DNA-Isolierung/Aufbewahrung im Schmuckanhänger

Isoliere Deine eigene DNA undbewahre sie in einemSchmuckanhänger auf.Wieso kann man DNA sehen?DNA (Deoxyribonucleicacid) ist extrem klein. Der Durchmesser einesDoppelstranges liegt bei ca. 1 nm (Nano Meter, ein milliardstel Meter).Sichtbar wird sie, da sich eine große Anzahl von DNA-Molekülen zueiner kleinen sichtbaren „Wolke“ zusammenlagern.Woher nehmen wir die DNA?Die DNA isolieren wir – völlig schmerzlos - aus der Mundschleimhaut. ImSpeichel befinden sich genug Mundschleimhautzellen, aus denen die DNAherausgearbeitet und sichtbar gemacht wird.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen1

Material der Fa. Bio-Rad Laboratories Kit 166-2300EDU Genes in a Bottle KitKomplettes Material für 36 Schüler incl.der Glasherzen Die einzelnen Komponenten des Kit können auch alsNachfüllpackungen nachgekauft werden: siehe KatalogMeinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen2

1. Sammeln von ZellenVorbereitet sind Röhrchen (15 ml),die 3 ml Wasser enthalten.Beschrifte ein solches Röhrchen mitDeinen Initialen. Spüle mit diesem Wasser ca. 30Sekunden lang deine Mundhöhle,reibe dabei vorsichtig mit denZähnen an der Innenseite DeinerWangen und gib die Lösung danachvorsichtig in das Röhrchen zurück -oder in einen kleinen Becher unddann in das Röhrchen.Du solltest dabei im Mundraum nichtbluten.Oder:Durch das Spülen und Reibenlösen sich anhaftende Oberflächenzellender Mundschleimhautab, so dass möglichst vielZellmaterial für die Isolation derDNA zusammenkommt.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen3

2. Lysis PufferGib mit der Pipette2 ml Lysis Buffer zuDeiner Lösung.• Dieser Puffer erhält den pH-Wert der Lösung, damit die DNA stabilbleibt -• und löst die Zellmembranen auf, so dass die DNA in Lösung gehenkann.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen4

3.Mischen Verschließe Dein Röhrchen mit der dazugehörenden Kappe. Drehe das Röhrchen 5 mal vorsichtig um. Nicht schütteln! Betrachte das Röhrchen?Kannst Du eine Veränderung feststellen? Falls ja, notiere sie.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen5

4. Zugabe von Protease + SalzGib nun 5 Tropfen der Protease – Salz - Lösungin Dein Röhrchen. Verschließe Dein Röhrchen wiederund drehe es erneut einige Male vorsichtig um. Nicht schütteln!Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen6

Zugabe von Protease• Protease zerstört nukleare Proteine, die DNA binden undZytoplasmaenzyme, die DNA zerbrechen und zerstören.• Die Zugabe von Protease erhöht so den Gewinn an DNA.Zugabe von Salz• Natrium-Ionen binden die Phosphatgruppen der DNA und neutralisierendie elektrische Ladung der DNA.• NaCl macht es möglich, dass DNA-Moleküle sich aggregieren anstattsich gegenseitig abzustoßen. Das macht es der DNA einfacher, sich inder Lösung auszufällen,wenn Alkohol hinzugefügt wird.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen7

5. Wärmebad Stelle Dein Röhrchen für 10 min in das Wasserbad mit 50 0 C.Entnehme es danach wieder.• Die hohe Temperatur beschleunigt die Freisetzung von DNA,• zerstört DNasen, d.h. Enzyme, welche die DNA zerstören könnten.• Die hohe Temperatur beschleunigt aber auch den Zerfall der DNA -daher das nachfolgende Eisbad.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen8

6. Zugabe von eiskaltem Alkohol Halte Dein Röhrchen schräg in einem Winkel von etwa 45 0 .Füge mit Deiner Pipette 10 ml eiskalten Alkohol hinzu.(Also Pipette 10mal füllen.)Lasse den Alkohol an der Wand des Röhrchensnach unten fließen.• DNA kann sich in Alkohol nicht auflösen.• Der eiskalte Alkohol führt zum Verklumpen der DNA und zum Ausfällenaus der Lösung.• Ausgefällte DNA erscheint als lange, flauschige, sehnige, netzartigeStücke.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen9

7. DNA NiederschlagSchraube die Verschlusskappe wieder aufund lasse das Röhrchen 5 min völlig ungestört stehen.Beobachte die Ausfällung.Drehe anschließend das Röhrchen langsam 5x um,um die begonnene Ausfällung der DNA zu unterstützen.• Mikroskopisch kleine Sauerstoffblasen aggregieren oder schmelzenzusammen, gleichzeitig mit dem DNA Niederschlag.• Größere und sichtbare Luftblasen befördern die DNA aus der Lösung,von der wässrigen in die organische Phase.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen10

Drücke den Plastikstopfen fest in das Glasherz ein,um es zu verschließen. Trage einen kleinen Tropfen Kleber auf der Innenseiteder silbernen Kappe auf. Tropfe auch etwas Kleber um den Rand des Glasherzensbzw. des Stopfens. Verwende nicht zu viel Kleber,da sonst der Trocknungsprozess behindert werden könnte. Stülpe die Silberkappe über die Herzöffnung unddrücke sie 30 sec lang fest an. Lasse den Kleber 10 . 15 min lang trocknen und überprüfedann, ob das Herz vollständig verschlossen ist. Nun kannst Du das Herz auf das Lederriemchen auffädeln. Gratulation: Du hast einen Schmuckanhängermit Deiner eigenen DNA hergestellt.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen12

VorbereitungPro Schüler:• 1 Röhrchen (15 ml) mit 3 ml WasserPro Schülergruppe (4 Schüler)• 1 farbiges Röhrchen ( 2 ml) mit 1,25 ml aufgelöster Protease und Salz+ 1 Plastikpipette (Einweg)• 1 Röhrchen (15 ml) mit 10 ml Lysis Buffer + 1 Plastikpipette (Einweg)Vorbereitung Protease und SalzInhalt des Beutels (1,5 g)• in ein Röhrchen (15 ml) geben• und 15 ml Wasser (normales Trinkwasser) zufügen.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen13

Haltbarkeit der angesetzten Lösung• Die angesetzte Protease-Salz-Lösung hält im Kühlschrank bei 4 0 C biszu einer Woche.• … oder nur so viel ansetzen, wie benötigt wird: 100 mg/ mlAlkoholVor Beginn den Alkohol mindestens 1 Stunde in die Tiefkühltruhe oderdas Tiefkühlfach stellen.Von Vorteil sind kleinere Portionen für jede Schülergruppe.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen14

Was ist der Lysis Buffer?Lysis Buffer• Tris-HCI, pH 8.0• SDSDer eigentliche Puffer ist hier dasTris(hydroxymethyl)-aminomethan,kurz Tris.Mit der Salzsäure wird der gewünschte pH-Wert eingestellt.SDS: NatriumdodecylsulfatLöst die Zellmembranen auf, so dass die DNA in Lösunggehen kann.OCH 3CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2SSDSO-OOMeinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen15

BezugsquelleClassroom Kits: Firma Bio-Rad Laboratories GmbH, Postfach 45 01 33,80939 München; Telefon (089) 318 84-0 www.bio-rad.com Katalog: Biotechnology Explorer wissenschaftliche Produktberatung: (089) 31884 177 Ansprechpartnerin bei „schulischen“ Fragen:Frau Dr. Andrea Rüdiger Telefon (089) 31884 188E-Mail: andrea_ruediger@bio-rad.comichFrau Dr. Rüdiger beantwortet gerne alle aufkommenden Fragen. Anfragen können auch an Meinrad Lohmüller SSDL(RS) Reutlingen gestelltwerden. E-Mail: meinrad.lohmueller@seminar-rs-rt.kv.bwl.deMeinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen16

Unser ErfolgE = B x A 2Erfolg = Begeisterung x Anstrengung 2Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA SSDL(RS) Reutlingen17