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Strahleninduzierte Apoptosebei ESRT im MausmodellDie Apoptose ist von vielen ineinandergreifenden Mechanismen abhängig, in deren Regulationsmittelpunkt die Caspasenals ausführende Cysteinproteasen stehen. Klinische Erfolge der extrakraniellen stereotaktischen Radiotherapie (ESRT)führen zur Fragestellung, ob Nekrose und / oder Apoptoseprozesse dafür ursächlich gemacht werden können.Henning Eggert 1 , Iris Ernst 1 , Burkhard Greve 2 , Tobias Bölling 1 , Tilmann Spieker 3 ,Stefan Könemann 1 , Klaus Kopka 4 , Michael Schäfers 4 , Otmar Schober 4 , Normann Willich 1 , Burkhard Riemann 41 Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie – Radioonkologie, Universitätsklinik Münster, 2 Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie – Radioonkologie, Abt. für Strahlenbiologie, UniversitätsklinikMünster, 3 Gerhard – Domagk – Institut für Pathologie, Universitätsklinik Münster, 4 Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin, Universitätsklinik Münster

Material und MethodenEs wurden Tumorzelllinien des papillären humanen (K1) und des anaplastischenhumanen Schilddrüsenkarzinoms (CAL-62) verwendet und nach einer Konfluenzvon 80-90% zur s.c. Applikation in 1 ml Spritzen überführt. 2 CD-1® Nude Mäusewurden zunächst in einem Vorversuch in drei Fraktionen mit einer Dosis von 3 x12,5 Gy innerhalb einer Woche am CO-60-Gerät partiell bestrahlt und 8 Wochenhinsichtlich der Toxizität dokumentiert. Nach Abschluss dieser Phase wurde 9BALB/C ® Nude Mäuse wie im Vorversuch in drei Fraktionen mit 3x 12,5 Gy amCO-60 bestrahlt. Es konnte im Versuchverlauf gezeigt werden, dass BALB/C ®Nude Mäuse bei s.c. Injektion in die Vorderflanke in Hinblick auf dasTumorwachstum der verwendeten Tumorzelllinien besser ansprechen, als die zuvorverwendeten CD-1® Nude Mäuse.In den Folgeversuchen wurden 20 Tage vor der ersten Radiatio jeweils 5 BALB/C ®Nude Mäuse pro Zelllinie Tumorzellen in die Vorderflanken appliziert, anschließenderfolgte die Radiatio in oben genannter Dosierung. Am Tag 3 nach der letztenApplikation wurden die Tiere getötet und das Gewebe gewonnen. Zur Darstellungder Caspase-3 im Kleintier-PET/CT wird ein F-18-Isatin-Tracer benutzt. InVorversuchen wurde die Apoptose über eine Sub G1/G0-Peak Analyse imDurchflusszytometer untersucht, bei der die fragmentierte DNA erfasst wird. Eserfolgte die histologische Aufarbeitung der Gewebeproben mit der TUNEL-Färbung(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling), umnekrotische und apoptotische Zellen zu identifizieren. Mit dieser Methode lassensich die durch Nukleasen entstandenen DNA-Strangbrüche und die somit freien 3'-OH-Gruppen mit TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) aufgrund derFluoreszenz sichtbar machen.Papilläre Schildrüsenkarzinom-Zellen 400 fache VergrößerungBALB/c ® Mäuse im Planungsaufbauvor HochdosisbestrahlungZur quantitativen Analyse der Gewebeproben wurden die Zellkerne mit DAPI (4´,6-Diamidin-2´-phenylindol-dihydrochlorid) eingefärbt und die Gesamtzahl der Kerneermittelt. Anschließend wurde die Gesamtzahl der TUNEL-positiven Zellkerneautomatisiert ausgezählt und mit der Gesamtzahl der DAPI gefärbten Kerneverglichen. Das Ergebnis konnte im Anschluss als prozentualer Anteil an TUNELpositivenKernen ausgegeben werden.DAPI Färbung

ErgebnisseAlle Tiere tolerierten die Radiatio sehr gut, es kam nur zugeringfügigen und kurzeitigen strahlentypischen Reaktionen. Diebisherigen Ergebnisse lassen vermuten, dass es bei ESRT in denZellen zu einer Apoptose kommt. Bei der histologischenAufarbeitung konnten in der TUNEL-Färbung apoptotische Zellennachgewiesen werden.Im Vergleich zwischen bestrahlten Tumoren und nicht bestrahltenTumoren konnte in der TUNEL-Färbung in der anschließendenAnalyse am Lichtmikroskop gezeigt werden, dass bei denbestrahlten Tumoren mehr TUNEL-positive Zellen sichtbar waren,als bei den nicht bestrahlten Tumoren. Die darauf folgendeautomatisierte Auswertung der TUNEL-Färbungen konnte dasvorherige Ergebnis am Lichtmikroskop bestätigten. Tumore, die miteiner Gesamtdosis von 37,5 Gy bestrahlt wurden, wiesen imVerhältniss zu nicht bestrahlten Tumoren einen höheren Anteil anTUNEL-positiven Zellen auf.TUNEL-Färbung eines papillären Schilddrüsenkarzinomsnach RadiatioBei bestrahlten Tumoren zeigt die FACS- Analyse im Sub G1/G0Peak einen Anstieg. Im Gegensatz dazu konnte bei nicht bestrahltenTumoren nur ein geringe Anstieg im Sub G1/G0 Peak verzeichnetwerden.Die Ergebnisse der TUNEL-Färbung und der FACS-Analyse lassenbei den bestrahlten Tumoren auf eine vermehrte Apoptoseschließen.TUNEL-Färbung eines papillären Schilddrüsenkarzinomsohne Radiatio

ErgebnisseTumor Kerne gesamt TUNEL-positive Kerne in (%)M1 ATR 12550 57,75M1 PTR 26901 60,28M2 PTR 23358 41,62M3 PT 82010 5,87M5 AT 16003 17,68M6 PT 107407 19,20

ZusammenfassungEine Apoptose bei ESRT ist sehr wahrscheinlich. In der FACS-Analyse konnte ein deutlicher Anstieg im SubG1/G0-Peak der bestrahlten Tumorzellen dargestellt werden, was auf einen apoptotischen Vorgang in den Zellenschließen lässt. Ebenso ließen sich in der TUNEL-Färbung apoptotische Zellen nachweisen. Die Abgrenzung zurNekrose und zur spontanen Apoptose ohne Radiatio ist noch nicht vollständig abgeschlossen. Ob nekrotischeund spontane apoptotische Vorgänge, besonders im Tumorkern bei Tumoren größer 1 cm Durchmesser, nichtalleine schon durch die pathophysiologischen Begebenheiten im Tumorgewebe zustande kommen, muss nochabschließend differenziert werden. Wir gehen davon aus, dass im folgenden Versuchsaufbau mit nichtbestrahlten Tumorzellen und mit der Anwendung des Caspase-3-Tracer im Kleintier-PET diese Abgrenzunggelingen wird.FACS – Analyse eines papillärenSchilddrüsentumors nach RadiatioGut vaskuliertes papilläres SD-Karzinom 28 d nach s.c. ZellinjektionTUNEL-Färbung bei einem papillärenSD-Karzinom 48h nach Radiatio