringen.Sich Zeit lassen, damit die Säule ins Gleichgewicht kommen kann. In derZwischenzeit die Proben vorbereiten. Testen, ob beim Mischen von Eluent undgelöster Probe etwas ausfällt. Wenn ja, versuchen, die Probe anders zu lösen.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 21

Ist alles in Ordnung, können Sie jetzt einen Standard injizieren. Stimmt das sichergebende Chromatogramm mit einem Vergleichschromatogramm überein, stimmenPeakhöhe und Retentionszeit, so ist Ihr System in Ordnung und Sie können mit IhrenMessungen beginnen.Möchten Sie Ihre Arbeit für heute beenden, am nächsten Tag aber weiterarbeiten,lassen Sie den Eluenten bei niedrigem Fluss, ca. 0,2 ml/min, im Kreislauf laufen.Schalten Sie alle Geräte bis auf die Pumpe aus.Möchten Sie das System längere Zeit nicht verwenden, spülen Sie den verwendetenEluenten aus dem System. Ist es Puffer, zuerst mit Wasser und dann mit Methanoloder Acetonitril je ca. 20 – 30 ml. Bauen Sie die Säule aus und schreiben Sie dieBedingungen auf, wie sie behandelt wurde.Schalten Sie die Geräte in der Reihenfolge Auswerteeinheit, Detektor, Injektor,Pumpe aus. Beim Ausschalten der Pumpe gehen Sie wieder in 0,2 ml-Schritten nachunten.© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 22

Bezeichnung von HPLC-MaterialienBei etlichen Säulenmaterialien kann man deren Eigenschaften schon denBezeichnungen entnehmen. Dagegen gibt es auch pfiffige Namenskreationen, dienichts über Eigenschaften und Spezifikationen verraten.Es gibt Materialbezeichnungen ohne jegliche Informationen, z. B. INTERCHROM,ASAHIPAK und andere, die doch etwas über sich aussagen: z. B. LiChrospher,Intertil. Dieses Thema kann hier zwar nicht ausführlich behandelt werden abernachfolgend finden Sie hoffentlich einige Hilfen für sich. Aufgeführt sind Zahlen,Buchstaben, Silben, Präfixe, Suffixes aus der Säulenbezeichnung, die einigeHinweise geben.Zur Bezeichnung von HPLC-MaterialienAus den Namen des Materials……die InformationNatur des Füllmaterials- Sil, Si, Silica, -spher, -sorb Kieselgel- Alox, A, Alumina Aluminiumoxid- HP, HA Hydroxylaptit- CEL Cellulose- GEL Polymer- Silica „B“ Kieselgel nach einem neueren Verfahrenhergestellt und im Vergleich zu einemSilica „A“ ohneMetallionenkontamination.Physikalische Eigenschaften desFüllmaterials- spher rundes (sphärisches) Material- sorb irreguläres (gebrochenes,unregelmäßiges) Material- WP Wide Pore, z. B. 300 ÅPorendurchmesser- NPB, NPR Non porous beads bzw. resins: Nichtporöses Material100, 120, 300, 1000, 4000 Eine große Zahl: Porenweite(Durchmesser der Materialteilchen),wichtig bei der Trennung großer Moleküle3, 5, 10 Eine kleine Zahl: Korngröße, z. B. 5µmmittlerer TeilchendurchmesserModifizierte MaterialienRP XOD(S), C 18 , RP 18, 18ODS I, II, III (oder 1, 2, 3)Reversed Phase, x=2,8,18: Länge derAlkylketteOctadecylsilan: C 18 -AlkylketteWie bei den Autos sind das die“Nachfolgemodelle” des Materials. Leiderist keine Systematik in der Bezeichnungzu finden: Manchmal ist „II“ endcapped© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 23

OS, C 8APS, NH, NH 2 , Aminound „I“ nicht, manchmal ist „II“ besserendcapped als „I“, ein anderes Maldoppelt endcapped und ein anderes Malwiederum wurde das Verfahren für dieModifizierung des Kieselgels verbessert(„endcapped“, s. Tipp Nr. 3)Octasilan, C 8 -AlkylketteAminopropylsilica, Modifizierung mit einer(CH 2 ) 3 NH 2 -GruppePH, Phenylgruppee, E „endcapped“: nachsilanisiertes RP-MaterialEignung für ein bestimmtes Trennproblem- Sugarpac für Zuckertrennungen- TSKgel DNA-NPR für DNA-Fragmente und Nukleinsäuren- PepMAP C 18 für PeptideFolgende Buchstabenreihenfolgen weisen auf Ionenaustauschersäulen hin:AX, SAX, WAX, SCX, WCX, SC, CX,IEC, IEXstrong anion exchanger,weak cation exchanger,ion exchange chromatographyion exchanger usw.Namen von besonders behandelten Materialien; geeignet zur Trennung vonbasischen Substanzen:Beispiele:InertsilSymmetrySelect Bdeactivated phase-pur, purospher„shield“SBSPABBDS„Inert gegen Basen“,„liefert symmetrische Peaks“,„trennt Basen“,„deaktivierte Phase“,(keine Metallionen vorhanden)Besonders saubere Phase (auch hierkeine Metallionen)„geschützt“ („Schutzgruppe“ an derAlkylkette, damit sind Rest-Silanol-Gruppen geschützt)Stable Bond (stabil gebunden)Sterically Protected (sterisch geschützt)Acid Bases (für Säulen und Basengeeignet)Based Deacivated Silica (für Basen nichtaktiv, also geeignet)Sollten Sie tatsächlich mehr über Ihre Säule erfahren wollen, rufen Sie bei IhremLieferanten an.Angenommen, Ihr Gesprächspartner kennt sich aus, versuchen Sie es nach demHHH-Prinzip (höfliche Hartnäckigkeit hilft), durch Ihren Charme, durch ein© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 24

interessantes Gespräch auf wissenschaftlicher Basis, oder durch den direktenHinweis auf Ihre bereits jetzt beträchtlichen und vor allem zukünftigen Umsätze. VielErfolg!© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 25

Abkürzungen aus dem Bereich der Chromatographie(Auswahl)AbkürzungACCCCE(C)ECCIACLCCZEFIAFPLCGCGFCGLCGPCI(L)CIECBegriff (Englisch bzw. Deutsch)Affinity Chromatography(Affinitätschromatographie)Computational Chromatography(Computerchromatographie oder Computergraphie)Capillary Electrophoresis(Kapillarelektrophorese)Capillary Electrochromatography(Kapillarelektorchromatographie)Capillary Ion Analysis(Kapillar-Ionen-Analyse)Capillary Liquid Chromatography(Kapillar-LC)Chiral Liquid Chromatography(Chiral LC)Capillary Zone Electrophoresis(Kapillarzonenelektorphorese)Flow-Injection Analysis(Fließ-Injektions-Analyse)Fast Protein Liquid ChromatographyGas Chromatography(Gaschromatographie)Gel Filtration Chromatography(Gelfiltrationschromatographie)Gas-Liquid ChromatographyGas-Flüssig-ChromatographieGel Permeation Chromatographie(Gelpermeationschromatographie)Ion (Liquid) Chromatography(Ionenchromatographie)Ion Exchange Chromatography(Ionenaustauschchromatographie)© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 26

IPCLCLC-MS/LC-ESI-MSNPCPICRPCSECSFCSFESPESPMEIon Pair Chromatography(Ionen paar-Chromatographie)Liquid Chromatography(Flüssigkeitschromatographie)Liquid Chromatography Mass Spectrometry/ LiquidChromatography Electrospray Interface Mass Spectrometry(HPLC-Massenspektrometrie-Kopplung mit einemElektrospray Interface)Normal Phase Chromatography(Normalphasen-Chromatographie oderAdsorptionschromatographie)Paired Ion Chromatography(Ionenpaarchromatographie)Reversed Phase Chromatography(Umkehrphasenchromatographie)Size Exclusion Chromatography(Ausschluss-Chromatographie)Supercritical Fluid Chromatography(Überkritische Chromatographie)Supercritical Fluid Extraction(Überkritische Extraktion)Solid Phase Extraction(Festphasenextraktion)Solid Phase Micro Extraction(Mikrofestphasenextraction)© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 27

Von IUPAC empfohlene Symbole für die Chromatographie (Auswahl)Im Jahre 1993 erschienen in Pure & Appl. Chem., Vol 65, No. 4, pp. 819-872Empfehlungen von der IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)zur „Nomenklatur für die Chromatographie“. Der Artikel über 53 Seiten ist ebenfallsim „ChromBook“ der Fa. Merck, Darmstadt, nachzulesen. Dieser enthält Definitionen,Symbole, Begriffe und Erläuterungen zur Chromatographie. Nachfolgend sind diewichtigsten Größen mit dem entsprechenden Symbol zusammengestellt.Größe englische Bezeichnung SymbolTrennfaktor separation factor (Bis 1993: Selektivitätsfaktor selectivity factor )Fläche area ADurchmesser diameter dDiffussionskoeffizient diffusion coefficient DFlussrate flow rate (volumetric) FBodenhöhe plate height HViskosität ciscosity Gleichgewichts (Verteilungs-) equilibrium (distribution) coefficient Kkonstante (Koeffizient)Retentionsfaktor retention factor k(Bis 1993: Kapazitätsfaktor capacity factor k’)Länge length LBodenzahl plate number NDichte density Druck pressure prelativer Druck pressure, relative PRadius radius rTemperatur temperature (absolute) TZeit time tlineare Geschwindigkeit velocity (linear) u(Retentions) Volumen volume VMasse (Gewicht) mass (weight) WPeakbreite peak width w© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 28

Lösungsmittelgemische gleicher Elutionsstärke für dieRP-Chromatographie (nach L. Snyder)Mit Hilfe folgender Tabelle können Sie Mischungen gleicher Elutionsstärke herstellen.Z. B. könne Sie mit den Mischungen 50/50 MeOH/H 2 O, 40/60 ACN/H 2 O und 30/70THF/H 2 O ungefähr die gleiche Retentionszeit erwarten – wenn keine spezifischenWechselwirkungen stattfinden. Weiterhin ist folgende Faustregel ersichtlich: Eine 10%ige Änderung des organischen Anteils im Eluenten führt zu einer Veränderung derk-Werte – und der Retentionszeiten – um Faktor 2 – 3. Dies erlaubt einigeVorhersagen bei Optimierungsversuchen.MeOH/H 2 O ACN/H 2 O THF/H 2 O k0 0 0 10010 6 4 4020 14 10 1630 22 17 640 32 23 2,550 40 30 160 50 37 0,470 60 45 0,280 73 53 0,0690 8 63 0,03100 100 72 0,01© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 29

Lehrbücher über HPLCReihenfolge nach ErscheinungsjahrR. E. Kaiser/E. Oeleich: Optimierung in der HPLCAlfred-Hüthig-Verlag, 1979, ISBN 3-7785-0594-7C. Gertz: HPLC-Tipps und TricksLCD Analytical GmbH, 1989, zu beziehen bei dem Autor:Dr. Christian Gertz, Schmalenbeckstr. 1 c, 58093 HagenN. Vonk, B. G. I. Baars,H. Schnaller:Troubleshooting in der HPLC – Fehlersuche in der HPLCBirkhäuser Verlag, 1990, ISBN 3-527-28195-9G. Aced, H. I. Möckel: Liquidchromatography (Deutsch)VCH Weinheim, 1991, ISBN 3-527-28195-9V. Meyer: (1) Praxis der HochleistungsflüssigkeitschromatographieDiesterweg Salle Verlag, 7. Auflage, 1992,ISBN 3-7935-5452-XW. Gottwald: (1) RP-HPLC für AnwenderVCH Weinheim, 1993, ISBN 3-527-28518-0K. K. Unger: Handbuch der HPLC, Teil 1GIT Verlag, 2. Auflage, 1995, ISBN 3-92886519-6S. Lindsay: Einführung in die HPLCVerlag Vieweg, 1996, ISBN 3-528-06759-4(aus dem Englischen übersetzt von Stefan Lamotte undManfred Treitz)Merck KGaAChromatographieChronologie einer AnalysenthechnikGIT Verlag, 1996, ISBN 3-928865-21-8V. Meyer: (2) Fallstricke und Fehlerquellen in der HPLC in BildernAlfred Hüthig Verlag, 1996, ISBN: 3-7785-2417-8S. Kromidas (2) HPLC TippsHoppenstedt Verlag, 1997, ISBNG. J. Eppert FlüssigchromatographieHPLC – Theorie und PraxisVerlag Vieweg, 1997, ISBN 3-528-06770-5(1) für Grundlagen(2) Tipps für die Praxis© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 30

Empfehlenswertes Wörterbuch:H. P. Angelé Dictionary of Chromatography (English, German, French,Russian), Alfred Hüthig Verlag, 1984,ISBN 3-7785-0926-8Aus der Fülle der in Englisch erschienenen HPLC-Bücher seien folgende dreiherausgegriffen:L. R. Snyder, I. I.Kirkland:J. W. Dolan, L. R.Snyder:Introduction to Modern Liquid ChromatographyWiley-Interscience, 1988Troubleshooting LC SystemsHumana Press 1989U. Neue: “HPLC columns”Wiley-Interscience, 1997© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 31

Adressen von HPLC-Firmen(Deutschland)Firma Anschrift Telefon FaxAbimed AnalysentechnikGmbHPostfach 88 11 1140736 LanenfeldAlltech GmbH Münchner Str. 1482008 UnterhachingenAmicon GmbH Königsholz 7558453 WittenApplied Biosystems Brunennweg 13GmbH64331 WeiterstadtAxel Semrau GmbH Stefansbeck 42& Co.45549 SprockhövelIndustrievertretung Hochgernstr. 12Michael Baumann 84403 DorfenLC Tech-Chromatographiebai GmbH Heimrodstr. 1064625 BensheimBeckmann Frankfurter Ring 115Instruments GmbHBesta Technik fürChromatographieGmbH80807 MünchenHöhenstr. 3569259 WilhelmsfeldBio-Rad GmbH Heidemannstr. 16480939 MünchenBischoff AnalysentechnikHöhenstr. 35GmbH 69259 WilhelmsfeldBodenseewerk Postfach 10 17 61Perkin-Elmer 88647 ÜberlingenChrompack GmbH Berner Str. 5360437 FrankfurtChromtech GmbH Buchwiese 365510 IdsteinConchrom GmbH & Möckernstr. 10Co. KG28201 BremenCS-ChromatographieAm Wehebach 26Service GmbH 52379 LangweheDeutsche Metrohm In den Birken 3GmbH & Co. 70772 FilderstadtDionex GmbH Am Wörtzgarten 1065510 IdsteinERC GmbH Dahlienweg 693087 AlteglofsheimGAT Gamma Friedhofstr. 26Analysetechnik 27576 BremerhavenGrom GmbH Herrenberger Str. 5471083 Herrenberg02173-8905-0 8905-77089-615250-0 615250-1902302-96060-0 80090506150-1010 101-10102339-6037-0 603008081-4920 499006251-76076 76010089-3887-0 3887-49006220-7017 7019089-31884-0 3188410006220-7017 701707551-810 1612069-500019-0 500019-5006126-16861686oder – 16510421-6440673 644067402423-2001 20040711-77088-0 77088-5506126-991-0 991-27709543-8277 88200471-9089-0 89099007032-73261 76115© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 32

Gynkotek HPLC Landsberger Str. 6582110 GermeringenHamiltonPostfach 11 05 65Deutschland GmbH 64220 DarmstadtHewlett Packard Hewlett-Packard-Str. 8GmbH76337 WaldbronnICT Internationale Norsk-Data-Str. 3Chemie Technik 61352 Bad HomburgGmbHJasco GmbH Robert-Borsch-Str. 1164823 Groß-Umstadt089-849370 849-377706151-9802-0 89173307243-602-0602-2120180-5326244 0180-31614406172-94680 94689906078-74949 74006Knauer GmbH 14163 Berlin 030-81608-0 8015010Kontron Instruments Werner-von-Siemens-Str. 1 08165-922-0 922-307GmbH85375 NeufahrnKronlabDörntelsberg 5a07261-64993 3387Chromatographie 74889 SinsheimKupferAn der Tuchleiche 19 06157-7858 7858Chromatographie 64319 PfungstadtLATEK Labortechnik Lilienthalstr. 1306221-760097 76647969214 EppelheimMacherey-Nagel Postfach 10 13 25 02421-969-0 969-199GmbH & Co. KG 52313 DürenDr. A. Maisch / High Pfalzgrafenring 19 07073-50357 4216Performance LC 72119 AmmerbuchMedChrom Im Breitspiel 1106221-315577 35722069126 HeidelbergMerck GHaA Frankfurter Str. 280 06151-781339 72749564293 DarmstadtMolnar InstitutChromatographietechnikGmbHSchneeglöckchenstr. 4710407 Berlin030-4215590 421559-99Muder & WocheleChroamographietechnikGmbHChromatographieHandel MüllerGmbHWiesenweg 11 a10365 BerlinHaag 583413 FridolfingMZ-AnalysentechnikGmbHWöhlerstr. 2 – 655120 MainzNOVIA GmbH Industriepark HöchstGeb. B 84565926 FrankfurtOmniChrom Alte Reisfelder Str. 646514 SchermbeckPharmacia Biotech Munzinger Str. 9Europe GmbH 79111 FreiburgPolymer Standards Wöhlerstr. 4Service GmbH 55120 MainzSchambeck SFD Rhöndorfer Str. 51GmbH53604 Bad Honnef030-5577270 5577278808685-313 740706131-686619 625143069-305-43843 9754-1502856-845 10080761-4903-308 4903-30906131-96239-0 96239-1102224-92396 923936© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 33

SEPSERVSeperaton ServiceBerlinShimadzu EuropaGmbHSigma AldrichChemie GmbHHelmholtzstr. 2 – 910587 BerlinAlbert-Hahn-Str. 647269 DuisburgGrünwalderweg 3082041 DeisenhofenSunChrom GmbH Max-Planck-Str. 2261381 FriedrichsdorfSupelco s. SigmaAlldrichSykam GmbH Talhofstr. 3282203 GilchingTECHLAB GmbH Ecessener Str. 238173 ErkerodeThermo Seperation Boschring 12Products GmbH 63329 EgelsbachTosoHaas GmbH Zettachring 670567 StuttgartVarian GmbH Alsfelder Str. 664229 DarmstadtVDS optilabChromatographietechnikGmbHGraf von Zeppelin Str. 556410 Montabaur030-3930991 39349250203-7687 766625089-6513-1350 6513-139806172-7004 589508105-8003 2326205305-930203 93020806103-408-0 408-2220711-13257-0 13257-8906151-703-0 703-23702602-917224 917225Wicom Bürstadt 06206-79970 79975Waters GmbH Hauptstr. 8706196-400600 48238865760 EschbornYMC Europe GmbH Alte Raesfelder Str. 6 02856-845 188146514 SchermbeckZiemer Klaus GmbH Pommernstr. 960621-709034 70936468309 MannheimZinsser AnalyticGmbHEschborner Landstr. 13560489 Frankfurt069-789106-0 78910680© by NOVIA, Alle Rechte bei NOVIA GmbH 34