Theorie zum Histidase- Versuch

Durchführung:
Histidase Enzymkinetik
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4.1. Isolierung der Histidase aus Escherichia coli:
E.coli- Histidase- Zellen aus 125 ml Anzucht werden in ca. 30 ml (soviel, dass das
Ultraschallaufschlußgefäß bis ca. 1 cm unter den Rand gefüllt ist) 10 mM Tris- HCL
pH 7,2 auf Eis resuspendiert, in ein Ultraschall- Aufschlußgefäß überführt und
5- 10 min bei 65- 70 % Leistung mit Ultraschall aufgeschlossen (solange, bis die Lösung klar
ist). Das Aufschlußgefäß wird dabei immer mit Eis gekühlt.
Danach wird die aufgeschlossene Proteinsuspension in einen gekühlten Metall-
Zentrifugenbecher umgefüllt und 40 min bei 4°C und 18000 rpm abzentrifugiert, um
Zellrückstände zu entfernen
( Sorvall- Zentrifuge, Rotor SS 34 ).
Die überstehende, noch trübe Lösung des Rohextraktes wird in einen 100 ml Rundkolben
überführt und pro 10ml Volumen mit 100 µl 0,1 M MgSO4, 100 µl 0,5 M L- Histidin und
100 µl 0,1 M DTT versetzt. Der Rohextrakt wird im Ölbad unter Rühren 15 min bei 80°C
erhitzt
Unter diesen rigorosen Bedingungen denaturieren nahezu alle Enzyme außer der Histidase,
welche nach erneuter Zentrifugation bei 4°C, 18000 rpm und 30 min Dauer im Überstand
bleibt.
Das Volumen des Überstandes (ml) wird bestimmt und die Enzymlösung kaltgestellt,
während die Histidase- Gesamtaktivität bestimmt wird.
4.2. Bestimmung der Proteinkonzentration nach Warburg
Zu bestimmende Proteinproben werden gegen eine Referenzküvette mit Puffer bei 260 nm
und 280 nm gemessen. Zuvor muss bei diesen Wellenlängen der Nullabgleich mit Puffer
durchgeführt werden.
Die Proteinkonzentration wird wie folgt berechnet:
Proteinkonzentration (mg/ml) = 1,5 x A280 – 0,75 x A260 x Verdünnungsfaktor
Puffer für die Messung der Histidase- Konzentration: 10 mM Tris- HCL pH 7,2
Die Menge an Histidase- Lösung sollte so gewählt sein, so dass ungefähr eine Absorption im
Bereich von E = 0,2 bis E = 1 gemessen wird.