Theorie zum Histidase- Versuch
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<strong>Histidase</strong> Enzymkinetik<br />
- 13 -<br />
Küvettenbestückung für jeden der 5 Ansätze (UV, 277 nm, Quarzküvette) mit 0,8 mM bzw.<br />
0,1 mM L-Cystein in der Küvette:<br />
<strong>Histidase</strong> z.B. 10 µl<br />
0,1M Pyrophosphat-Puffer pH 9,3/10µM 873 µl bzw. mehr <strong>zum</strong> Auffüllen auf 1ml<br />
ZnCl2<br />
Küvettenvolumen<br />
0,1 M DTT 17 µl<br />
Zur Reduktion der Disulfidbrücken wird das Enzym 5 min inkubiert. Dann wird durch<br />
gleichzeitige Zugabe von L-Histidinlösung der Konzentrationen 1-5 und 0,8 mM bzw. 0,1<br />
mM L-Cystein ( Konzentration in der Küvette) die Reaktion gestartet.<br />
4.6. Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten<br />
von trans- Urocaninsäure<br />
Zur Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten werden ca. 170 mg ( genauen Wert<br />
notieren ) trans- Urocaninsäure in einem 500 ml Meßkolben in 500 ml<br />
50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 gelöst. Dabei ist äußerst genau zu arbeiten, außerdem<br />
sollte darauf geachtet werden, dass die trans- Urocaninsäure vollständig in Lösung ist!<br />
Mit dem 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 wird bei 277nm ein Nullabgleich<br />
durchgeführt. Anschließend soll die trans- Urocaninsäurelösung in der Küvette so verdünnt<br />
werden, so dass die Extinktion, welche von 3,4mg trans- Urocaninsäure in einem Liter<br />
verursacht wird, in der Küvette gemessen werden kann.<br />
Über die gemessene Extinktion und der in der Küvette vorhandenen Konzentration der trans-<br />
Urocaninsäure in mol/l kann nun bequem über das Lambert- Beersche Gesetz der molare<br />
Extinktionskoeffizient berechnet werden.<br />
E = ε * c* l<br />
l = 1cm<br />
Literaturwert: ε ( 277nm , pH= 7,4) = 18,8ml*µmol -1 *cm -1
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