Theorie zum Histidase- Versuch

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Histidase Enzymkinetik - 6 - Der Regulationsmechanismus hierbei kann u.a. mit Hilfe des Jacob- Monod- Modells anhand des Lactose- (lac)- Operons von Escherichia coli erklärt werden ( siehe hierzu Lehrbücher zur Genetik oder Mikrobiologie). Die Induzierbarkeit der Synthese bestimmter Enzyme kann natürlich auch bei deren Isolierung aus einem Zellrohextrakt ausgenutzt werden. 4.) Stereospezifität der Histidase- Reaktion Setzt man L- Histidin in Anwesenheit von D2O mit Histidase um, so entsteht trans- Urocaninsäure. Da aber die Reaktion reversibel ist, wird Histidin zu einem geringen Prozentsatz wieder zurückgebildet. Anstelle des abgespaltenen Protons wird nun aber Deuterium (aus dem Lösungsmittel) eingebaut (direkt nachweisbar mittels NMR- Spektroskopie). Die Tatsache, dass nur eines der beiden H- Atome am β- C- Atom des Histidins durch Deuterium ersetzt wird, weist darauf hin, dass bei der Eliminierungsreaktion durch die Histidase nur ein bestimmtes der beiden H- Atome eliminiert wird. Die Reaktion verläuft demnach stereospezifisch d.h. das Enzym kann die beiden H- Atome des Histidins am β- C- Atom voneinander unterscheiden. Wäre dies nicht der Fall, so wären beide H- Atome am β- C- Atom durch Deuterium ersetzt. Diese beiden H- Atome sind zueinander diastereotop. Diastereotope Gruppen können generell durch Enzyme unterschieden werden. Die durch die Histidase katalysierte Eliminierung verläuft antiperiplanar. N N H H SiHRe H 2N L- Histidin H COOH Histidase -NH 3 N N N H H H trans-Urocaninsäure N H H SiD H 2N +D 2O +NH 3 H COOH COOH
Histidase Enzymkinetik - 7 - 4.) Histidase ( Histidin Ammoniak- Lyase) Zur Bestimmung der Gesamtaktivität der Histidase aus Pseudomonas Putida ( welche in Escherichia coli überexprimiert wurde), wird ihre Eigenschaft L- Histidin zu trans- Urocaninsäure umzusetzen, ausgenutzt. Über die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Warburg kann dann die spezifische Aktivität berechnet werden. Anschließend wird mit dieser Histidase eine Inhibitionskinetik- zur Bestimmung des Ki- Wertes von L- Cystein- erstellt. Zuletzt soll noch der molare Extinktionskoeffizient einer ausgegebenen trans- Urocaninsäure spektrometrisch ermittelt werden. N N H H SiHRe H 2N L- Histidin H COOH Histidase -NH 3 N N H H H trans-Urocaninsäure COOH
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