Isolierung von DNA (Versuchsdurchführung)

Durchführung -Isolierung von DNA(1)Fäden des Lebens – Isolierung von DNA / VersuchsdurchführungAnmerkungenKein Spülmittel-Konzentratverwenden.Vorsichtig rühren, bis das Salzgelöst ist.10 ml Geschirrspülmittel3 g Kochsalz1 Zwiebel oder …Gib das Kochsalz in das Spülmittelund fülle mit Wasser auf 100 ml auf.Rühre gut um, damit sich das Salzauflöst.Würfle die Zwiebel oder … klein,aber nicht kleiner als 10 mm x 10mm.(2)Gib die gewürfelte Zwiebel in dieSalz- Spülmittel-Lösung.Spülmittel enthalten Detergentien(oberflächenaktive Substanzen), dieauch als Emulgatoren oder Tensidebezeichnet werden.Durch ihre chemische Strukturbringen sie Lipide ( in Fett und Ölenlösbare Stoffe) in Lösung undzerstören dadurch Zellwände undKernmembranen - die DNA kannnun aus dem Zellkern austreten.Salze verstärken diesen Effekt.(3)Stelle das Becherglas 15 min bei 60°C in heißes Wasser.(großes Wasserbad oder größeresBecherglas auf der Heizplatte)Die hohe Temperatur beschleunigtdie Freisetzung von DNA undzerstört DNasen, d.h. Enzyme,welche die DNA zerstören könnten.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA, SSDL (RS) Reutlingen 1

(4)Fäden des Lebens – Isolierung von DNA / VersuchsdurchführungDie hohe Temperatur beschleunigtauch den Zerfall der DNA - daherAbkühlung im Eisbad.Stelle das Becherglas zum Abkühlenfür etwa 5 Minuten in Eis oderEiswasser und rühre ständig um.(5)Der Mixer hilft beim Aufbrechen derZellen. Doch Vorsicht - auch dieDNA-Stränge können dadurchzerkleinert werden.Daher nicht länger als 5 Sekundenmixen.Die Mischung in den Mixer gebenund nicht länger als 5 Sekundendurchgemixt.Alternativ: Stabmixer bzw. Mörser(6)Das Zellwandmaterial wird von derDNA und den Proteinen (Eiweißen)getrennt, die beide nun in Lösungvorliegen.Kaffeefilter verwendenDie Mischung wird in ein zweitesBecherglas filtriert.Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA, SSDL (RS) Reutlingen 2

(7)Fäden des Lebens – Isolierung von DNA / VersuchsdurchführungDas Enzym Protease baut Proteinein der Lösung ab und vermindert soderen Anreicherung imnachfolgenden Fällungsschritt.6 ml Filtrat in ein Reagenzglasgeben.Zu diesem Zwiebelgewebe-Extrakt2-3 Tropfen Protease zugeben, dasReagenzglas vorsichtig schütteln.alternativ: Einige KörnerFeinwaschmittel zugeben.(8)Die gleiche Menge( 6 ml ) eiskaltenEthanol sorgfältig am Reagenzglasentlang auf die Oberfläche desZwiebel-Extraktes gießen, um denExtrakt zu übergießen.RG einige Minuten ruhig stehenlassen.(9)Der Ethanol muss mindestens eineTemperatur von etwa -20° C haben.Nukleinsäuren / DNA und RNA sindin Ethanol nicht löslich und fallendaher aus.Da Löslichkeit immer auchtemperaturabhängig ist - deshalb diegeringe Temperatur des Alkohols.Die DNA und RNA fällen aus undsteigen in die obere Alkoholschicht.Mit einer Impföse oder einemHolzstäbchen die ausgefallene DNAim Alkohol aufnehmen, aus derLösung ziehen und betrachten.(ggf. vorher anfärben)Meinrad Lohmüller Fachbereich NWA, SSDL (RS) Reutlingen 3