Diapositive 1 - de l'Université libre de Bruxelles

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES (ULB)Faculté des SciencesDépartement de Biologie des OrganismesLaboratoire de Biologie marineINSTITUT ROYAL DES SCIENCES NATURELLES DE BELGIQUE (IRSNB)Département des InvertébrésIncorporation du magnésium dans les squelettes calcitiquesdes échinodermes et des éponges hypercalcifiéesJulie HERMANSThèse présentée en vue de l'obtention du titre deDocteur en SciencesJUILLET 2010Promoteurs de thèseDr Philippe Dubois (ULB)Dr Philippe Willenz (IRSNB)

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES (ULB)UNIVERSITÉ D’EUROPEFaculté des SciencesDépartement de Biologie des OrganismesLaboratoire de Biologie marineINSTITUT ROYAL DES SCIENCES NATURELLES DE BELGIQUE (IRSNB)Département des InvertébrésIncorporation du magnésium dans les squelettes calcitiquesdes échinodermes et des éponges hypercalcifiéesJulie HERMANSThèse présentée en vue de l'obtention du titre deDocteur en SciencesPromoteurs de thèseDr Philippe Dubois (ULB)Dr Philippe Willenz (IRSNB)Comité de lectureDr Christiane Lancelot (ULB)Dr Guy Josens (ULB)Dr Frank Dehairs (ULB-VUB)Dr Bruno David (Université de Bourgogne, France)Dr Luc André (Musée Royal de l’Afrique Centrale-ULB) JUILLET 2010

RemerciementsJ’aimerais tout d’abord remercier le Pr Jackie Van Goethem de m’avoir accueillie au seinde son département de l’Institut royal des sciences naturelles de Belgique et de m’avoirsoutenue dans l’obtention du contrat sans lequel cette thèse n’aurait pas été possible. Jelui suis reconnaissante, ainsi qu’à son successeur à la tête du département, le Pr ThierryBackeljau, pour la confiance qu’ils m’ont témoignée.Je remercie vivement le Pr Michel Jangoux qui, par deux fois, m’a ouvert les portes deson laboratoire de Biologie marine à l’ULB. Je crois pouvoir dire que je m’y sensactuellement comme un poisson dans l’eau.Mes remerciements les plus sincères vont à mon promoteur Philippe Dubois. Mercid’avoir été la personne sur laquelle j’ai toujours pu compter durant ces années de thèse.Merci pour ton investissement de tous les jours, ton soutien et ton optimisme. Ta passionde la recherche et tes encouragements dans les jours difficiles ont été une pièce maîtressede l’aboutissement de cette thèse. Merci aussi pour ta patience face à mes difficultésrécurrentes avec les statistiques et les colles de chimie ;-). Enfin, merci pour ton humouret ton côté humain. Saches que ce fut un réel plaisir de travailler avec toi.Je remercie aussi mon co-promoteur Philippe Willenz. Tu m’auras enseigné la rigueur etle sens du détail. J’aurai beaucoup appris sur les relations humaines en travaillant à tescôtés. Je n’oublierai pas les bons moments passés en mission, de Marseille à Rhodes, niton humour qui aura souvent détendu l’atmosphère.Je tiens à remercier l’équipe du service de Minéralogie et Pétrographie du Musée Royalde l’Afrique Centrale, qui m’a fait un excellent accueil tout au long de cette thèse.J’exprime toute ma reconnaissance au Pr Luc André pour ses précieux conseils et pournous avoir toujours ouvert les portes de son laboratoire. Un merci tout particulier àLaurence Monin et Nourdine Dakhani pour leur aide lors des (nombreuses) analysesd’ICP-AES de cette thèse et pour leur sympathie. Je suis reconnaissante à Jacques Navezpour les analyses en HR-ICP-MS et pour son aide dans le traitement des résultats. Merci àFrédéric Planchon pour les discussions riches en magnésium que nous avons eues… toutsimplement fortifiantes !Je remercie aussi toute l’équipe de la VUB, que j’ai eu l’occasion de côtoyer dans le cadredu projet CALMARS, notamment les Pr Frank Dehairs et Eddy Keppens, ainsi queRémy Mas, Michael Korntheuer et Emilie Chevalier pour leurs explications sur lesanalyses IRMS.Je tiens à remercier le Pr Jean Vacelet. Nos échanges d’idées au cours de la rédaction del’article sur la croissance de P. massiliana ont été extrêmement intéressants.Je remercie le Pr Yannicke Dauphin pour sa collaboration pour les analyses XANES,réalisées au synchrotron de Grenoble.Un tout grand merci au Pr Philippe Compère pour ses conseils sur les extractions dematrices organiques et le prêt à long terme de son dispositif d’extraction de protéines.Je remercie le Pr Alain Bernard pour les analyses XRD qu’il a effectuées à ma demande.

Je tiens à remercier Jean et Véro du club de plongée « Au-delà plongée » pour le bonaccueil que notre équipe y a toujours reçu. Merci aussi à André de « Waterhoppers » pourson aide lors des plongées à Rhodes.Merci à Helmut Zibrowius de m’avoir aidé à localiser les grottes à Petrobiona de l’île deRhodes. Sa précision et son excellente mémoire nous ont été d’un précieux secours.Un tout grand merci à toute la joyeuse équipe du laboratoire. Merci à Chantal, Viviane,David, ainsi que Edith et Saloua, toujours hyper efficaces pour les commandes d’urgenced’un produit. Merci aussi à Thierry Dupont pour ses conseils d’aquariophile sans lesquelsje n’aurai pu monter mon propre Nausicaa et pour son aide dans cette entreprise, ainsi quepour les 1001 petites réparations de sauvetage qu’il a faites. Enormes mercis à Ana(« Lunch time ! ») pour sa bonne humeur de tous les jours et ses qualités de chercheusebibliographique invétérée, Claire (« Patriiiiiiiick the starfish !!! ») pour sa sympathie etses conseils toujours avisés, Colin (« moi j’aime pas… ») pour un intérim de plongeurquand j’en ai eu besoin et une mission express rondement menée à Marseille, Mathieupour son aide et sa sympathie, Gauthier pour ses conversations sans fin et ses petitsrappels de bio toujours très didactiques, et Bruno pour sa bonne humeur lors de sesincursions dans notre bureau. Merci aussi à la ribambelle de mémorants qui se sontsuccédé pour mettre un peu d’ambiance dans ce grand laboratoire (« Faites votrevaisselle! »).Je tiens à adresser un merci tout spécial à mes compagnes de bureau successives,Catherine Borremans et Stéphanie Bonnet. Votre présence et nos longues conversations(parfois intellectuelles !) ont contribué à faire de cette thèse un bon souvenir dans mamémoire… Je n’oublie pas non plus le palmier gonflable qui a orné notre bureau pendanttoutes ces années, égaillant la pièce de ses couleurs vives.Un tendre merci à Philippe Pernet pour son aide précieuse et toujours efficace, que ce soitau cours des missions, pour les analyses AAS, les interminables séances de découpage depiquants, les régénérations de résines, et j’en passe. Merci pour ta présence, tadisponibilité et ton oreille attentive. Merci du fond du cœur pour ton soutien sans faillelors de la stressante période des derniers mois de thèse. Une chose est sûre, tu m’esdevenu indispensable.Je remercie aussi la petite équipe de l’institut : Melany pour sa sympathie et Laetitia pourson aide toujours souriante... Un tout grand merci à Yves Barette, pour son aide rapide etefficace face aux problèmes de PC et un sauvetage de disque dur que je n’ai pas oublié.Merci aussi à Pol Gosselin sur lequel, comme à son habitude, j’ai toujours pu compterpour un conseil sur les préférences alimentaires des oursins ou une mission express à Lucsur-Mer.Merci aussi à tous les membres du laboratoire de biologie marine de Mons, qui m’onttoujours fait bon accueil, avec une spéciale dédicace à Fifi, Elise et Aline. Merci aussi àPaul Postiau pour sa gentillesse et sa disponibilité.Merci à la mafia bibliographique portugaise (Johana, Elizabete, Màrio) pour lesnombreux pdf que j’ai pu obtenir grâce à leur complicité.

Ce travail a été rendu possible par la collaboration de l’Institut des Sciences naturelles etdu laboratoire de biologie marine de l’Université Libre de Bruxelles. Il a pu être réaliségrâce à l’appui financier d’un programme « Action 2 » financé par la PolitiqueScientifique fédérale belge, et à celui de la Fondation David et Alice Van Buuren.Enfin, je remercie ma famille et tous mes amis, qui m’ont toujours soutenue et sanslesquels je n’aurai pu devenir celle que je suis aujourd’hui. Vous êtes dans mon cœur et yresterez, quelle que soit la distance.

RÉSUMÉDe nombreux organismes marins précipitent des squelettes en calcite magnésienne.Depuis près d’un siècle, il est connu que les concentrations en magnésium de cessquelettes sont influencées par les conditions environnementales, telle la température,régnant au moment de leur dépôt. Dans le contexte actuel de changement climatique, cettepropriété a promu l’usage de plusieurs taxons en tant qu’archive naturelle des conditionsenvironnementales du passé. Cependant, les squelettes d’espèces sympatriques, voired’individus de la même espèce, peuvent présenter des concentrations en magnésium trèsdifférentes, attestant de l’influence de facteurs biologiques sur la détermination de laconcentration squelettique en cet élément. Une parfaite compréhension des mécanismesd’incorporation du magnésium dans les squelettes est donc requise pour valider l’usage dece paléotraceur. De plus, la solubilité des calcites augmentant avec leur concentration enmagnésium, l’incorporation de cet élément conditionne en partie la stabilité des squelettescalcitiques dans un océan en cours d’acidification.Le présent travail contribue à l’étude des différents facteurs, tant environnementaux quephysiologiques et minéralogiques, susceptibles d’affecter l’incorporation du magnésiumdans les squelettes en calcite de trois taxons présentant des concentrations en cet élémentparticulièrement élevées, une éponge hypercalcifiée, Petrobiona massiliana, et deuxéchinodermes, Paracentrotus lividus et Asterias rubens.Dans une première partie, les effets de plusieurs facteurs environnementaux ont étéétudiés, en milieu naturel dans le cas de l’éponge, étant donné son incapacité à survivre enaquarium, et en conditions contrôlées d’aquarium dans le cas des deux échinodermes.Une influence environnementale prépondérante de la température sur la concentration enmagnésium squelettique a été mise en évidence dans les 3 modèles biologiques étudiés.Une fois les facteurs génétiques (espèce) et structurels (élément squelettique) fixés, unerelation positive liant la température à la concentration en magnésium squelettique a étécaractérisée en milieu naturel chez l’éponge hypercalcifiée P. massiliana et en conditionscontrôlées chez l’oursin P. lividus. Chez ce dernier, cette relation, non linéaire, sestabilise aux plus hautes températures envisagées, probablement suite à la saturation d’unprocessus biologique intervenant dans l’incorporation de cet élément. La salinité, un autrefacteur environnemental majeur en milieu marin, influence elle aussi positivement laconcentration en magnésium dans le squelette de l’étoile de mer A. rubens. A nouveau, ilest proposé que cette influence de l’environnement soit modulée par un processusbiologique: chez les échinodermes, la concentration en magnésium, contrairement à celledu calcium, n’est pas régulée dans le liquide coelomique. Elle est donc directementinfluencée par la salinité, et affecte probablement la concentration en cet élément dans lesquelette formé. La diffusion depuis l’eau de mer jusqu’au site de calcification parl’intermédiaire des fluides internes a en effet été suggérée sur base du fait que le rapportMg/Ca de l’eau de mer influence celui des squelettes calcairesUne fois l’influence, directe ou indirecte, des facteurs environnementaux exclue, 44% dela variabilité du rapport Mg/Ca du squelette des échinodermes restent à expliquer. Lesexpériences de croissance d’échinodermes réalisées en conditions contrôlées indiquentque ce rapport est indépendant de la vitesse de croissance dans ce groupe, contrairementaux hypothèses émises dans la littérature.

Dans la seconde partie, la modulation des facteurs minéralogiques par les facteursbiologiques a été investiguée. Pour ce faire, d’une part, les interactions entre rapportMg/Ca en solution et matrice organique de minéralisation ont été étudiées dans un modèlein vitro. D’autre part, les relations entre soufre et magnésium dans le squelette ont étédécryptées.Le rapport Mg/Ca de la solution de précipitation a une influence prépondérante sur laconcentration en magnésium du carbonate de calcium précipité in vitro, attestant del’importance de la régulation de la composition du fluide de calcification et desmécanismes de transport la contrôlant. Deux mécanismes biologiques complémentairespermettent de favoriser l’incorporation, dans les calcites biogéniques, de quantités demagnésium largement supérieures à celles observées dans les calcites inorganiques, et ce,malgré la forte hydratation de ce cation : l’intervention d’agents chélateurs du magnésiumet le passage par une phase de carbonate de calcium amorphe (CCA). Les molécules de lamatrice organique de minéralisation jouent entre autres le rôle de chélateur dumagnésium, réduisant son état d’hydratation et facilitant ainsi son incorporation dans leminéral. Un rôle similaire a été suggéré pour les sulfates en solution, au vu de lacorrélation observée dans ce travail entre les rapports Mg/Ca et S/Ca dans la phaseminérale des calcites biogéniques étudiées. La matrice organique affecte elle aussi laconcentration en magnésium dans le cristal, probablement via la stabilisation de la phasede CCA nécessaire à l’incorporation de concentrations élevées de cet élément: ainsi, lesmacromolécules de la matrice organique du test d’oursin induisent in vitro la formation decalcites plus riches en magnésium que celles formées en présence de matrice de piquant,un résultat concordant avec le fait que, in vivo, le test contient des concentrations enmagnésium plus élevées que les piquants.Cette thèse de doctorat a donc soulevé l’importance des effets biologiques dans ladétermination du rapport Mg/Ca dans les calcites biogéniques. Les résultats obtenusmontrent que le décryptage des mécanismes impliqués dans l’incorporation dumagnésium se doit de considérer la phase amorphe transitoire qui précède lacristallisation. Des effets environnementaux affectent eux aussi la concentrationsquelettique en magnésium, mais nos résultats suggèrent qu’ils agissent au travers d’unemodulation des effets biologiques, et non par une influence thermodynamique directe.Cette hypothèse, si elle est confirmée, impose la plus grande prudence lors de l’utilisationdes squelettes en calcite en tant que paléotraceurs.

SUMMARYThe magnesium concentration in calcite skeletons produced by marine invertebrates isknown to be dependent on several environmental parameters, including temperature,salinity and seawater Mg/Ca ratio. This property prompted the use of this concentration asa proxy of the considered parameters. However, skeletal magnesium contents insympatric species and even in individuals of the same species may be rather different.These inter and intra-individual variabilities indicate that biological factors also affectmagnesium incorporation into biogenic calcites. Magnesium incorporation mechanismsare still unknown in calcifying invertebrates, a fact that questions the validity of thiselement as a paleoproxy. Moreover, higher magnesium contents increase calcite solubilityand could therefore worsen the case of calcifying organisms facing ocean acidificationlinked to global change.The present thesis is a contribution to the study of the environmental, biological andmineralogical factors affecting magnesium incorporation into the calcitic skeletons of 3taxa, i.e. one hypercalcified sponge, Petrobiona massiliana, and two echinoderms,Paracentrotus lividus and Asterias rubens.The first part of this work was dedicated to the study of several environmental factorsaffecting the magnesium concentration in the calcite skeleton of the 3 studied organisms.Consequently to its low survival in aquarium, the sponge was studied using fieldspecimens collected along an environmental gradient. Echinoderms were grown incontrolled conditions in aquarium. Once the genetic (species) and structural (skeletalelement) factors were fixed, skeletal magnesium concentration was positively related totemperature in the 3 studied species. The Mg/Ca ratio of the test of aquarium-grownP. lividus increased with temperature until a plateau which was probably due to thesaturation of a biological process involved in magnesium incorporation. A positive effectof salinity, an other major environmental parameter, on skeletal Mg/Ca was demonstratedin aquarium-grown A. rubens. This influence can also be linked to a biological process:contrary to magnesium, calcium concentration is controlled in the coelomic fluid, fromwhich ions probably diffuse through the living tissues to the calcification site. Thus, theobserved positive relation can be explained by the fact that a salinity increase raises thecoelomic Mg/Ca ratio, which, according to previous studies, affected the Mg/Ca ratio ofthe precipitated skeleton.In addition to the reported environmental influences, 44% of the skeletal Mg/Ca ratiovariation remained unexplained in echinoderms. The absence of growth rate effect onmagnesium incorporation into the echinoderm skeleton was demonstrated in aquariumexperiments, contrary to previous literature statements. Other biological factors musttherefore affect the incorporation of this element.In the second part of this work, the modulation of mineralogical factors by biologicalfactors was investigated. The interaction between Mg/Ca ratio in the precipitationsolution and organic matrix was studied in an in vitro precipitation experiment. Inaddition, the relation between skeletal Mg/Ca and S/Ca ratios was investigated.A major influence of the precipitation solution Mg/Ca ratio on the magnesiumconcentration of in vitro precipitated minerals was evidenced, highlighting the importanceof transport mechanisms which determine the composition of the calcifying solution. The

higher magnesium concentrations presented in some biogenic calcites in comparison toinorganic calcites can be attributed to the action of chelating molecules and to thetransition trough an amorphous phase. The strong tendency of magnesium towardshydration can be overcome by the involvement of molecules that can function asmagnesium chelators and, therefore, favour the formation of calcite with a highmagnesium content. Organic matrix macromolecules have been suggested to proceed asmagnesium chelators, reducing the hydration of this ion and facilitating its incorporationinto calcite. A similar function was suggested for sulphates that were measured in theechinoderm skeleton. This would explain the positive correlation between skeletal Mg/Caand S/Ca ratios observed in the studied species. Organic matrix macromolecules alsoincreased the magnesium concentration of minerals precipitated in vitro, probablystabilizing the transient phase of amorphous calcium carbonate, which can incorporatehigh quantities of magnesium in its structure. The enhancement of magnesiumincorporation was more pronounced with the organic matrix extracted from the test of seaurchin than with that extracted from their spines. This result was in agreement with the invivo skeletal Mg/Ca ratios in P. lividus skeleton that were higher in the test than in thespines.This study demonstrated the importance of the biological effects in the determination ofMg/Ca ratios in biogenic calcites. According to the suggested hypotheses, theunderstanding of mechanisms involved in magnesium incorporation should take thetransient amorphous phase into account. Magnesium concentration in biogenic calcite wasalso affected by environmental parameters, but these influences could proceed throughthe indirect modulation of biological rather than a direct thermodynamic control. Thishypothesis, if proved correct, would have deep implications for the use of magnesium incalcite skeletons as a paleoproxy.

TABLE DES MATIÈRESIntroduction générale...............................................................................................................11. Les biominéraux et l’environnement....................................................................................12. Les calcites magnésiennes....................................................................................................32.1. L’ion magnésium...........................................................................................................32.2. La magnésium dans les calcites inorganiques et biogéniques.......................................62.2.1. Facteurs contrôlant la concentration en magnésium dans les calcitesinorganiques……………………………………………………………………....82.2.1.1.Composition de la solution de précipitation……………………………….82.2.1.2.Température………………………………………………………………..92.2.2. Facteurs contrôlant la concentration en magnésium dans les calcitesbiogéniques…………………………………………………………...…………102.2.2.1.Température………………………………………………………………102.2.2.2.Rapport Mg/Ca de l’eau de mer…………………………………………..122.2.2.3.Autres facteurs environnementaux……………………………….......…...122.2.2.4.Effets vitaux et contrôle biologique............................................................143. Modèles biologiques étudiés..............................................................................................193.1. Le squelette postmétamorphique des échinodermes....................................................193.1.1. Structure et morphogenèse................................................................................193.1.2. Le magnésium dans le squelette des échinodermes..........................................223.2. Les squelettes des éponges calcaires............................................................................233.2.1. Les spicules calcaires........................................................................................243.2.2. Les squelettes massifs.......................................................................................26Buts du travail.........................................................................................................................29PREMIÈRE PARTIE : Facteurs environnementaux et physiologiques affectantl’incorporation du magnésium…………………………………………………........31Chapitre 1. Growth rate and chemical features of the massive calcium carbonate……….35skeleton of Petrobiona massiliana (Baeriida, Calcaronea, Calcispongiae).Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, June2010, 90:749-754; doi: 10.1017/S0025315409991081Chapitre 2. Temperature, salinity and growth rate dependences of Mg/Ca and………….47Sr/Ca ratios of the skeleton of the sea urchin Paracentrotus lividus(Lamarck): an experimental approach. Marine Biology, June 2010, 157(6): 1293-1300; doi: 10.1007/s00227-010-1409-5Chapitre 3. Salinity effects on the Mg/Ca and Sr/Ca in starfish skeletons and……………61the echinoderm relevance for paleoenvironmental reconstructions. Geology,April 2009, 4: 351-354; doi : 10.1130/G25411A.1;2

DEUXIÈME PARTIE: Processus minéralogiques affectant l’incorporation dumagnésium………………………………………………………………………………….75Chapitre 4. An intriguing relationship between Mg/Ca and S/Ca skeletal ratios………….77in biogenic calcites: is sulphur linked to magnesium incorporation?(Submitted in Chemical Geology)Chapitre 5. Relative influences of solution composition and presence of………………….93intracrystalline proteins on magnesium incorporation in calciumcarbonate minerals: an in vitro precipitation study (In preparation)Discussion générale et conclusions.......................................................................................1091. Facteurs biologiques et environnementaux...........................................................1092. Le rapport Mg/Ca en tant qu’enregistreur des conditions environnementales......1163. Perspectives...........................................................................................................118Références bibliographiques................................................................................................121

Introduction généraleINTRODUCTION GÉNÉRALE1. LES BIOMINÉRAUX ET L’ENVIRONNEMENTLe terme biominéral désigne un minéral dont la précipitation dépend de l’activité d’unorganisme vivant. Un minéral est classiquement défini comme un composé inorganiqueen phase solide de composition chimique donnée (Steen 1971). La formation debiominéraux est un processus largement répandu dans le monde vivant, recensé dans plusde 55 phylums différents (Lowenstam & Weiner 1989). Ces structures biogéniquesremplissent des fonctions biologiques diverses et variées, comprenant notamment lesfonctions squelettiques de maintien de la forme statique, de transmission des mouvementset de protection, mais aussi les fonctions de préhension et de mastication de la nourriture.Les biominéraux interviennent également dans la réception et la transmission sonores,l’orientation (dans un champ gravitationnel ou magnétique) et ont une grande importancedans les processus de détoxication et de stockage d’ions à fonction métabolique.On connaît actuellement plus de 64 biominéraux de nature différente (Weiner & Dove2003). La calcification est un cas particulier de biominéralisation où le cation principal estle calcium. Elle concerne environ la moitié des biominéraux recensés à ce jour, lecarbonate de calcium constituant le squelette de nombreux invertébrés marins. Dans lanature, le carbonate de calcium (CaCO 3 ) existe sous différentes formes (qui diffèrent parla disposition spatiale de leurs atomes): une forme amorphe (sans arrangement particulierdes atomes) et 5 polymorphes, à savoir l’aragonite (système cristallin orthorhombique), lacalcite (système rhomboédrique), la vatérite (système hexagonal) et les carbonates decalcium mono-hydratés (système rhomboédrique) et hexa-hydratés (systèmemonoclinique) (Lippman 1973, Dahl & Buchardt 2006). En conditions inorganiques, lacalcite et l’aragonite sont stables à température et pression normales. Par contre, lavatérite et les formes amorphes et hydratées du carbonate de calcium sont instables dansces mêmes conditions (Raz et al 2000, Neumann & Epple 2007). La calcite et l’aragonitesont de loin les principales formes de carbonate de calcium précipitées par les organismesvivants et constituent, entre autres, le squelette des coraux, de certaines éponges, desforaminifères, des coccolithophores, des mollusques, des brachiopodes, des bryozoaires etdes échinodermes. Le carbonate de calcium amorphe (CCA) constitue une phase1

Introduction généraletransitoire ou permanente du squelette de nombreux invertébrés, où il est stabilisé par desmolécules biologiques (Raz et al 2002). On recense également quelques rares exemplesde biominéralisation de vatérite et de carbonate de calcium mono-hydraté, dont lesspicules de certaines ascidies (Lowenstam & Abbott 1975, Addadi et al 2003).Les biominéraux peuvent être classés selon le niveau de contrôle exercé lors de leurprécipitation : on distingue les biominéralisations biologiquement induites desbiominéralisations biologiquement contrôlées (Mann 2001). Dans le premier cas, lebiominéral est précipité sous un contrôle biologique minimal, par simple réaction demétabolites produits par l’organisme avec des ions du milieu extérieur. Le minéral ainsiformé présente des propriétés similaires à celles de son homologue inorganique. Dans lecas de la biominéralisation strictement contrôlée par l’organisme, largement répandue ausein du monde vivant, un contrôle strict de la formation du minéral est assuré par unefraction souvent quantitativement faible de molécules organiques. Le cristal ainsi forméprésente des propriétés particulières par rapport à son équivalent inorganique. Le site decalcification est en général isolé de l’environnement extérieur, ce qui permet un contrôlelocal strict de la composition et de la sursaturation du microenvironnement à partir duquelle minéral est formé (Simkiss & Wilbur 1989). La présence de cette fraction organiquefait des biominéraux des matériaux composites, enjambant la frontière stricte opposantmondes vivant et minéral des premières classifications des objets naturels (Aristote -343dans Barthélemy Saint Hilaire 1887).La composition des biominéraux est en relation directe avec l’environnement. D’une part,comme nous le verrons, la composition des biominéraux est influencée par les conditionsde l’environnement (température, concentration des ions dans l’eau pour les organismesaquatiques, etc…). Les biominéraux sont donc susceptibles d’enregistrer certainescaractéristiques environnementales prévalant lors de leur formation. De ce fait, plusieursbiominéraux sont utilisés comme paléoenregistreurs permettant la reconstruction desconditions environnementales passées. D’autre part, la composition des biominérauxinfluence leur stabilité et donc la résilience des organismes qui les synthétisent face auxchangements environnementaux. La composition des biominéraux joue donc un rôleimportant dans la problématique des changements environnementaux, ce qui m’a amenéeà y consacrer ma thèse de doctorat. Je me suis intéressée plus particulièrement à l’ionmagnésium dans les calcites, dont la concentration est d’une part, contrôlée parl’environnement et d’autre part influence la solubilité du minéral formé.2

Introduction générale2. LES CALCITES MAGNÉSIENNESDe nombreux organismes marins produisent des squelettes de carbonate de calcium,majoritairement sous la forme d’aragonite ou de calcite. Cette dernière cristallise dans lesystème rhomboédrique, et est caractérisée par un axe c perpendiculaire à deux axes asitués à 120° l’un de l’autre (Lippman 1973, Figure 1).Figure 1 : Structure de la calcite (d’après Young et al 1999).Cette polymorphe du carbonate de calcium peut incorporer des concentrations nonnégligeables d’ions magnésium dans sa maille. Une calcite est définie comme hautementmagnésienne, lorsque sa concentration en magnésium est supérieure à 4 mol% de MgCO 3(Lippman 1973) et faiblement magnésienne, lorsque cette concentration est inférieure à4 mol%. Les aragonites sont généralement plus pauvres en magnésium que les calcites.C’est notamment le cas dans les carbonates biogéniques (Clarke & Wheeler 1922), où lesformes aragonitiques présentent rarement des concentrations en magnésium supérieures à1 mol% de MgCO 3 , alors que les formes calcitiques contiennent souvent plus de 20 mol%de MgCO 3 , et rarement moins de 1 mol% (Chave 1954, Dodd 1967, Figure 2). Lesorganismes auxquels est consacrée ma thèse de doctorat produisent un squeletteprincipalement constitué de calcite magnésienne. Je me focaliserai par conséquent sur ceminéral. Dans le présent chapitre, je décrirai l’état actuel des connaissances concernantles propriétés chimiques de l’ion magnésium et la formation des calcites magnésiennes,3

Introduction généraleFigure 2 : Contenu en magnésium des aragonites (A) et calcites (B) des squelettes de différents taxa(d’après Dodd 1967).en conditions inorganiques et organiques, ainsi que l’ensemble des facteurs susceptiblesd’influencer leur synthèse.2.1 L’ION MAGNÉSIUML’ion Mg 2+ est le cation divalent le plus abondant dans les cellules vivantes. C’est unélément essentiel au niveau biologique : il intervient dans la formation des tissus dusquelette, la chimie des fluides biologiques, la régulation des fonctions cellulaires ettissulaires, la régulation d’enzymes, la photosynthèse, … (Vidolin et al 2007, Bentov &Erez 2006). L’ion Mg 2+se distingue des autres cations retrouvés dans les systèmesbiologiques par sa haute densité de charge 1 et sa chimie en solution tout à fait particulière(Smith & Maguire 1998, Wolf & Cittadini 2003).Tableau 1 : Propriétés des cations communs dans les systèmes biologiques (d’après Maguire &Cowan 2002).IonRayonionique(Å)Rayonhydraté(Å)RapportdesrayonsVolumeionique(Å 3 )Volumehydraté(Å 3 )RapportdesvolumesNombredecoordinationTauxd’échangeaqueux (s -1 )Na + 0,95 2,75 2,9 3,6 88,3 24,5 6 8×10 8K + 1,38 2,32 1,7 11,0 52,5 4,8 6-8 10 9Ca 2+ 0,99 2,95 3,0 4,1 108 26,3 6-8 3×10 8Mg 2+ 0,65 4,76 7,3 1,2 453 394 6 10 51 La densité de charge d’un ion correspond à sa charge divisée par son rayon. Elle permet de prédire lecomportement d’un élément en solution. La solubilité des cations en solution aqueuse dépend del’attraction électrostatique des molécules d’eau sur cet ion, elle-même fonction de la densité de charges del’ion (Railsback 2006).4

Introduction généraleEn effet, parmi les cations abondants dans les systèmes biologiques, l’ion Mg 2+ possède leplus petit rayon ionique et la plus grande densité de charge (Tableau 1). L’ion Mg 2+ ensolution aqueuse a tendance à organiser les molécules d’eau autour de lui : il forme ainsiavec l’eau un complexe structuré en une sphère d’hydratation interne de 6 moléculesd’eau liées par des liens électrostatiques (Wolf & Cittadini 2003, Günther 2006), entouréepar une sphère externe de 12 molécules d’eau supplémentaires (Markham et al 2002,Figure 3). Si le rayon ionique du Mg 2+ est plus petit que celui des ions Ca 2+ , Na + et K + , ilpossède le plus grand rayon hydraté. Ainsi, l’ion Mg 2+ hydraté a un volume 400 foissupérieur à celui de l’ion Mg 2+ non hydraté. Par comparaison, le facteur d’accroissementde volume du rayon hydraté n’est que de 25 pour les ions Ca 2+ et Na + , et de 4 pour l’ionK + (Maguire & Cowan 2002). De plus, le taux d’échange des molécules d’eau de lasphère d’hydratation est considérablement plus faible dans le cas du magnésium que danscelui des autres cations biologiques (Maguire & Cowan 2002, Wolf & Cittadini 2003). Enconditions biologiques, l’ion Mg 2+ est donc fortement hydraté et possède une enthalpie dedéshydratation élevée (-1922kJ/mol contre -1592 kJ/mol pour le Ca 2+ , Wolf & Cittadini2003).Figure 3 : Modèle d’arrangement des sphères d’hydratation primaires et secondaires autour d’uncation Mg 2+ (Markham et al 2002).Il résulte de cette chimie unique que les interactions biologiques du magnésium sontdifférentes de celles des autres cations. De nombreuses interactions biologiques ont lieuau travers de la sphère d’hydratation du Mg 2+ , plutôt que directement avec le cation Mg 2+ .L’eau de mer contient de fortes concentrations en magnésium (1294 mg/kg pour une eaude 35 psu, Libes 1992) (Tableau 2). Dans l’eau de mer, le magnésium hydraté est5

Introduction généralemajoritairement présent sous forme libre (87 %) ou forme une paire ionique avec dessulfates (11 %) (Garrels & Thompson 1962, Kester & Pytkowicz 1969). Lesbiogéochimistes expriment les concentrations en magnésium sous forme d’un rapportmolaire avec le calcium, indépendant de la salinité. Les temps de résidence du magnésiumet du calcium dans l’eau de mer étant relativement longs (respectivement de 13 et 1millions d’années, Lea et al 1999), le rapport Mg/Ca des eaux océaniques est relativementconstant sur une échelle de temps de l’ordre du million d’années : la valeur actuelle en estde 5,2 mol/mol, mais elle a varié au cours des derniers 540 millions d’années, atteignantdes minima de 1 mol/mol (Stanley 2006, Ries 2009). La variation du rapport Mg/Ca deseaux océaniques serait notamment liée aux variations des taux de production de la croûteocéanique, qui déterminent en partie les concentrations en Ca 2+ , K + , Mg 2+ , SO 2- 4 dansl’eau de mer et seraient responsables de ces variations (Hardie 1996).Tableau 2 : Composition de l’eau de mer (Libes 1992).2.2 LE MAGNÉSIUM DANS LES CALCITES INORGANIQUES ETBIOGÉNIQUESLes cristaux de carbonate de calcium peuvent incorporer des ions divalents autres que lecalcium dans leur maille cristalline, par substitution du calcium, en solution solide. Ceprocessus est sélectif et dépend de la taille, la charge et la polarisation de l’ion (Simkiss &Wilbur 1989). C’est notamment le cas du magnésium incorporé dans la calcite, dont ilconstitue un élément trace, mineur ou majeur 2 selon son abondance dans le cristal.D’autres cations divalents, tels que le strontium, le fer, le manganèse, le zinc, le plomb et2 Un élément est considéré comme présent à l’état de traces lorsque sa concentration est inférieure au µg/g(ou ppm), tandis qu’il est dit majeur lorsqu’il est présent à des concentrations supérieures au mg/g, etmineur lorsqu’il est présent à des concentrations intermédiaires.6

Introduction généralele baryum, peuvent aussi être substitués au calcium dans la calcite (Weber 1969,Auernheimer & Chinchon 1997, Reeder et al 1999). La substitution en solution solideinduit une déformation de la maille cristalline, dont la modification des paramètres estproportionnelle au taux de substitution et détectable en diffraction des rayons X(Goldschmidt et al 1955, Goldsmidth & Graf 1958). De ce fait, elle influence la stabilitéde la calcite formée : à partir d’une concentration de 8 à 12 mol% de MgCO 3 (la valeurexacte étant encore indéterminée à ce jour), les calcites magnésiennes sont plus solublesque les aragonites, et voient leur solubilité augmenter avec leur concentration enmagnésium (Andersson et al 2008, Figure 4). L’inclusion d’autres ions influence aussicette solubilité.De plus, il a récemment été démontré que les groupements carbonates peuvent êtresubstitués par des sulfates dans la calcite, provoquant un agrandissement des paramètresde la maille (Kontrec et al 2004).Figure 4 : Solubilité de la calcite dans l’eau de mer en fonction de sa concentration en magnésium ;les symboles pleins représentent les calcites biogéniques, tandis que les symboles vides représententles calcites synthétiques (d’après Morse et al 2006).La substitution du calcium par le magnésium est régie par des lois physico-chimiquesdans les calcites inorganiques, mais on observe dans les calcites organiques des déviationspar rapport à ces prédictions purement physico-chimiques, regroupées sous le termed’effets vitaux par les biogéochimistes. Les principaux facteurs affectant la précipitationdes calcites inorganiques et biogéniques et le taux de substitution du magnésium dans cesminéraux sont développés dans la section suivante.7

Introduction générale2.2.1 Facteurs contrôlant la concentration en magnésium dans les calcitesinorganiques2.2.1.1 Composition de la solution de précipitationEn conditions inorganiques, les lois thermodynamiques et cinétiques gouvernent lesréactions de précipitation en solution. A température et pression normales, la mise enprésence de calcium et de bicarbonate en solution sursaturée résulte en la précipitation decalcite. Parmi les formes stables du carbonate de calcium à température et pressionambiantes, cette polymorphe est la moins soluble, suivie par l’aragonite ou par la calcitemagnésienne selon son contenu en magnésium (Andersson et al 2008). La présenced’autres ions dans la solution de précipitation, comme c’est systématiquement le cas enmilieu naturel, influence les propriétés du minéral formé (Morse & Mackenzie 1990). Parexemple, la présence de magnésium dans cette solution exerce une forte influence sur lapolymorphe de carbonate de calcium précipitée: en présence de fortes concentrations dece cation (comme c’est le cas dans l’eau de mer), la formation d’aragonite est favoriséepar rapport à celle de la calcite (Kitano 1962, Kitano & Hood 1962, Lippman 1973, Razet al 2000). En effet, l’ion magnésium entouré de sa sphère d’hydratation s’adsorbe sur lasurface du nucléus de calcite en croissance (Lippman 1973). Son incorporation dans lamaille de la calcite requiert une énergie de déshydratation élevée et crée une barrièreénergétique inhibant la croissance ultérieure de la calcite (Raz et al 2000, Loste et al2003). Par contre, suite à des contraintes stériques, l’aragonite n’incorpore pas l’ionmagnésium hydraté dans sa structure orthorhombique (sa structure est trop dense pourincorporer la large sphère d’hydratation de cet ion, Addadi & Weiner 1992). Ellecristallise sans barrière cinétique en solution sursaturée. En présence de magnésium, lesystème en équilibre résulte donc en une précipitation nette d’aragonite.Des calcites magnésiennes peuvent toutefois être précipitées dans des solutions au rapportMg/Ca élevé (supérieur à 4 :1), en augmentant la sursaturation de la solution ce quiaccélère la cinétique de réaction (Loste et al 2003). Lors de ces précipitationsinorganiques in vitro, la présence d’une phase transitoire de CCA a été mise en évidence.Cette phase est instable et tend à se transformer en une forme cristalline plus stable parexpulsion de l’eau (Raz et al 2000). La concentration en magnésium de cette phasetransitoire amorphe est principalement déterminée par le rapport Mg/Ca de la solution de8

Introduction généraleprécipitation, et détermine celui de la phase cristalline subséquente (Loste et al 2003).Cette conclusion est en désaccord avec celle d’Oomori et al (1987), selon lesquels lerapport Mg/Ca de la solution de précipitation n’aurait qu’une faible influence sur lerapport Mg/Ca de la calcite formée, principalement déterminé par la température.Selon Meldrum & Hyde (2001), le type de polymorphe formé dépendrait aussi de lavitesse de croissance du minéral, elle-même dépendante de plusieurs autrescaractéristiques de la solution de précipitation, telles que les conditions de saturation et laconcentration en carbonates (Morse & Mackenzie 1990, Lopez et al 2009). Cettehypothèse permet d’expliquer la variabilité de la concentration en magnésium des calciteshautement magnésiennes formées dans une solution riche en magnésium.2.2.1.2 TempératureLes lois de la thermodynamique prédisent que la substitution du calcium par lemagnésium dans la formation de la calcite dépend de la température. Toute réaction àlaquelle est associé un changement d’enthalpie (∆H 0 ) serait sensible à la température,comme l’exprime l’équation de Van t’Hoff : d ln K/ d (1/T) = - ∆H/Roù T= température en °KR=constante des gazK= constante d’équilibreLes réactions avec la plus grande valeur de ∆H 0 auront la plus grande dépendance vis-àvisde la température.La substitution isomorphique du calcium par le magnésium dans la calcite est caractériséepar un ∆H 0 de 21 kJ/mol (Lea 2003). C’est donc une réaction endothermique favoriséeaux températures élevées. L’équation de Van t’Hoff permet de prédire une augmentationexponentielle du rapport Mg/Ca en fonction de la température (Lea et al 1999, Lea 2003),et de la chiffrer à 3 % par °C entre 0 et 30 °C. Des expériences in vitro sur des calcitesinorganiques confirment que la concentration en magnésium incorporé dépend de latempérature (Katz 1973, Oomori et al 1987).9

Introduction générale2.2.2 Facteurs contrôlant la concentration en magnésium dans les calcitesbiogéniquesLes concentrations en magnésium des calcites biogéniques peuvent largement surpassercelles des calcites de synthèse et des « ciments inorganiques» de calcite magnésienneprécipités à partir de l’eau de mer (Mucci & Morse 1983 dans Cheng et al 2007). Desconcentrations en magnésium élevées ont par exemple été rapportées dans les spicules etles squelettes massifs d’éponges (respectivement 12,9 mol% de MgCO 3 , Jones & Jenkins1970, et 19 mol%, Hooper & van Soest 2002), chez certains foraminifères (21 mol% deMgCO 3 , chez les milioides, Bentov & Erez 2006) et chez les échinodermes (avec unemoyenne variant de 13,5 à 16 mol% selon la classe considérée, avec des maxima de 43,5mol% de MgCO 3 mesurés dans les parties très hautement magnésiennes de la dentd’oursin, Weber 1969, Schroeder et al 1969). Il existe également des calcites biogéniquesavec des concentrations en magnésium relativement faibles, tels les tests de certainsforaminifères planctoniques, qui contiennent moins de 0,1 mol% de MgCO 3 (Bentov &Erez 2006).La concentration en éléments mineurs ou traces dans les calcites biogéniques est engénéral le résultat de la superposition d’effets biologiques à des effets de l’environnementsimilaires à ceux affectant les calcites inorganiques (Weiner & Dove 2003). En plusd’être strictement dépendante du type de polymorphe de carbonate de calcium déposé, laconcentration en magnésium squelettique d’un organisme varie systématiquement selondifférents facteurs dont les principaux sont la température, la salinité, le pH et laconcentration en magnésium dans la solution de précipitation. L'importance relative deces différents facteurs dans la détermination des concentrations en magnésiumincorporées dans les calcites biogéniques est encore mal connue.2.2.2.1 TempératureTout comme celle de la calcite inorganique, la concentration en magnésium des calcitesbiogéniques est fortement influencée par la température. Clarke & Wheeler (1922) sontles premiers à relever la corrélation positive entre la concentration en magnésium dusquelette de certains invertébrés marins et la température de l’eau dans laquelle vivent cesorganismes (Chave 1954, Figure 5).10

Introduction généraleFigure 5 : Concentrations en magnésium dans les calcites squelettiques d’organismes de diverstaxons en fonction de la température (Mackenzie et al 1983, d’après les données de Chave 1954).Dans le contexte actuel de changement climatique global, de nombreux chercheurs se sontpenchés sur cette relation entre chimie des squelettes de calcite et température de l’eau, envue d’une éventuelle exploitation de ces squelettes en tant qu’archive naturelle du climatpouvant pallier aux limitations temporelles des enregistrements instrumentaux. L’analysedu rapport Mg/Ca des tests de foraminifères a fait l’objet d’une attention toute particulièreau cours des années 1990 et est devenu un traceur fiable et reconnu des paléotempératures(Rosenthal et al 1997). Les tests de foraminifères sédimentent en grand nombre sur lesfonds marins, où ils s’accumulent et sont relativement bien conservés dans les rochessédimentaires. Pour différentes espèces de foraminifères, les relations spécifiques entre lerapport Mg/Ca du test et la température de l’eau ont été établies pour des spécimensélevés en aquarium ou récoltés en milieu naturel dans des pièges à particules (Nürnberg etal 1996, Lea et al 1999, Anand et al 2003, Kisakürek et al 2008, Regenberg et al 2009)puis utilisées sur des spécimens de carottes sédimentaires. Une calibration valable pourune dizaine d’espèces planctoniques actuelles et les familles sub-fossiles et fossilesapparentées a ainsi pu être établie (Mg/Ca=0,38×exp(0,090T), Anand et al 2003,Figure 6). Selon cette calibration, le rapport Mg/Ca augmente de 9,0 ± 0,3 % par °C, et latempérature de calcification peut être estimée avec une exactitude de 1,2 °C. Parcomparaison avec des données obtenues à partir d’autres traceurs (rapports isotopiques),cette relation a pu être vérifiée sur des échantillons sédimentaires riches en foraminifères.Elle peut néanmoins être légèrement affectée par la dissolution partielle des microfossiles(Henderson 2002).11

Introduction généraleFigure 6 : Calibration de la relation entre la température et le rapport Mg/Ca établie pour 11 espècesde foraminifères planctoniques (Mg/Ca=0,38×exp(0,090T), d’après Anand et al 2003).2.2.2.2 Rapport Mg/Ca de l’eau de merComme en conditions inorganiques, le rapport Mg/Ca de l’eau de mer influence celui descalcites biogéniques qui y sont formées (Lorens & Bender 1980, Ries 2004, Segev & Erez2006, Stanley 2006). Des études expérimentales réalisées sur divers organismescalcifiants (moules, oursins, crabes, crevettes, serpules et algues corallines) ayant grandi àune même température dans des eaux de mer artificielles aux rapports Mg/Ca contrastés(de 1 à 6,7 mol/mol) démontrent que les rapports Mg/Ca des calcites formées sont enrelation directe mais non linéaire avec le rapport Mg/Ca de l’eau de mer (Lorens &Bender 1980, Ries 2004, 2006).Cette propriété a été appliquée dans le cadre de reconstructions paléo environnementalesdu rapport Mg/Ca des eaux des océans anciens, via l’analyse du rapport Mg/Ca de testsd’oursins fossiles datant du Phanérozoïque (Dickson 2002, 2004). Les résultats obtenusconcordent avec les reconstructions effectuées par d’autres méthodes.2.2.2.3 Autres facteurs environnementauxSalinité. Fergusson et al (2008) ont observé que la calcite des foraminifèresméditerranéens présente des rapports Mg/Ca particulièrement élevés, et en ont conclu queles hautes salinités pouvaient avoir un impact important sur l’incorporation du12

Introduction généralemagnésium. Par contre, Hoogaker et al (2009) réfutent cet effet direct de la salinité etattribuent cet accroissement de la concentration en magnésium à une contamination de lacalcite squelettique par des surcroissances de calcite inorganique. Chez des foraminifèrescultivés en laboratoire, la salinité affecte significativement le rapport Mg/Ca de la calcitedéposée, mais reste un facteur de détermination secondaire en comparaison de latempérature: pour une élévation de salinité de 1 psu, le rapport Mg/Ca augmente de 2,3 à5 % selon l’espèce considérée (Lea et al 1999, Kisakürek et al 2008, Dueñas-Bohòrquezet al 2010). Par contre, la composition en magnésium de la calcite squelettiqued’ostracodes ayant grandi à différentes salinités n’est pas affectée par la salinité (DeDeckker et al 1999).pH. L’influence du pH sur le rapport Mg/Ca des calcites biogéniques est controversée.Des réponses contradictoires aux variations de pH ont été observées chez lesforaminifères (Dissard et al 2010). Certaines études rapportent une relation inverse entrepH et Mg/Ca dans la calcite des foraminifères (Lea et al 1999), tandis que d’autressuggèrent une absence d’effet aux pH océaniques moyens actuels mais une diminutiondrastique à des pH inférieurs à 8,0 (Russel et al 2004, Kisakürek et al 2008).Etat de saturation de l’eau de mer. Il a également été proposé que la concentration enmagnésium dans la calcite soit liée au niveau de saturation de l’eau de mer 3 . Une relationentre ces facteurs a été suggérée pour des algues corallines et attribuée à une différence deleur vitesse de croissance (Agegian 1985 dans Morse & Mackenzie 1990). Par contre,plusieurs expériences de culture de foraminifères en conditions contrôlées n’ont montréaucune dépendance significative du rapport Mg/Ca dans la calcite vis-à-vis de l’état desaturation de l’eau de mer (Raitzsch et al 2010, Dueñas-Bohòrquez et al 2010, Dissard etal 2010). De plus, selon Lopez et al (2009), le niveau de saturation de l’eau de mer, mêmes’il affecte la vitesse de croissance de la calcite, n’aurait pas d’influence sur laconcentration en magnésium qui y est incorporé à une température donnée.3 Le niveau de saturation de l’eau par rapport à un minéral carbonaté, Ω, est défini comme étant le produitdes activités des ions calcium, magnésium et carbonates en solution divisé par la constante de solubilité duminéral considéré. Lorsque Ω=1, le minéral est dit en équilibre thermodynamique avec l’eau de mer, c’està-direque ses réactions de dissolution et de précipitation s’équilibrent mutuellement. Dans une solution deΩ < 1 (sous-saturée par rapport au minéral considéré) et Ω > 1 (sursaturée), les réactions de dissolution etde précipitation sont, respectivement, favorisées.13

Introduction générale2.2.2.4 Effets vitaux et contrôle biologiqueDes minéraux d’une même polymorphe déposés par des organismes différents vivant dansles mêmes eaux, et donc subissant des conditions environnementales semblables, peuventprésenter des concentrations différentes en magnésium (Chave 1954). Ces valeurs ne sontdonc pas en équilibre avec les conditions physico-chimiques des eaux environnantes,comme elles le seraient pour une calcite inorganique. Ceci indique que des effetsbiologiques s’additionnent aux influences environnementales (Lowenstam & Weiner1989). Les déviations induites biologiquement par rapport à un comportement purementthermodynamique sont regroupées sous le terme d’effets vitaux (Weiner & Dove 2003,Fergusson et al 2008).Le terme « effets vitaux » recouvre à la fois des facteurs distaux et proximaux. Lespremiers sont liés à la physiologie de l’organisme et seules des corrélations peuvent êtreétablies entre eux et la concentration squelettique en magnésium. Les secondscorrespondent aux structures et processus directement impliqués dans labiominéralisation. Dans ce cas, des relations de cause à effet peuvent parfois être établies.Le principal facteur distal étudié à ce jour est la vitesse de croissance du squelette. Celleciest corrélée à la concentration en magnésium du squelette chez de nombreuses espèces(Weber 1973, Kolesar 1978). Or, la vitesse de croissance dépend de nombreux facteurs,environnementaux (température) et biologiques (ontogenèse, disponibilité de lanourriture, état reproducteur). Par exemple, chez certains foraminifères, le rapport Mg/Cade la calcite varie durant la vie de l’individu, en fonction de la vitesse de croissance, ellemêmefonction de la température mais aussi de la taille (Elderfield et al 2002, Hintz et al2006) ; de plus, ce rapport diffère entre les processus de formation d’une nouvellechambre du test et l’épaississement secondaire de celle-ci (Erez 2003). De manièregénérale, les interactions entre ces différents facteurs distaux sont encore très malcomprises.Les deux principaux facteurs proximaux impliqués dans l’incorporation du magnésiumsont la matrice organique de biominéralisation et les mécanismes de contrôles de laconcentration en magnésium dans le site de minéralisation (Bentov & Erez 2006).Matrice organique de minéralisation. La matrice organique de minéralisation est définiecomme tout matériel organique inclus ou bordant la phase minérale et affectant laminéralisation. Elle est constituée d’un assemblage complexe de protéines,polysaccharides, et lipides intimement associés à la phase minérale (Addadi & Weiner14

Introduction générale1992, Albeck et al 1996, Ameye et al 2001, Farre & Dauphin 2009). Ces macromoléculesreprésentent généralement une faible proportion du poids sec du squelette, variant de 0,1 à5 % de ce dernier selon l’organisme considéré, mais peuvent représenter jusqu’à 45 % dupoids sec du squelette chez certains Crustacés (Swift et al 1986, Welinder 1974). Malgréleur faible abondance relative, ces macromolécules jouent un rôle essentiel dans labiominéralisation, exerçant un contrôle direct sur la nucléation, la croissance, lapolymorphe et la morphologie du minéral déposé (Simkiss & Wilbur 1989). Cesmolécules peuvent être extraites par décalcification du minéral (dans l’EDTA parexemple), et sont séparées en fractions soluble et insoluble dans l’EDTA. Que ce soitchez les échinodermes, les foraminifères ou dans la couche calcitique de la coquille desmollusques, la fraction soluble est principalement constituée de protéines présentant uncaractère acide, lié à leur richesse en acides aspartique et glutamique (Weiner 1979).Même si elles présentent des caractéristiques chimiques communes entre les différentsgroupes calcifiants (Weiner & Addadi 1997), les protéines de la matrice debiominéralisation ont des compositions en acides aminés spécifiques (Albeck et al 1993).Ces protéines, et dans certains cas les polysaccharides sulfatés qui leur sont associés,peuvent interagir avec le calcium, grâce à leurs groupements carboxyles présentant defortes affinités pour cet ion, de manière à initier une nucléation orientée (Wilbur &Bernhardt 1984, Addadi et al 1987, Addadi & Weiner 1985, 1992).Les molécules de la matrice interviennent dans la détermination du type de polymorpheformée (Falini et al 1996, Levi et al 1998, Feng et al 2000, Takeuchi et al 2008). Lesmacromolécules extraites de la couche de calcite de la coquille de mollusque induisent laformation de calcite tandis que celles extraites de la couche aragonitique induisent laformation d’aragonite (Falini et al 1996, Feng et al 2000). Dans des expériences decristallisations en présence de magnésium, les additifs organiques (tels que lespolysaccharides et les polymères d’acides carboxylique et aspartique) favorisent laformation de calcite par rapport à celle d’aragonite (Kitano & Kanamori 1966, Wada et al1999, Meldrum & Hyde 2001, Takeuchi et al 2008).En plus de contrôler la polymorphe déposée, les molécules de la matrice organiquesemblent aussi hautement impliquées dans l’incorporation de hautes quantités demagnésium dans les calcites biogéniques. Robach et al (2006) ont en effet mis enévidence un parallélisme entre les distributions spatiales du magnésium et des protéinesde la matrice riches en acides aspartiques dans la calcite très hautement magnésienne dela dent d’oursin (contenant jusqu’à 43,5 mol% de MgCO 3 ). De plus, la présence de15

Introduction généralemacromolécules extraites de biominéraux (ou de molécules synthétiques équivalentes)induit in vitro la formation de cristaux aux contenus en magnésium supérieurs à ceux decristaux produits en l’absence de telles molécules (Kitano & Kanamori 1966, Raz et al2000, Stephenson et al 2008). Aucune relation quantitative entre la concentration et lanature précise de ces macromolécules et la concentration en magnésium du minéralprécipité n’a toutefois encore été établie.La matrice organique peut agir de différentes façons sur l’incorporation du magnésium :elle peut agir sur la vitesse de précipitation, la déshydratation du magnésium et lastabilisation temporaire d’une phase précurseur de CCA, plus apte à incorporer des ionsMg hydratés, qui se transforme ensuite en une phase cristalline qui conserve uneconcentration élevée en magnésium.Stephenson et al (2008) observent que la présence d’un peptide acide favorise fortementl’incorporation du magnésium dans la calcite formée in vitro, et suggèrent que cet effetest lié à une accélération de la formation de la calcite. Cet effet cinétique résulte en unediscrimination moins efficace des ions incorporés dans la maille cristalline, et parconséquent en une augmentation de la quantité de magnésium substituée au calcium. Deplus, il est possible que les peptides agissent sur le niveau d’hydratation des ions,réduisant ainsi la barrière énergétique liée à l’incorporation du magnésium (Albeck et al1993, Raz et al 2000, 2003). Elhadj et al (2006) ont en effet observé que l’accélération dela croissance de la calcite en présence de macromolécules est liée à la charge et aucaractère hydrophile de ces dernières. Les molécules de la matrice peuvent donc perturberlocalement la structuration de la sphère d’hydratation du magnésium en solution, etréduire ainsi la barrière d’énergie liée à son incorporation dans la calcite en croissance. Lemécanisme précis en est encore mal connu, mais une étude récente a démontré que ceteffet est fortement corrélé aux caractéristiques chimiques des acides organiquesimpliqués, et plus particulièrement à leurs constantes spécifiques de liaison au calciumpar rapport au magnésium (Wang et al 2009).Le passage par une phase amorphe transitoire est une stratégie largement répandue dans laformation des biominéraux (Tableau 3) et ce, malgré l’instabilité inhérente à de tellesphases. La phase amorphe transitoire, longtemps ignorée de par la difficulté de sadétection (Weiner et al 2003), a été décrite dans le cadre du processus de formation de lacalcite des échinodermes, de l’aragonite des mollusques, de la magnétite et l’apatitecontenues dans la radula des chitons (Weiner et al 2005, Jacob et al 2008).16

Introduction généraleTableau 3 : Présence de carbonate de calcium amorphe dans différents taxons. La polymorphe laplus communément déposée dans chaque taxon est indiquée en gras (d’après Addadi et al 2003).Règne/Phylum Forme du dépot FonctionsprésuméesMg/Mg+Ca(atomes%)Formes de CaCO 3 déposéespar ces organismesPlantaeCystolithes dans lesfeuilles? 0-26 Calcite, aragonite , vatérite,CCAArthropoda : CuticuleRenforce0-20 CCA, calciteCrustaceal’exocuticuleGastrolithesStockageCCAtemporairePorifera Spicule (partie interne) ? 6-17 Calcite, CCAAscidiacea Spicule (corps) Renforce les tissuset la tunique0-16 Calcite, aragonite, vatérite,CCA, monohydrocalciteEchinodermata Spicule larvaire Phase précurseur 5 Calcite, CCAPiquant d’oursin Régénération ? Calcite, CCACnidaria/Spicules Support mécanique 18 Calcite, aragonite, CCAGorgonaceaMolluscaGranulesStockage? CCA vatérireBivalviatemporaireCoquille de la larve Phase précurseur Aragonite, CCAGastropdaSpiculesRenforcer lesCCA(Nudibranchia)tissus ?Plathelminthes Corpuscules ? CCADes études récentes démontrent que les spicules des larves d’échinodermes, la dent et lespiquants d’oursins sont formés par l’intermédiaire d’un précurseur amorphe qui cristalliseensuite en calcite magnésienne (Politi et al 2004 ; Aizenberg et al 1996a, Beniash et al1997, 1999). La calcite étant l’état de plus basse énergie du carbonate de calcium, laconversion d’amorphe en calcite est favorisée thermodynamiquement (Killian & Wilt2008), procédant par des phases transitoires successives de moins en moins instables(Politi et al 2008). La stabilisation transitoire ou permanente du CCA dans les systèmesbiologiques est due à certaines macromolécules de la matrice, notamment à des protéinestrès acides, riches en acides aminés Asp, Glu, et Ser (Aizenberg et al 1996a, 2003, Politiet al 2007), et souvent glycosylées (Aizenberg et al 2003). Aizenberg et al (1996a, 2003)ont ainsi démontré que les protéines extraites de la phase permanente de CCA desspicules de l’ascidie Pyura pachydermata et de l’éponge Clathrina sp permettentd’induire la formation et de temporairement stabiliser une phase amorphe in vitro, sansautre additif. De même, les protéines riches en acide aspartique extraites de la calcite dumollusque Atrina rigida induisent la formation d’une phase de CCA in vitro et lastabilisent temporairement (Politi et al 2007). Toutefois, selon Raz et al (2003) la seuleprésence des macromolécules n’est pas suffisante pour induire la formation de CCA, quirequiert aussi la présence de magnésium en solution. Cet ion augmente le degré desursaturation de la solution, ce qui induit la précipitation de particules métastablesamorphes, cristallisant ensuite en une polymorphe déterminée par les conditionsambiantes (Raz et al 2000). Même si sa présence en solution est requise, on ignore si le17

Introduction généralemagnésium est uniquement nécessaire à l’élévation du niveau de sursaturation de lasolution ou si il intervient dans l’activité des macromolécules.Le passage par une phase amorphe favorise l’incorporation du magnésium, et la formationde calcites riches en magnésium (Raz et al 2000, Cheng et al 2007, Wang et al 2009). Eneffet, une phase amorphe hydratée facilite l’incorporation d’ions Mg 2+ partiellementhydratés (Raz et al 2000). Des expériences in vitro ont démontré que le contenu enmagnésium du cristal formé dépend de celui de la phase amorphe qui le précède, ellemêmefonction de la concentration en cet ion dans la solution de cristallisation (Loste et al2003). Il faut noter que les phases permanentes de CCA, telles qu’observées dans lesspicules de certaines ascidies et l’exosquelette des crustacés, sont hydratées (Cölfen &Mann 2003). L’eau contenue dans ces phases amorphes pourrait intervenir dans leurstabilisation (Politi et al 2006, 2008).Contrôle des concentrations ioniques dans la solution de précipitation. Commementionné dans la section 2.2.2.2, le rapport Mg/Ca de la solution de précipitation peutdirectement conditionner la concentration en magnésium du minéral formé. Le microenvironnementde cristallisation est un espace délimité, au moins en partie, par unemembrane, ce qui permet un contrôle biologique de la composition de la solution deprécipitation et des conditions de sursaturation. La concentration en magnésium de lasolution de précipitation peut ainsi être déterminée par les transporteurs du magnésium.Dans le cas des organismes marins, le rapport Mg/Ca de l’eau de mer (5,2 mol/mol) estbeaucoup plus élevé que celui des squelettes (généralement de l’ordre de 0,1 mol/mol).Les systèmes de transport doivent donc réduire la concentration relative en magnésiumdans la solution de précipitation. Etant donné la chimie particulière de cet ion (section1.1), Smith & Maguire (1998) supposent que les transports du magnésium se font via destransporteurs protéiques particuliers ou des membres non classiques de familles detransporteurs connus. Différents systèmes de transport membranaires spécifiques à cet ionont été décrits à ce jour dans les cellules eucaryotiques: des canaux de diffusion passive(Preston 1998), des échangeurs Na + /Mg 2+ , Ca 2+ /Mg 2+ , H + /Mg 2+ , Mg 2+ /Cl - et une pompeMg-ATPase (Flatman 1984, Cefaratti et al 1998, Wolf et al 2003). La cellule peut aussimodifier le rapport Mg/Ca de l’espace de cristallisation qu’elle délimite par sa membraneen modifiant les concentrations en calcium, pour lequel de nombreux systèmes detransport ont été décrits.18

Introduction générale3. MODÈLES BIOLOGIQUES ÉTUDIÉSLa présente thèse s’intéresse à des représentants de deux groupes d’organismes produisantdes squelettes en calcite magnésienne : les échinodermes et les éponges calcaireshypercalcifiées. Ce chapitre présente les caractéristiques générales de ces squelettes etleurs mécanismes de formation.3.1 LE SQUELETTE POSTMÉTAMORPHIQUE DES ÉCHINODERMES3.1.1 Structure et morphogenèseExcepté chez les holothuries où il est limité à des spicules épars, le squelette deséchinodermes est formé d’ossicules qui occupent une partie importante du derme (Hyman1955). Sauf exception, le squelette est toujours recouvert par l’épiderme. Chaque ossiculeest formé de trabécules de calcite anastomosées, structurées en un réseau minéraltridimensionnel (le stéréome) dont les pores sont remplis de tissu conjonctif (le stroma)(Figure 7).Figure 7 : Squelette d’échinoderme : stéréome à galeries d’un tubercule de l’oursin Tripneustesgratilla (Carter 1990).Le stéréome est une structure quasi exclusivement minérale de calcite magnésienne quicontient néanmoins en son sein une très faible proportion en poids (0,1 %) demacromolécules organiques intra-squelettiques (Weiner 1985, Swift et al 1986). Lestroma est constitué d’une matrice extracellulaire, de fibres, et de cellules de différentstypes (cellules immunitaires et squelettogènes, fibroblastes) (Dubois & Chen 1989)(Figure 8).19

Introduction généraleFigure 8 : Représentation schématique des parties épidermiques (E) et dermiques (D) du tégumentdes échinodermes (CY=coelomocyte, CT= tissu conjonctif, FE= pore du stéréome, ST=stéréome,SH=sclérocyte, STR=stroma, d’après Chia & Koss 1994).Le squelette postmétamorphique des échinodermes est formé juste avant lamétamorphose: les spicules larvaires (présents dans les classes des Ophiuroidea et desEchinoidea) se résorbent quasi entièrement.Les cellules squelettogènes, appelées sclérocytes, sont localisées dans le stroma. Ellesdéveloppent des processus cellulaires qui fusionnent en un syncytium au sein duquel estformée une vacuole, qui constitue le site de calcification (Märkel et al 1986, Märkel 1990,Ameye et al 1998). Les cellules y sécrètent les précurseurs du minéral, sous formeionique ou de précipités amorphes submicroniques, et les macromolécules nécessaires à laformation et la croissance du cristal (Berman et al 1988, Addadi et al 2008, Wilt et al2008). Un « granule » initial est déposé dans la vacuole et se développe en un spiculemultiradié, qui croît ensuite par des mécanismes répétés de dichotomies et d'anastomosesdes branches adjacentes, pour former le réseau bi puis tri-dimensionnel du stéréome(Gordon 1926, Killian & Wilt 2008). Le matériel organique présent dans ce site decalcification est progressivement inclus dans la calcite en croissance (Märkel et al 1986,Ameye et al 1998). L'extension du site de calcification réduit progressivement l’épaisseurdes processus cellulaires qui l'entourent, les membranes vacuolaire et cytoplasmique20

Introduction généraledeviennent très proches et finissent par fusionner, ce qui cause la rupture du manchoncytoplasmique et résulte en la formation de processus distaux qui entourent l'ossiculemaintenant extracellulaire (Dubois & Chen 1989) (Figure 9). Les sclérocytes impliquésdans la croissance préservent localement de tels processus sur les trabécules les plusextérieurs de l’ossicule, permettant ainsi une éventuelle reprise de sa croissance (Märkelet al 1986). Une fois formé, le squelette grandit par croissance périphérique des ossiculespréexistants, mais aussi par addition de nouveaux ossicules (Hyman 1955).Figure 9 : Ossicule d’échinoderme en cours de formation (côté gauche du schéma) et complètementformé (du côté droit du schéma) (d’après Märkel et al 1986).Chaque ossicule, malgré une taille parfois importante (allant jusqu’à plusieurs cm),présente, optiquement et en diffraction X, les propriétés d’un monocristal (Donnay &Pawson 1969, Nissen 1969, Berman et al 1988, Smith 1990, Magdans et Gies 2004). Iln’est pas toujours établi clairement s’il s’agit d’un vrai monocristal où le réseau estcontinu ou s’il s’agit de microcristaux hautement orientés mais séparés par desdiscontinuités du réseau.Le stéréome contient une faible proportion de molécules organiques, de l’ordre de 0,1 à0,2 % du poids sec du squelette comme c’est le cas dans le test d’oursin par exemple(Weiner 1985, Swift et al 1986, Seto et al 2004). Certaines de ces macromolécules sontincorporées dans des plans cristallins particuliers et inhibent les clivages rhomboédriquesclassiques, produisant une fracture des trabécules dite conchoïdale (Berman et al 1988,Aizenberg et al 1997). Chez les échinodermes, une phase transitoire de CCA a été décritedans le spicule de la larve d’oursin, ainsi que dans la dent et le piquant en régénérationd’oursins adultes (Beniash et al 1997, Politi et al 2004, Ma et al 2007). Cette phase est lapremière formée et cristallise ensuite en calcite magnésienne, sous le contrôle de lamatrice organique (Politi et al 2004, Killian & Wilt 2008).21

Introduction générale3.1.2 Le magnésium dans le squelette des échinodermesAu sein du groupe des échinodermes, les concentrations moyennes en magnésiumdiffèrent selon la classe considérée. Au sein d’une même communauté, les concentrationsmoyennes en magnésium des plaques coronales des échinides sont inférieures à celles desplaques des astéries (Weber 1969). Weber (1969) a ainsi rapporté une concentrationmoyenne de 13,3 mol% de MgCO 3 dans les plaques coronales d’échinides (avec desvaleurs minimales de 6,5 et maximales de 19,7 mol%) et de 16,2 mol% chez les astéries(avec des minima et maxima de respectivement 9,7 et 20,1 mol%). Au sein d’une mêmeclasse d’échinodermes, la concentration en magnésium d’ossicules homologues dedifférents genres coexistant dans un même environnement diffère également. De plus,chez les échinides, la concentration en magnésium squelettique diffère de manièresystématique chez un même individu selon l’élément squelettique considéré 4 (Chave1954, Weber 1969). Ainsi, la concentration en magnésium du test (13,4 mol% de MgCO 3 )est largement supérieure à celle des piquants (8,5 mol% de MgCO 3 , Weber 1969). Laconcentration en magnésium du stéréome a donc une composante génétique, qui pourraitêtre liée à la composition de la matrice organique de minéralisation (Weber 1969). Cetaspect est actuellement inexploré. La distribution du magnésium est généralementhomogène, excepté dans la dent et le piquant d’oursin (Weber 1969, Magdans &Gies 2004, Moureaux et al 2010). Dans le piquant par exemple, la concentration enmagnésium augmente de l’extrémité vers la base (Magdans & Gies 2004).Une relation entre la concentration en magnésium squelettique et la température de l’eau aété suggérée chez les échinodermes dès le début du siècle passé, puis confirmée par desétudes ultérieures (Clarke 1911, Clarke & Wheeler 1922, Chave 1954, Dodd 1967, Weber1969, Richter 1984). Chez les oursins Dendraster excentricus et Echynocyamus pusillusrécoltés en milieu naturel le long d’un gradient de température, la concentration enmagnésium squelettique est fortement liée à la température de l’eau (Pilkey et Hower1960, Richter & Bruckschen1998). Weber (1973) attribue l’effet de la température à unerelation entre l’incorporation du magnésium et la vitesse de croissance, elle-mêmegouvernée par la température de l’eau. Sumich & McCauley (1972) ne retrouvent pas unetelle relation entre la température et la concentration en magnésium du testd’Allocentrotus fragilis récoltés à différentes profondeurs. Par contre, se basant sur4 Une telle variation entre éléments squelettiques n’est pas observée chez les astéries et les ophiurides(Weber 1969).22

Introduction généralel’hypothèse que l’ontogenèse est comparable aux différentes profondeurs, ils attribuent lavariation en magnésium à l’âge de l’animal (déterminé par la méthode, controversée, desstries de croissance).Selon des études monospécifiques réalisées sur des oursins récoltés en milieu naturel,l’effet de la salinité sur le rapport Mg/Ca du test serait faible (Pilkey & Hower 1960),voire même négligeable en comparaison de celui de la température (Richter &Bruckschen 1998). Aucune expérience contrôlée en laboratoire n’a été menée sur leseffets de la température ou de la salinité sur l’incorporation de magnésium dans lesquelette des échinodermes.Les sources et les voies d’incorporation des éléments majeurs et mineurs du squelette deséchinodermes sont encore mal connues. Les deux sources les plus probables de calcium etmagnésium squelettiques sont l’eau de mer et la nourriture. Des expériencesd’incorporation de calcium radioactif introduit dans l’eau de mer indiquent que celui-ciest incorporé dans le squelette, tant chez les larves que les adultes (Nakano et al 1963,Dafni & Erez 1987, Lewis et al 1990).Les concentrations en magnésium et en calcium dans l’eau de mer affectent fortement leprocessus de calcification. Des expériences en conditions contrôlées démontrent que lerapport Mg/Ca du test d’oursin adultes est directement lié au rapport Mg/Ca de l’eau demer ambiante (Ries 2004). Okazaki (1956, 1961) a démontré que des larves d’oursinsdéposent des spicules triradiés anormaux dans des eaux de mer artificielles appauvries encalcium ou enrichies en magnésium par rapport à l’eau de mer.Les échinodermes sont considérés comme étant osmoconformes avec l’eau de mer, maisrégulent les concentrations en potassium et calcium dans le liquide coelomique (Stickle &Diehl 1987). Par contre, la concentration en magnésium dans le liquide coelomique n’estpas régulée (Vidolin et al 2007).3.2 LES SQUELETTES DES ÉPONGES CALCAIRESLes éponges peuvent produire des éléments squelettiques variés, à savoir des spicules, unsquelette massif, des écailles, des plaques, des ciments et des granules (Wood 1991).Dans la présente introduction, nous nous limiterons à décrire les spicules, largementrépandus au sein du taxon, et le squelette massif, une structure basale de calcite oud’aragonite relativement rare parmi les espèces actuelles mais largement représentée dansles groupes fossiles. En raison du nombre limité d’espèces hypercalcifiées actuelles, et23

Introduction généraled’une niche écologique restreinte et difficile d’accès, les processus de formation dusquelette massif de ces éponges sont relativement mal connus. Par contre les mécanismesde formation des spicules sont quant à eux relativement bien décrits dans la bibliographie,et permettent de se faire une première idée des mécanismes de biominéralisation chez leséponges calcaires.3.2.1 Les spicules calcairesLes spicules sont de petites pièces squelettiques situées dans le mésohyle 5 qui fournissentune structure de support pour les cellules. Selon la classe considérée, les spicules peuventêtre calcaires (chez les Calcarea) ou siliceux (chez les Hexactinellides et lesDémosponges) (Harrisson & De Vos 1991). Nous ne détaillerons dans la présenteintroduction que les caractéristiques des spicules calcaires, très différents des spiculessiliceux au niveau de leur forme, de leur microstructure et de leur formation (Jones 1979).De morphologie moins variable que celle des spicules siliceux, les spicules calcairespeuvent néanmoins être de diverses formes. Ils possèdent de 1 à 4 axes, ou rayons, et sontdésignés en fonction de ce nombre comme étant des monoaxones, diactines, triactines outetractines.Ils sont composés de calcite magnésienne dont la concentration en magnésium varie de5,2 à 12,9 mol% en fonction de l'espèce considérée (Jones & Jenkins 1970). ChezClathrina sp., une phase de CCA, probablement stabilisée in vivo par une matriceorganique, a été décrite (Aizenberg et al 1996a, Sethman et al 2006, Sethman & Wörheide2008). La présence de matériel organique au sein de la calcite des spicules a étédémontrée par l’observation, en diffraction X, de légères imperfections dans la maillecristalline, provoquées par l’intercalement au sein du cristal des macromoléculesspécialisées de la matrice (Aizenberg et al 1996b). Les spicules calcaires présentent uneextinction uniforme entre nicols croisés et peuvent être considérés comme desmonocristaux de calcite ; s’ils sont formés de multiples cristaux, ces derniers sont dès lorsparfaitement alignés (Jones 1955 in Ledger & Jones 1977, Jones 1979).La croissance des spicules calcaires a été étudiée dans trois genres différents (Sycon,Clathrina et Leucosolenia) et s’y déroule selon des processus similaires (Ledger & Jones1977). Les cellules spécialisées formant les spicules, appelées sclérocytes, sont des5 Le mésohyle est l’espace intersticiel situé entre les deux feuillets cellulaires constituant le corps deséponges, à savoir le pinacoderme et le choanoderme (Figure 10).24

Introduction généralecellules mobiles du mésohyle dérivant des pinacocytes. Les monoaxones sont déposésentre deux sclérocytes, tandis que les triactines sont formés au sein d'un groupe de 6sclérocytes, qui s’associent par paire pour former chaque rayon. De manière générale, lesmonoaxones grandissent à l'une de leurs deux extrémités, tandis que les triactinesgrandissent du centre vers l'extrémité de leurs différents rayons (Ilan et al 1996). Laspiculogénèse des éponges calcaires est intercellulaire, mais a néanmoins lieu dans unespace confiné, limité par des membranes (Ledger 1975, Ledger & Jones 1977).Figure 10 : Représentation schématique de l’organisation classique des tissus d’une éponge(bs=basopinacocyte, ch=choanocyte, me=mésohyle, sp=spicule, sc=sclérocyte, ex= exopinacocyte,les flèches représentent la circulation de l’eau, d’après Boury-Esnault & Rützler 1997).La spiculogenèse commence par la formation de la cavité intercellulaire, délimitée par ungroupe de sclérocytes reliés entre eux par des jonctions septées (Figure 11). Ces cellulesspécialisées s’associent par paires pour déposer le primordium du futur rayon de spicule:une de ces cellules, appelée fondatrice, est responsable de l’élongation du rayon, tandisque l’autre cellule, dite épaississante, assure la croissance en épaisseur. Pendant cettecroissance, le manchon cytoplasmique devient de plus en plus fin et se rompt par endroits.Une fois sa croissance achevée, le spicule se retrouve donc au contact de la matriceextracellulaire du mésohyle.25

Introduction généraleFigure 11 : Schéma représentant la formation d’un rayon de spicule chez l’éponge Sycon ciliatum(ic=cavité intercellulaire, m=mésohyle, p=primordium du futur rayon de spicule, sj=jonctionsseptées, d’après Ledger et Jones 1977).La formation du minéral dans un espace isolé du milieu extérieur permet un contrôle strictde la composition ionique du milieu de cristallisation (Albeck et al 1993, Uriz 2006,Aizenberg et al 1995), qui n’est pas forcément identique à celle de l’eau de mer (Jones &Jenkins 1970). Des expériences d’incubation dans de l’eau de mer enrichie au 45 Cadémontrent que cette dernière est une source de calcium spiculaire (Bavestrello et al1994). On ignore quels sont les processus de transport des ions. Jones (1979) suggèrequ’ils pourraient être directement prélevés dans l’eau au travers de l’exopinacoderme.3.2.2. Les squelettes massifsUne vingtaine d’espèces d’éponges actuelles produisent, en plus des spicules, unexosquelette basal massif en calcite ou en aragonite. La surface apicale de ce squelette estrecouverte par les fins tissus de l’éponge, classiquement structurés en un fin feuilletcellulaire externe, le pinacoderme, et un feuillet cellulaire interne, le choanoderme,entourant le mésohyle (Figure 12).Ces éponges, dites hypercalcifiées, étaient largement répandues au cours du Paléozoïqueet du Mésozoïque, ainsi qu’en attestent leurs enregistrements fossiles abondants (Jacksonet al 2007). Groupe de bâtisseurs de récifs, elles ont été supplantées à la fin duMésozoïque par les coraux, constructeurs de récifs plus compétitifs grâce à leurszooxanthelles symbiotiques. Certains taxons ont survécu dans des habitats cryptiques oùils sont en partie soustraits à cette compétition (Vacelet et al 2002). Les espèces actuellessont majoritairement tropicales, et sont relativement abondantes à des profondeurs de 60 à120 mètres, où elles occupent en général des micro-cavités de récifs, des grottes ou ledessous de surplombs (Hartman & Goreau 1970, Lang et al 1975, Willenz & Pomponi1996). Les éponges hypercalcifiées ne forment pas un ensemble monophylétique. Le26

Introduction généralesquelette massif est en effet apparu de manière indépendante à la fois chez les Calcarea etles Démosponges (Vacelet 1981, 1985).Figure 12 : Schéma de l’organisation de la démosponge Ceratoporella nicholsoni : organisation destissus vivants (en jaune et orange) à la surface du squelette d’aragonite (en bleu). Les flèchesreprésentent les courants d’eau inhalants et exhalants (Willenz & Hartman 1989).Le squelette massif est composé de cristaux d’aragonite ou de calcite magnésienne. Il estproduit indépendamment des spicules, et peut être de même minéralogie ou deminéralogie différente par rapport à ces derniers (certaines démosponges produisent unsquelette d’aragonite en plus de leurs spicules siliceux). Les processus de formation dessquelettes massifs, quelle que soit leur polymorphe, sont encore mal connus. Chez lamajeure partie des éponges hypercalcifiées, la biominéralisation est exclusivementextracellulaire : les basopinacocytes sécrètent du carbonate de calcium sur le squelettemassif préexistant (Jones 1979, Willenz & Hartman 1989, Wörheide et al 1996, Reitner &Gautret 1996, Reitner et al 1997, Reitner et al 2001). Ce processus extracellulaire,néanmoins délimité par la membrane des basopinacocytes et la surface du squelette, adonc lieu dans un micro-environnement isolé du milieu extérieur. La seule exceptionactuellement connue est la démosponge Astrosclera willeyana. Chez cette espèce, labiominéralisation débute dans des cellules spécialisées du mésohyle. Les cristauxsphérulitiques formés sont ensuite transportés dans l’espace extrapinacodermal (espacesitué entre les basopinacocytes et le squelette basal aragonitique déjà formé), et la27

Introduction généralecroissance cristalline se poursuit extracellulairement, par des processus épitaxiaux(Wörheide et al 1996, 1997, Wörheide 1998). Les basopinacocytes sécrètent dansl’espace de minéralisation un mucus hautement acide, riche en macromolécules liant lecalcium et qui joue le rôle de matrice organique avant d’être incorporé dans le cristal enformation (Bergbauer et al 1996, Lange et al 2001). Les spicules peuvent, selon certainsauteurs, être incorporés dans le squelette massif en croissance (Hartman & Goreau 1975,Reitner 1989, Vacelet 1991, Wood 1991).Ces squelettes sont sécrétés à des vitesses extrêmement lentes, qui ont pu être déterminéspour plusieurs espèces de démosponges grâce à des méthodes directes (colorants) etindirectes (datations au 210 Pb et 14 C). Selon l’espèce considérée, des croissances de 100 à300 µm/an ont été mesurées (Willenz & Hartman 1985, 1999, Benavides & Druffel 1986,Reitner & Gautret 1996, Wörheide 1998). A partir de ces vitesses de croissance, Lesdurées de vie des éponges hypercalcifiées ont été estimées. Elles peuvent atteindreplusieurs siècles chez certaines espèces. Avec de telles durées de vie et une représentationrelativement abondante dans les séries fossiles, ces éponges sont apparues comme desarchives climatiques potentielles, permettant des analyses à haute résolution (Swart et al1998, Lazareth et al 2000). Plusieurs études récentes se sont donc penchées sur lesrelations liant la composition chimique de ces squelettes aux conditionsenvironnementales dans lesquelles ils sont formés. La majorité de ces études se sontfocalisées sur l’incorporation des isotopes stables de l’oxygène et du strontium dans lesespèces aragonitiques, des processus fortement influencés par la température dans lesquelette d’Astrosclera willeyana et de Ceratoporella nicholsoni (Böhm et al 1996, 2000,Wörheide 1998, Rosenheim et al 2004, 2005a, 2005b, 2009, Fallon et al 2005). A l’heureactuelle, il n’existe pas d’étude consacrée à la relation liant la température et lacomposition chimique des squelettes massifs de calcite magnésienne, dont lesconcentrations en magnésium peuvent atteindre 19,9 mol% de MgCO 3 , comme c’estnotamment le cas chez Spirastrella (Acanthochaetetes) wellsi (Wendt 1979).28

Buts du travailBUTS DU TRAVAILDans le contexte actuel de changement global, la composition en magnésium dessquelettes calcitiques est fréquemment utilisée en tant qu’archive naturelle des conditionsenvironnementales du passé. Par ailleurs, la solubilité de la calcite étant fonction de saconcentration en magnésium, cette dernière est un facteur déterminant pour la pérennitédes organismes les synthétisant dans un océan en cours d’acidification. Une parfaitecompréhension des mécanismes d’incorporation de cet élément est donc requise.La concentration en magnésium des calcites biogéniques est influencée par les conditionsenvironnementales régnant au moment de leur dépôt. La température joue un rôleprépondérant dans la détermination de l’incorporation de cet élément. Cependant, larelation entre ces deux variables n’a été caractérisée en conditions contrôlées que dansquelques groupes. L’effet de la salinité est encore peu connu. La concentration enmagnésium de ces calcites peut également être fortement influencée par lescaractéristiques biologiques de l’organisme calcifiant. En particulier, un rôle important estattribué à la matrice organique de minéralisation mais celui-ci est encore mal compris.Le but de la présente thèse est, dès lors, de contribuer à l’étude de l’incorporation dumagnésium dans les calcites magnésiennes biogéniques et des différents facteurs, tantbiologiques qu’environnementaux, susceptibles de l’affecter. Elle porte sur deux groupesaux squelettes possédant des concentrations en magnésium comptant parmi les plusélevées connues à ce jour, les échinodermes et les éponges calcaires hypercalcifiées.Dans la première partie, nous avons déterminé, par des études expérimentales enconditions contrôlées ou par l’étude de spécimens récoltés en milieu naturel, l’importancerelative des principaux facteurs environnementaux et physiologiques susceptiblesd’affecter l’incorporation du magnésium dans les squelettes de ces organismes (Chapitres1, 2 et 3).La seconde partie évalue l’implication d’une part d’un autre élément mineur, le soufre, etd’autre part des macromolécules de la matrice organique de minéralisation dansl’incorporation du magnésium (Chapitres 4 et 5).29

PREMIÈRE PARTIEFACTEURS ENVIRONNEMENTAUXET PHYSIOLOGIQUESAFFECTANT L’INCORPORATION DU MAGNÉSIUM31

Cette première partie de la thèse est consacrée à l’influence des principaux facteursenvironnementaux (température, salinité) et physiologiques (vitesse de croissance) surl’incorporation du magnésium dans les squelettes calcitiques. A l’occasion de ces travauxle strontium a également été analysé. Cet élément est fréquemment substitué au calciumdans les calcites biogéniques, mais en moindre mesure que le magnésium (Lea et al1999). De nombreuses études démontrent qu’en plus d’être affectée par le rapport Sr/Cade la solution de précipitation (Lorens & Bender 1980), l’incorporation de cet élément estprincipalement déterminée par des processus cinétiques, tant en conditions organiquesqu’inorganiques (Lorens 1981, Lorrain et al 2005, Rickaby et al 2002). Chez leséchinodermes, une seule étude a été consacrée à l’incorporation du strontium dans lesquelette. Sur base de l’analyse de tests de Dendraster excentricus récoltés en milieunaturel le long de gradients environnementaux, Pilkey et Hower (1960) ont montré unerelation inverse entre la température et le rapport Sr/Ca squelettique, et l’absence d’effetde la salinité sur ce dernier. Cependant, ces auteurs n’ont pas considéré l’influence dutaux de croissance sur ce rapport. Comme mentionné dans l’introduction générale, iln’existe pas d’études de l’effet des paramètres environnementaux sur la composition dessquelettes de calcite d’éponges hypercalcifiées. Par conséquent, j’ai saisi l’opportunitéofferte par les travaux consacrés au magnésium pour également étudier la modulation del’incorporation du strontium.33

Chapitre ICHAPITRE IGrowth rate and chemical features of the massive calcium carbonate skeleton ofPetrobiona massiliana (Baeriida, Calcaronea, Calcispongiae)Julie Hermans 1&2 , Philippe Dubois 2, Luc André 3 , Jean Vacelet 4 and Philippe Willenz 1 ∗Published in Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, June 2010, 90:749-754doi: 10.1017/S0025315409991081ABSTRACTIn addition to the spicules typically produced by sponges, about twenty hypercalcifiedspecies belonging to both classes Demospongiae and Calcispongiae secrete a massivebasal calcareous skeleton composed of calcite or aragonite. Skeletal growth rates andgrowth mechanisms are still poorly known in those hypercalcified Calcispongiae. In situcalcein staining experimentation on the Mediterranean calcisponge Petrobiona massilianarevealed a mean annual growth rate of the massive skeleton of 236 µm/yr (±90). ScanningElectron Microscopy (SEM) revealed that some spicules are entrapped within the massiveskeleton (a solid mass forming apical crests with multidirectional growth axes) during itsformation. Whole actines were observed within the massive skeleton of fracturedspecimens, indicating that they do not dissolve after entrapping. Calcein incorporationbands seen through epifluorescence microscopy and SEM morphological observations ofthe skeletal surface revealed cone shaped protuberances corresponding to active growthareas. A spatially discontinuous growth was highlighted, but the annual growth rates weresimilar at the tip of crests and at the bottom of depressions separating them. The skeletonof P. massiliana is composed of magnesium calcite with strontium as the main traceelement. Significant differences in skeletal chemistry of specimens collected in differentMediterranean locations revealed a possible temperature dependence of Mg/Ca. Althoughsuch temperature signature exists in the massive skeleton of P. massiliana, its use as an* 1Department of Invertebrates, Royal Belgian Institute of Natural Sciences, Rue Vautier 29, B-1000, Belgium2Marine Biology Laboratory, Université libre de Bruxelles, CP 160/15, Avenue F.D. Rossevelt 50, B-1050, Belgium3 Section of Petrography-Mineralogy-Geochemisty, Royal Museum of Central Africa, Leuvensesteenweg 13, B-3080 Tervuren,Belgium4 4 Centre d’Océanologie de Marseille, Aix-Marseille Université, CNRS UMR 6540 DIMAR, Station Marine d’Endoume, rue Batteriedes Lions, 13007 Marseille, France35

Chapitre Iaccurate environmental recorder is limited by several factors including multidirectionaland spatially discontinuous growth.KEYWORDS : calcium carbonate skeleton, hypercalcified sponge,Petrobiona massiliana, growth rate, Mg/Ca ratio, Sr/Ca ratioINTRODUCTIONTwenty out of ca. 10.000 Recent sponge species produce a massive basal calciumcarbonate skeleton in addition to spicules. These “hypercalcified sponges” belong to theclasses Demospongiae and Calcispongiae.In Recent seas, hypercalcified sponge species usually inhabit cryptic environments, suchas submarine littoral caves or some deep fore reefs between 60 and 120 m (Lang et al1975), with observations reported at extreme depths of 303 m and 530 m forCeratoporella nicholsoni and Vaceletia crypta respectively (Vacelet 1988). Importantskeletal fossil records revealed the large distribution of these reef builders through pastseas. During the late Mesozoic, they were supplanted by more competitive reef builders,scleractinian corals, and survived only in cryptic environments.The massive basal skeleton of hypercalcified sponges is composed of either calcite oraragonite according to the species. Only a thin veneer of soft tissues covers the apical partof this skeleton. It does not show annual density variations like coral skeleton, makingage determinations difficult. Both direct staining (alizarin red, calcein) and indirecttechniques ( 14 C and 210 Pb chronologies) have been used to determine the growth rate ofhypercalcified sponges (Dustan & Sacco 1983, Willenz & Hartman 1985 1999, Benavides& Druffel 1986). In situ staining of different Demospongiae species(Ceratoporella nicholsoni Hickson, Acanthochaetetes wellsi Hartman and Goreau,Astrosclera willeyana Lister) indicated very slow growth rates ranging from 100 to300 µm/year (Willenz & Hartman 1985 1999, Reitner & Gautret 1996, Wörheide 1998).A specimen of C. nicholsoni of 10 cm height, with a growth rate of 200 µm/year, may be500 years old (Willenz & Hartman 1999). So far, skeletal growth rate of hypercalcifiedCalcispongiae has not yet been determined.With such long lifetimes and massive skeletal development, hypercalcified spongeskeletons have been highlighted as potential past temperature recorders (Swart et al36

Chapitre I1998). Rosenheim et al (2004) showed that Sr/Ca ratio in the aragonitic skeleton ofC. nicholsoni is directly related to temperature, with higher temperature sensitivity than incoral skeletons. Hypercalcified sponges provide paleotemperature data complementary tothose inferred from coral skeleton.Although hypercalcified sponges occur usually in tropical and often deep habitats, onehypercalcified calcisponge, Petrobiona massiliana Vacelet & Lévi, is abundant inMediterranean submarine littoral caves. This species has been recorded from the Gulf ofLion to Greece at shallow depths ranging from 0.5 to 25 m (Vacelet 1964). In addition toits calcareous spicules, P. massiliana produces a calcitic massive skeleton. Skeletaldevelopment in this species is still unclear, few information being available about itsgrowth rate and patterns of growth. Reitner (1989) described a spicule incorporation inthe growing massive skeleton, followed by a diagenetic process altering the spicule in apolycrystalline structure in the oldest part of the skeleton. However, Vacelet (1991)observed whole spicules at the basal part of the skeleton.In order to improve the knowledge of the skeletal formation of hypercalcifiedCalcispongiae, we studied the morphology, growth patterns, and growth rates of thecalcitic massive skeleton of Petrobiona massiliana, an easily accessible model. Bycomparing the skeletal chemistry of specimens collected in environmentally contrastedareas, the potential of this skeleton as a temperature recorder was evaluated.MATERIALS AND METHODSSample collection, morphology and chemistry of the skeletonSpecimens of Petrobiona massiliana were collected by SCUBA diving in Mediterraneansubmarine caves located in La Vesse (Bouches-du-Rhône, France) at a depth of 11 m, inCapo Caccia (Sardinia, Italia), 18 m depth, and in Kalithea Bay (Rhodes, Greece), 2.5 mdepth. After collection, specimens were dried in an oven at 50 °C for 48 hours. Triplicatewater samples were collected at the collection site in 50 ml Nalgene vials, filtered on aMillipore 0.22 µm filter with addition of HgCl 2 and stored at 4 °C until analysis.Massive skeletons (devoid of substrate) were cleaned from associated organic tissues witha Proteinase K solution (P6556 SIGMA) in a 100 mmol/l Tris HCL buffer (pH=7.5) at37 °C for 3 hours. Cleaned skeletons were then rinsed with a thin Milli Q water spray(Broxo Jet) and dried at 50 °C for 48 hours.37

Chapitre ICleaned and uncleaned skeletons of P. massiliana collected in La Vesse (France) werefractured or sectioned with a low speed diamond saw (Labcut 1010). They were sputtercoatedwith gold-palladium and observed on a JEOL JSM-6100 or a Philips/FEI XL30ESEM TMP scanning electron microscope (SEM).For chemical analyses, 0.1 to 0.25 g cleaned skeletal samples were mineralized in aMilestone 1200 mega microwave oven in 2.5 ml HNO 3 and 1 ml H 2 O 2 . The mineralizedsolution was filtered on a GF/A Whatman filter and brought to a final volume of 25 ml.Magnesium, strontium and calcium contents of the 10 times diluted solutions and of20 times diluted seawater samples were analyzed with an Iris Advantage (Thermo JarrelAsh) Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscope (ICP-AES). Thecalibration was achieved using artificial multi-elemental solutions made from certifiedmono-elemental solutions (Merck) and using certified reference materials for qualitycheck: HPS CRM Seawater (High Purity Standard) for the seawater samples and JCp-1(coral) and JCt-1 (giant clam) (Standard Geological Survey of Japan). Results for thecertified reference materials were always within ± 10% of the certified values.In situ calcein labelling experimentationIndividual sponges, together with a small piece of their substrate, were delicatelyremoved from the rocky wall with hammer and cold chisel and cemented underwater onpolymethyl methacrylate plates with a 2 components epoxy resin (Spreadsub T260Resipoly-Chrysor). Seven to ten individuals were glued on each plate (12×12 cm). Plateswere firmly screwed on the original substrate, respecting the natural location of thesamples. In order to mark the newly deposited calcite, specimens were incubated withcalcein, a fluorochrome that binds permanently at the site of precipitation of calciumcarbonate. Two staining experiments were conducted in two littoral caves near Marseille(France): in the first one, sponges were labelled immediately after being cemented onplates (Figuier cave, FC); in the second one, they were marked after a two monthsrecovery period following their transfer on plates (La Vesse cave, LVC). Staining wasperformed in situ to reduce the sponge stress: plates were unscrewed from the substrateand gathered in a polymethyl methacrylate holder which was enclosed in a plastic bag andleft on the bottom of the cave during the incubation. Calcein, dissolved in seawater, wasinjected into bags to reach a final concentration of 100 mg/l. Bags were removed after24 hours in FC and 72 hours in LVC (Table 4). After incubation, plates were immediatelyreplaced on the wall of the caves.38

Chapitre ITable 4: Dates of transfer on plates, calcein staining, collection and total period of skeletal growthof specimens of Petrobiona massiliana in the 2 locations.Figuier Cave (FC)La Vesse Cave (LVC)Transfer on plates 16 May 2000 3 to 12 August 2004Calcein labelling 16 May 2000 28 October 2004Collection 13 July 2001 11 October 2005Growth period 393 days 348 daysPlates were collected about one year after staining. Eight to ten specimens were sacrificedand fixed in ethanol 70°. After dehydration in absolute ethanol, they were embedded inSpurr’s epoxy according to Spurr (1969) and sectioned along their principal growth axiswith a low speed diamond saw (Labcut 1010). Central sections along the main growthaxis were ground on a series of diamond grinding disks to a thickness of about 10 µm.The linear extension from calcein stained line to the edge of the massive skeleton wasmeasured under epifluorescence microscopy (Nikon Optishot-2 microscope) to calculateannual growth rate.Data analysisMean annual temperature of the field locations were obtained fromMEDAR/MEDATLAS regional datasets available on http://doga.ogs.trieste.it/medar/(MEDAR Group 2002).All statistical analyses were carried out using SIGMASTAT and SYSTAT software.Significance level was fixed at 0.05. All linear growth increments were normalized asannual growth rate prior to their analysis. Non parametric Kruskal-Wallis One WayAnalysis of Variance on Ranks tests and Wilcoxon matched pairs signed ranks test wereperformed. The relationships between temperature and skeletal element to calcium ratioswere investigated using linear regression. The comparison of element to calcium ratios ofseawater was achieved using One-way ANOVA. Data normality and homoscedasticitywere checked prior to the use of parametric tests.39

Chapitre IRESULTSThe massive skeleton of the hypercalcified calcisponge Petrobiona massiliana appears asa solid mass of calcite with crests and depressions (Figure 13.A). These crests areorganized along multi-directional axes (Figures 13.B, 13.C) and support the thin livingtissues, which cover the upper part of the skeleton and contain an abundance of spicules.Figure 13: Petrobiona massiliana (SEM): A. Longitudinal section perpendicular to surface, alongmajor growth axis (Scale bar = 1 mm) Cr: skeletal crests, D: depression of the skeleton, LT: livingtissues, S: spicules, Sk: massive skeleton, Ca: canalicules. B. Edge of massive skeleton showingmulti-directional growth of crests (Scale bar = 100 µm). C. Detail of crest edge of cleaned skeleton,showing cone-shaped protuberances (C) and multi-directional growth of a single crest around maingrowth direction (Scale bar = 100 µm). D. Detail of fractured skeleton showing entrapped spicules(ES), and imprints of some other (SI) (Scale bar = 10 µm). E. Diapason triactine entrapped duringskeletal growth (Scale bar = 10 µm). F. Skeletal pit shaped excavations (arrows), probablyoccasioned by a Cliona sp. (Scale bar = 100 µm).40

Chapitre ILongitudinal sections of the massive skeleton presented homogeneous density. Narrowcanalicules containing remains of living tissues (in uncleaned specimens) and numerousrugose diactines (30 to 40 µm length) were observed along the entire thickness of theskeletons. Fractured specimens showed various types of spicules randomly entrappedinside the massive skeleton and imprints of some other spicules, ripped during fracture(Figures 13.D, 13.E).All specimens observed in this study presented smooth and circular excavation pits intheir calcareous skeleton (Figure 13.F). The surface of the skeleton presented skeletalcone-shaped protuberances, ranging from 50 to 125 µm in height, with a smooth tipemerging from the rough surface of the skeleton (Figure 14.A). Several cone-shapedprotuberances were stained during the calcein incubation, and were totally embeddedwithin the skeleton one year later (Figure 14.B). Some free spicules were also stained, asthey were growing. One year later, these spicules were located in the superficial spiculecoat.Figure 14: Petrobiona massiliana : A. SEM : Skeletal surface of the massive skeleton. Detail of acone shaped protuberance with smooth tip (ST) emerging from the skeletal rough surface (R) (Scalebar = 10 µm). B. Epifluorescence microscopy: Cone shaped protuberance, calcein labelled (Scale bar= 50 µm).Ground sections of the skeleton of P. massiliana stained with calcein revealed a spatiallydiscontinuous labelling under epifluorescence microscopy (Figure 15). Fluorescent marksobserved were more intense in LVC specimens stained for 72 hours after a two monthrecovery period following their installation on plates. Out of a total of 18 observedspecimens, only one specimen, from FC, did not survive the experimentation.41

Chapitre IFigure 15: Petrobiona massiliana (epifluorescence microscopy): Ground section of a specimencollected one year after calcein staining (Scale bar = 50 µm). Arrows indicate growth increment.Calcein lines were observed at the tips of the skeletal crests, in flat surfaces or in skeletaldepressions. The individual mean growth from measurements on skeletal tips wascompared to those made in skeletal depressions: a Wilcoxon test revealed that both typeof measurements did not differ significantly (p=0.3).Mean annual growth rates of the massive skeleton of P. massiliana did not differ betweenlocations (Mann Withney, p= 0.646): 245 µm/yr (±116, n=50) in FC and 220 µm/yr (±34,n=41) in LVC. The global mean individual growth rate was 236 µm/yr (±90). The annualgrowth rate of the 7 LVC individuals did not differ (Kruskal Wallis One Way analysis ofVariance on Ranks, p=0.918). On the contrary, a significant variability between the 10 FCspecimens was observed (Kruskal Wallis One Way analysis of Variance on Ranks,p=0.007).Magnesium to calcium (Mg/Ca) and strontium to calcium (Sr/Ca) ratios of the massiveskeleton differed according to the collection site (Table 5). The Mg/Ca ratio (mmol/mol)showed a positive linear relationship with temperature (°C) expressed as regressionequation y=5.2x+25.3 (R 2 =0.72, p=7×10 -5 ). Seawater Mg/Ca and Sr/Ca ratios did notdiffer between locations (ANOVA, p=0.977 and p=0.746 respectively).42

Chapitre ITable 5: Skeletal Mg/Ca and Sr/Ca ratios in the massive skeleton of Petrobiona massilianaaccording to sampling sites (mean ± standard deviation, n=5).Location Latitude-Longitude Mg/Ca(mmol/mol)mean ± S.D.Sr/Ca(mmol/mol)mean ± S.D.MeanannualSST (°C)La Vesse(France)Capo Caccia(Sardinia, Italy)Kalithea Bay(Rhodes, Greece)43°20'28''N - 05°15'41''E 114.77 ± 9.07 2.27 ± 1.47×10 -2 17.6540°33'40''N - 08°09'41''E 125.98 ± 3.47 2.51 ± 2.93×10 -2 18.7336°22'49''N - 28°14'22''E 137.62 ± 2.37 2.53 ± 1.96×10 -2 21.75DISCUSSIONUp to now, growth rate of massive basal skeletons of Calcispongiae was unknown. In thepresent study, in situ calcein labelling experiments showed that the average skeletalgrowth rate of the calcisponge Petrobiona massiliana was 236 µm/yr. This value is closeto average growth rates (ranging from 100 to 300 µm/year) reported for massive basalskeletons of tropical species of Demospongiae (Ceratoporella nicholsoni,Astrosclera willeyana, Acanthochaetetes wellsi), despite the differences between tropicaland Mediterranean field conditions (Willenz & Hartman 1985, 1999, Reitner & Gautret1996, Wörheide 1998). A maximum height of 20 mm has been reported for hemisphericalshaped P. massiliana living in caves protected from hydrodynamism (Vacelet 1964). Inregards of growth rates measured in this study, and considering that growth is constant intime, lifespan of this species can be estimated to be approximately 85 years, a relativelyshort lifetime in comparison with other hypercalcified sponges, which can live severalcenturies (Swart et al 1998).Our SEM and epifluorescence microscopy observations highlighted some processesinvolved in the skeletal growth of P. massiliana. As previously described by Vacelet(1991), some calcareous spicules were entrapped within the calcitic mass during growth.These entrapped spicules (or their imprint) were also observed across the entire thicknessof fractured skeletons, confirming that spicules do not dissolve in the mass of the skeleton(Vacelet 1991). Intense calcein fluorescence was observed on the conical protuberances atthe skeleton surface, indicating that they were actively growing at the time of incubation.The discontinuous calcein lines suggest that growth was spatially discontinuous.However, growth rates were similar at the apex of skeletal crests and in skeletal43

Chapitre Idepressions or flat surfaces. Discontinuous growth could result from an inhomogeneousspatial distribution of the basopinacocytes (i.e. the skeleton forming cells), or fromdifferences in their activity. Ultrastructural studies are needed to answer these questions.Furthermore, nothing is known about the seasonal variations of the calcification rate.Physiological process could also affect energy allocated to skeletal growth. InC. nicholsoni a slower growth rate was observed in small individuals in comparison toolder specimens (Willenz & Hartman 1999).All specimens observed in SEM presented pit shaped excavations in their basal skeleton.The smooth and regular micro-patterns of these excavations are typical of boring sponges(Calcinai et al 2003). Several boring sponge species, including Aka labyrinthica,Alectona millari and Cliona sp, have been previously described in the massive skeleton ofP. massiliana (Vacelet 1964).Hypercalcified sponge skeletons have been proposed as reliable temperature recorders.Rosenheim et al (2004) calibrated a strong negative relationship between Sr/Ca andtemperature in the aragonitic skeleton of C. nicholsoni. Conversely, Rosenheim et al(2005b) showed a negative correlation between Mg/Ca ratio and temperature, andassumed that few vital effects influence elemental incorporation in the aragonitic skeletonof C. nicholsoni. This is in agreement with the statements of Böhm et al (2000) andRosenheim et al (2009), who showed that C. nicholsoni precipitates aragonite close tooxygen isotopic equilibrium. Chemical analyses revealed an important temperaturedependence of bulk skeletal Mg/Ca ratio in P. massiliana. The fitted regression ontemperature accounts for 72% of the Mg/Ca ratio variations in the skeleton of this species(R 2 =0.72). Such relationships between temperature and skeletal Mg content are wellknown in biogenic calcites (Chave 1954) and have successfully been used to reconstructpast temperatures, in combination with other skeletal temperature proxies as δ 18 O (i.e. inforaminiferal calcites, Kristjándóttir et al 2007). On a geological timescale, Mg/Ca ratiosof biogenic carbonates are also influenced by seawater Mg/Ca ratios (Ries 2004).However, considering that seawater Mg/Ca did not differ between locations, this ratiowas not involved in the trend observed here. In this study, we observed a linear increasein Mg/Ca of 5% per °C in the skeleton of P. massiliana. This value is closer to thatreported for inorganic calcite precipitation (3.1%, Oomori et al 1987) than to thatobserved in foraminiferal calcite (10%, Lea et al 1999). Our results highlight the44

Chapitre Iimportance of the thermodynamic control of magnesium incorporation in hypercalcifiedsponge skeleton. Even if skeleton deposition occurs in an organized chronological way,morphology or growth modalities can restrict the use of the skeleton of hypercalcifiedsponges as temperature recorder. For the massive aragonitic skeleton of A. willeyana, theuse of Sr/Ca ratio as a temperature recorder is limited by a thickening of the skeletalmaterial at the “living” edge of the skeleton (Fallon et al 2005).The present study allows evaluating the potential use of the massive skeleton ofP. massiliana as a reliable temperature recorder. In contrast with most hypercalcifiedsponges of the class Demospongiae, several factors as multidirectional growth axis,spatially discontinuous growth, and a relatively short lifetime complicate the use of thisspecies in high resolution temperature reconstructions.AcknowledgementsThe authors thank Dr. A. Ereskovsky, S. Fally, F. Ledda, C. Marshall, P. Paneels, P. Vande Steen, the members of “Au Delà Plongée” (La Vesse) and “The Waterhoppers”(Rhodes) diving centres for their SCUBA diving assistance. Laboratory technical supportwas provided by Ph. Pernet, L. Despontin, N. Dakhani and L. Berry.We thank H. Zibrowius who provided information to access samples in Rhodes. Thiswork was supported by a “Plan Action 2” grant (contract n°WI/36/F02) and theCALMARS II project (n° NR SD/CS/02A) from the Belgian Federal Science Policy,Brussels, Belgium. Ph. Dubois is a senior Research Associate of the National Fund forScientific Research (FRS-FNRS Belgium).45

Chapitre I46

Chapitre IICHAPITRE IITemperature, salinity and growth rate dependences of Mg/Ca and Sr/Ca ratios ofthe skeleton of the sea urchin Paracentrotus lividus (Lamarck): an experimentalapproachJulie Hermans 1&2 , Catherine Borremans 1 , Philippe Willenz 2 , Luc André 3 and Philippe Dubois 1∗Published in Marine Biology, June 2010, 157 (6): 1293-1300doi: 10.1007/s00227-010-1409-5ABSTRACTThe skeletal Mg/Ca ratio of echinoderms is known to increase with temperature but therelation has never been established in controlled experimental conditions. The presentstudy investigated the effect of temperature, salinity and growth rate on Mg/Ca and Sr/Caratios in calcite skeletons of juvenile sea urchins grown in experimental conditions.Mg/Ca ratio was positively related to temperature, increasing until a plateau at high butfield occurring temperatures. It was not linked to salinity nor growth rate. We suggest thatthis plateau is due to properties of the organic matrix of mineralization, and recommendto take it into account for the use of Mg/Ca as proxy of seawater Mg/Ca. Skeletal Sr/Caratio was mainly dependent on temperature and growth rate, as usually observed in calciteskeletons.∗ 1Marine Biology Laboratory (CP 160/15), Université libre de Bruxelles, 50 Avenue F.D. Roosevelt, B-1050, Belgium2Department of Invertebrates, Royal Belgian Institute of Natural Sciences, 29 Rue Vautier, B-1000, Belgium3 Section of Petrography-Mineralogy-Geochemisty, Royal Museum of Central Africa, 13 Leuvenstesteenweg, B-3080 Tervuren,Belgium47

Chapitre IIINTRODUCTIONEchinoderms are widely distributed benthic invertebrates playing an important role innumerous ecosystems. They are characterized by a well-developed endoskeleton made ofmonocristaline elements, the so-called ossicules, joined together by connective andmuscular fibers (for a review see Dubois and Chen 1989). The mineral phase of theskeleton is made of high-magnesium calcite in which strontium is the main trace element.It forms through a transient amorphous calcium carbonate phase (Politi et al 2004). Themineral phase contains ca 0.1 wt % of occluded organic material. This organic matrixplays a crucial role in the formation of the skeleton, controlling nucleation and crystalgrowth (Berman et al 1988).The Mg/Ca ratio in the echinoderm skeleton varies with the seawater Mg/Ca (Ries 2004)and has been used as a proxy of Phanerozoic oceanic changes (Dickson 2002) which arein turn important to evaluate secular changes in both continental silicate weatherings andoceanic seafloor alterations. It is also related to temperature and salinity (Clarke andWheeler 1922, Chave 1954, Pilkey and Hower 1960, Weber 1969, 1973, Richter 1984,Richter & Bruckschen 1998, Borremans et al 2009). The origin of the temperature effectis unclear. Weber (1969, 1973) suggested that it is mainly driven by phylogenetic factorsand growth rate. However, as most relations between the skeletal Mg/Ca ratio andtemperature of skeleton precipitation were established using field specimens mixingdifferent species (Chave 1954, Weber 1969, 1973, Dickson 2002), it is impossible todiscern temperature from physiological and genetic effects. Furthermore, salinity was nottaken into account when establishing these relations. In this respect, it is noteworthy thatthe few studies focusing on single species (but using field specimens) reported differenttrends for species and higher taxa (Richter 1984, Richter & Bruckschen 1998).In numerous taxa with a calcite skeleton, the Sr/Ca ratio is linked to growth rate (Lorrainet al 2005, Rickaby et al 2002, Stoll & Shrag 2000) but this factor is almostuninvestigated in echinoderms. Pilkey & Hower (1960) reported that the Sr/Ca ratio in thesand dollar Dendraster excentricus is inversely related to temperature, a relation usuallyencountered in aragonitic skeletons (Shen et al 1996) and positively linked to salinity.A better understanding of the factors controlling the incorporation of minor and traceelements in the echinoderm skeleton is not only important to improve the value of theskeletal Mg/Ca ratio as proxy of the seawater Mg/Ca ratio but also to infer the potential48

Chapitre IIeffects of climate change in this group. Indeed, high-magnesium calcite is among themost soluble polymorphs of crystalline biogenic calcium carbonate and taxa bearing suchskeleton will be the first to suffer of ocean acidification linked to increasing atmosphericCO 2 (Feely et al 2004, Shirayama & Thornton 2005). If higher temperatures triggered bythe same causes induce higher skeletal Mg/Ca ratios, this will further worsen the case ofthese organisms, higher magnesium levels in calcite being linked to a higher solubility(Morse & Mackenzie 1990).The present study investigated the effect of temperature, salinity and growth rate onMg/Ca and Sr/Ca ratios in the sea urchin calcite skeletons. In this purpose, juvenilesParacentrotus lividus were grown in controlled laboratory conditions.MATERIALS AND METHODSAquarium experiment. The experiment was conducted in eight independent aerated,closed circuit aquaria, containing each 100 L of natural seawater (Wimereux, Pas-de-Calais, France), circulating through three successive filters filled respectively withPerlon®, coral sand and active charcoal. Four different temperatures (13, 18, 20.5 and24 °C) and 2 salinities (36 and 39 psu), representatives of conditions in the MediterraneanSea, were imposed. The initial salinity of the seawater was modified by the addition ofMilli Q water (Millipore) and of Wiegandt seasalts. During the experiment, evaporationin the aquaria was compensated by addition of Milli Q water. Temperature, salinity andpH were measured using a WTW Multi 340i multi-meter equipped with a conductivitycell and a pH electrode. These measurements were performed daily for temperature andsalinity and twice a week for the pH. Temperature was also logged at 6-hours intervalswith Stow Away Tidbit temperature loggers (Onset) as a control. The trend of pHdecrease was compensated by the addition of NaHCO 3 . Variations of temperature, salinityand pH are summarized in Table 6. The pH mean values ranged between 7.80 ± 0.14 and7.94 ±0.12 (n=47) according to the aquarium. Low pH events never exceeded one day.Nitrites and nitrates were measured using Tetra ready-to-use tests. Values never exceeded25 mg/l. Every 2 months, water samples were collected in triplicates using acid cleanedNalgene vials and stored at -20 °C until analyses for Ca, Mg and Sr. Seawater Mg/Caratios did not differ significantly between aquaria (p Repeated measures ANOVA = 0.22). Anincrease of seawater Mg/Ca ratio along the experiment was obvious (p

Chapitre IISr/Ca ratios were different between aquaria (p ANOVA

Chapitre II29 mm in ambital diameter were allocated to each aquarium such as size frequencydistributions were identical for all aquaria (Figure 16). Significant mortality occurred in 2aquaria (13 °C and 20.5 °C, 39 psu both; 7 death individuals on an initial total of 14 and17, respectively).Figure 16: Mean ambital diameter (±S.D.) of the sea urchins at thebeginning (♦) and the end (■) of theexperiment for the different aquaria.Non growing individuals werediscarded from final distribution.Numbers indicate the final effective inthe different aquaria.At the end of the experiment, the sea urchins were dissected and the body wall separatedfrom the inner organs. The skeleton was cleaned of associated tissues with NaOH (proanalysis, Merck) 2 M in Teflon beakers at 50 °C, then rinsed 3 times with Milli Q water.They were dried at 50 °C for 48 hours. Newly formed interambulacral coronal plates(calcein unlabelled) were separated from the older ones (calcein labelled) under anepifluorescence microscope (Figure 17). Nine specimens among a total of 88 survivinganimals at the end of the experiment did not produce new skeleton. They were not furthertaken into account. New plates were weighted. Individual growth rate was calculate as theratio of the weight of newly formed interambulacral plates (mg) on growth duration (d).We considered this growth rate as the most representative measurement of growth duringthe experiment (in comparison to the increment of mean ambital diameter for eachaquarium, whose initial term is affected by sea urchin mortality and which give no accessto individual data).Field specimens. Ten adult P. lividus were collected in spring 2007 in Marseille (meanannual SST of 17.65 °C according to MEDAR/MEDATLAS regional datasets, MEDARGroup 2002) and immediately dissected. Their tests were cleaned as described above anddisarticulated. Whole interambulacral columns were ground in an agathe mortar andstored at room temperature.51

Chapitre IIFigure 17: Calcein labelled (LIP) andunlabelled (UIP) interambulacral platesof juvenile Paracentrotus lividus grownin aquarium, viewed by epifluorescencemicroscopy (Scale bar = 0.5 mm).Sample preparation and analysis. Experimental samples (10 mg of newly formedcoronal plates) were mineralized by adding 100 µl HNO 3 (suprapur, Merck), 60 µl H 2 O 2(pro analysis, Merck) and 840 µl Milli Q Water (Millipore) in an Eppendorf tube. Fieldcollected samples (0.25g of powered skeleton) were mineralized in a Milestone1200mega microwave oven in 2.5 ml HNO 3 and 1 ml H 2 O 2 . The resulting solution wasfiltered on a GF/A Whatman filter and brought to a final volume of 25 ml with Milli Qwater (Millipore). Sea water samples were thawed in closed vials at 50 °C during 2 hours.HNO 3 2% (suprapur, Merck) was added and the samples were filtered on GF/A Whatmanfilter. The solutions were diluted 10 times in acidified water for the skeleton and 20 timesfor seawater samples prior to analyses.Mg, Sr, Ca concentrations of the solutions were analysed with an Iris Advantage (ThermoJarrel Ash) Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometer (ICP-AES). Thecalibration was achieved using artificial multi-elemental solutions made from certifiedmono-elemental solutions (Merck) and using certified reference materials for qualitycheck: HPS CRM Seawater (High Purity Standard) for the seawater samples and JCp-1(coral) and JCt-1 (giant clam) (Standard Geological Survey of Japan) for the skeletonsamples. Results for the certified reference materials were always within ± 10% of thecertified values. The analytical precision was 0.32% for Mg/Ca and 0.74 % for Sr/Ca.Adequate cleaning (with pro analysi products) is confirmed by very low Fe/Ca andMn/Ca ratios (Figure 18).52

Chapitre IIFigure 18: Skeletal Mn/Ca ratios vs Fe/Caratios indicating no influence on Mg/Ca ratiosby contaminating phases.Data analysis. All statistical analyses were carried out using the Systat 9 software.Significance level was fixed at 0.05. In order to control if experimental trace elementsignatures correspond to field ones, Mg/Ca and Sr/Ca ratios of the bulk skeletal powder ofthe field specimens were compared to experimental data obtained at a similar temperatureusing a Mann Withney test. The effects of temperature, salinity and growth rate on Mg/Caand Sr/Ca ratios were analysed using forward stepwise multiple linear regressions. Therelation between Mg/Ca ratio and temperature was further characterized by non linearregression. Analysis of residuals was systematically carried out. No significant trend wasever recorded among residuals.RESULTSGrowth rate. During the experiment, sea urchins moved and ate actively. At the end ofthe experiment, the dissection revealed well-developed gonads with vivid colours andcalcein labelling evidenced a significant growth attesting that sea urchins were healthy inall treatments.Mean growth rate of newly formed coronal plates was 0.163 ± 0.122 mg/day.Interindividual variation was important. This growth rate was not affected by temperature(p correlation = 0.24) nor salinity (p ANOVA = 0.60).Mg/Ca ratio. Mean skeletal Mg/Ca and Sr/Ca are presented in Table 8 (individual ratiosare detailed in thesis annexes).53

Chapitre IITable 8: Temperature (°C), salinity (psu), growth rate calculated as the ratio of newly formedinterambulacral plates on growth duration (mg/d) and mean (±S.D) Mg/Ca (mol/mol), Sr/Ca(mol/mol).temperature salinity Growth rate Mg/Ca Sr/Ca°C psu mg/d mol/mol mol/molMean ± S.D. Mean ± S.D.13.5 36.02 0.15 0.093 ±0.004 0.0029 ±0.000113.23 39.03 0.15 0.097 ±0.016 0.0029 ±0.000118.48 36.14 0.21 0.108 ± 0.007 0.0032 ±0.000118.82 39.16 0.17 0.113 ±0.007 0.0030 ±0.000120.66 36.12 0.20 0.119 ±0.013 0.0032 ±0.000220.83 39.04 0.20 0.109 ±0.006 0.0030 ±0.000224.3 36.3 0.13 0.118 ±0.011 0.0029 ±0.000124.18 39.17 0.11 0.119 ±0.005 0.0029 ±0.0001Whatever the sequence of introduction of the variables, the stepwise multiple regressionrevealed a significant temperature effect on skeletal Mg/Ca, but no significant effect ofsalinity nor growth rate (Table 9). The temperature effect is better described by a nonlinear relation (R 2 = 0.56) than by a linear regression (y=0.064+0.023x, R 2 = 0.52, p

Chapitre IIFigure 19: Mg/Ca ratio in the skeleton of Paracentrotus lividus grown in aquarium according totemperature and salinity (♦ 36 psu and ■ 39 psu ) and in field specimens (×); equation of the nonlinear model and 95 % confidence interval (lower: Mg/Ca = 0.116 – e - 0.254T ;upper: Mg/Ca = 0.122 - e - 0.287T ). The model was calculated using data obtained at both salinities,this factor having no significant effect on Mg/Ca ratio (see Table 9).Sr/Ca ratio. The skeletal Sr/Ca ratio was dependent on temperature (according to anegative quadratic relation) (Figure 20), growth rate (positive linear relation) (Figure 21)and salinity (negative linear relation), but not on seawater Sr/Ca (stepwise multipleregression in Table 9). Temperature and growth rate explained each ca 20% of thevariability and salinity a further 9%. The Sr/Ca ratios of the adult specimens grown in thefield at a mean annual temperature of 17.65 °C were significantly different from those ofthe juveniles grown in aquarium at a close temperature (p Mann Withney

Chapitre IIFigure 21: Sr/Ca ratio (mol/mol) in the skeleton of Paracentrotus lividus grown in aquariumaccording to growth rate (mg/d), equation of the linear regression (p

Chapitre IIor a magnesium compartment. Magnesium transport mechanisms in echinoderms arecurrently unknown. A possibly saturated magnesium compartment is the organic matrixof mineralization. Acidic organic macromolecules are known to stabilize a transientamorphous phase during in vitro precipitation of calcium carbonate (Raz et al 2000, Politiet al 2007) and are suggested to play an important role in the hydration of this phase,allowing a higher incorporation of the magnesium ion which has a relatively largedehydration barrier (Cheng et al 2007). Furthermore, Asp rich proteins includes a domainthat possibly binds magnesium ions (Politi et al 2007). As sea urchins are known tomineralize their skeleton through such amorphous calcium carbonate (ACC) phase, onemay suggest that the organic matrix of mineralization of a given species is able to favourthe hydration of the ACC phase with a maximum level, which would allow theincorporation of magnesium to a given level. So, other effects like the thermodynamiceffect of temperature could influence magnesium incorporation until a maximum levelcontrolled by the hydration effect of the organic matrix. This is further supported by theobservation of Robach et al (2006) who demonstrated that higher magnesiumconcentrations in the sea urchin teeth mapped together with matrix molecules richer inAspartic acid (Asp). Thus genetic modulations of the synthesis of such matrix proteinscould account for the different magnesium concentrations measured in differentechinoderm species from the same location (Weber 1969). Physiological modulations ofsuch Asp rich proteins is also possible and could also be involved in the level ofmagnesium incorporation in the skeleton.In regards of our results, an increase of Mg/Ca ratio in echinoderm skeleton is expectedwith the ongoing temperature increase linked to anthropogenic activities. Highermagnesium levels in calcite imply higher solubilities (Morse & Mackenzie 1990) in amore and more acid ocean water. Nevertheless, our results showed that the increase ofmagnesium content in the skeleton of echinoderms is limited with increasingtemperatures. Consequently, solubility may not increase dramatically at higher oceantemperatures. However, nothing is known about the direct influence of a potentialdecrease of pH on skeletal Mg/Ca (and consequent solubility) in echinoderms. It isnoteworthy that skeletal Mg/Ca in Foraminifera is inversely related to pH (Lea 1999,Russel et al 2004, Kisakürek et al 2008). This topic clearly deserves further research.57

Chapitre IIMinor change of salinity (3 psu) caused no significant variations of the skeletal Mg/Caratio of aquarium raised P. lividus. On the contrary, Pilkey & Hower (1960) observed thatthe MgCO 3 content of field collected sand dollars is directly related to water salinity overa range of 10 psu, and Borremans et al (2009) showed a similar effect over the samerange of experimental conditions for a starfish. This is reminiscent of results obtained inForaminifera (Nürnberg et al 1996), where Mg/Ca ratios of aquarium grown individualswere only affected by drastic salinity changes (>10 psu). Borremans et al (2009) proposedthat the positive relation between Mg/Ca ratio and salinity is due to the upregulation ofcalcium concentrations in inner fluids under salinity decrease while magnesium is notregulated and its inner concentration decreases with salinity. We suggest this upregulationis too small to be detected when salinity changes are low.Little is known about skeletal element incorporation pathways and skeletal elementsources in echinoderms. Potential sources of calcium and magnesium are seawater andfood. However, P. lividus food is flooded with seawater and very probably mostmagnesium and calcium are taken up from seawater whatever the absorption route(integument or digestive tract). Nakano et al (1963) and Lewis et al (1990) showed withradioactive calcium that skeletal calcium of the echinoderm skeleton derives fromseawater calcium. Magnesium has probably the same origin. Mg/Ca ratio is much higherin seawater (Mg/Ca SW = 5.2 mol/mol) and echinoderm coelomic fluid (Mg/Ca Coelomic fluid= 4.8 mol/mol) than in echinoderm skeleton (Mg/Ca Sk = 0.1 mol/mol). Therefore, strongpartition mechanisms of this element probably occur during magnesium incorporation inthe mineralization vacuole or the growing mineral. As calcium delivery to this vacuole ismediated by transport systems (see Dubois & Chen 1989), one may hypothesize eitherthat these systems discriminate against magnesium or that specific magnesium transportsystems eliminate this ion from the mineralizing solution (see Bentov & Erez 2006).Sr/Ca ratio. The skeletal Sr/Ca ratio of juveniles Paracentrotus lividus grown inaquarium increased with growth rate and temperature (until 19 °C). Sr/Ca variations werecorrelated with growth rate variations and the highest Sr/Ca observed in this studycorresponds to the range of optimal temperatures of somatic growth (18 °C to 22 °C)experimentally determined by Le Gall et al (1990). These relations between Sr/Ca,growth rate and temperature are usual in biogenic calcites (e.g. De Deckker et al 1999,Lea et al 1999, Stoll et al 2002, Lorrain et al 2005) and are attributed to a predominant58

Chapitre IIpositive temperature effect on crystal growth rate, which in turn controls strontiumincorporation (Rickaby et al 2002, Lorrain et al 2005, Carré et al 2006, Kisakürek et al2008). The effect of growth rate on skeletal Sr/Ca probably also explains the lower valuesof skeletal Sr/Ca observed in adult field specimen compared to those of aquarium grownjuveniles. Indeed, aquarium grown sea urchins were fed ad libitum while field collectedspecimens are frequently food limited. The skeletal growth rate effect is usually attributedto a faster and less efficient discrimination of calcium ions against strontium ions. Puretemperature effects can also be due to the increase in seawater supersaturation withtemperature (Morse & Mackenzie 1990), which results in an increased Sr incorporation ininorganic calcites linked to a faster crystal growth (Wasylenki et al 2005). The skeletalSr/Ca ratio was negatively linked to salinity. This observation is antagonist to the resultsof Borremans et al (2009), who reported a very clear positive relation between thesevariables in a starfish. However, the observed effect is weak and encompasses a veryrestricted salinity range. Further research is clearly needed to determine the factorscontrolling the Sr/Ca ratio in the echinoderm skeleton. In particular, the involvement ofthe initial ACC in strontium incorporation deserves attention.Conclusion. Despite the large interindividual variations observed in this study, we wereable to show that temperature significantly controlled the skeletal Mg/Ca ratio in P.lividus and this effect was not due to growth rate as previously suggested. At highertemperatures, the relation showed a plateau, which limits the use of Mg/Ca ratio inP.lividus test as a temperature proxy to the lower temperatures. This plateau is postulatedas a side effect related to properties of the organic matrix of mineralization incorporatedduring the carbonate precipitation. The modulation of the synthesis of Asp-rich proteins isa potential controlling factor. Because this saturation process is likely to occur atcontrasted temperature thresholds according to species, any temperature correction to beapplied to use the skeletal Mg/Ca ratio as a proxy of seawater Mg/Ca ratio (see Ries2004) has to be specific. In relation with climate change, the same saturation process canbe an adaptative feature for sea urchins because the skeletal Mg/Ca ratio and consequentsolubility is expected not to increase infinitely with temperature.AcknowledgementsB. David and two anonymous reviewers are acknowledged for their critical reading of themanuscript and fruitful suggestions. The authors wish to thanks Ph. Pernet, J. Navez, L.59

Chapitre IIMonin and N. Dakhani for the specimen analyses. T. Dupont provided technical support.This work was supported by a “Plan Action 2” grant (contract n r WI/36/F02), theCALMARS II project from the Belgian Federal Science Policy, Brussels, Belgium(contract n r SD/CS/02A) and FRFC contract (n r 2.4532.07). Ph. Dubois is a SeniorResearch Associate of the National Fund for Scientific Research (NFSR, Belgium).60

Chapitre IIICHAPITRE IIISalinity effects on the Mg/Ca and Sr/Ca in starfish skeletons and the echinodermrelevance for paleoenvironmental reconstructionsCatherine Borremans 1 , Julie Hermans 1,2 , Sandrine Baillon, Luc André 3 , Philippe Dubois 1*∗Published in Geology, April 2009, 4: 351-354doi : 10.1130/G25411A.1;2ABSTRACTSkeletal Mg/Ca ratios of well-preserved fossil echinoderms have been used to reconstructpast Mg/Ca ratio in seawater up to the Phanerozoic, taking into account the knowntemperature effect on this ratio. This study investigates the effects of salinity and growthrate on Mg/Ca and Sr/Ca ratios in starfish calcite skeletons grown in experimentalconditions. Both ratios are not related to growth rate: on the contrary, both are positivelyrelated to salinity. This effect induces an error on the reconstructed Mg/Ca ratio inseawater that may reach 46%. An intriguing inverse relation between skeletal Sr/Ca ratioand temperature was recorded. The salinity effects are presumably due to physiologicalregulation processes.∗ 1Laboratoire de Biologie Marine (CP 160/15), Université Libre de Bruxelles, 50 avenue F.D. Roosevelt, B-1050 Brussels, Belgium2 Département des Invertébrés, Institut Royal des Sciences Naturelles de Belgique, 29 rue Vautier, B-1000 Brussels, Belgium3 Section de Minéralogie, Pétrographie et Géochimie, Musée Royal d’Afrique Centrale, 13 Leuvensesteenweg, B-3080 Tervuren,Belgium61

Chapitre IIIINTRODUCTIONEchinoderms are abundant, widely distributed benthic invertebrates and theirendoskeletons are generally well preserved in the geological records. This skeleton ismade of ossicles located in the dermis. Each ossicle consists in a three-dimensionalnetwork of mineralized trabeculae, the stereom. Each ossicle is composed of a singlecrystal of high-magnesium calcite in which Sr is the main trace element. It also contains0.1% organic material (the intrastereomic organic matrix). The skeleton is formedintracellularly in cell processes of the skeleton-forming cells (for a review, see Duboisand Chen 1989). The high-magnesium calcite phase results from the progressivecrystallization of a transient amorphous calcium carbonate phase (ACC) presumablydelivered in the calcifying vacuole in the form of ACC-containing vesicles (Wilt 2002,Beniash et al 1997, 1999, Politi et al 2004).The Mg/Ca ratio of the skeleton is related to temperature (Clarke & Wheeler 1922, Chave1954, Weber 1969) and seawater Mg/Ca ratio (Ries 2004). Because the Mg/Ca ratio inseawater is spatially constant and unlikely to change on time scales of

Chapitre IIIcontrolled aquarium conditions the relationships between Mg/Ca and Sr/Ca ratios in theskeleton and salinity as well as growth rate. Possible confusing factors like animal age(size) or ossicle type were also investigated.MATERIAL AND METHODSAll experiments were carried out using the starfish Asterias rubens. This species is able towithstand large salinity differences (Sarantchova 2001) and is representative ofechinoderm skeletal characteristics (e.g., see Dubois & Chen 1989). Furthermore, it canbe easily obtained in large numbers and shows a fast growth in an aquarium.Field samplesFor analysis of Mg, Sr, and Ca in different skeletal plates, starfish A. rubens werecollected at low tide on a breakwater in Knokke (Belgium) on January 9th, 2007.Temperature and salinity were respectively 9.2°C and 30.8 psu. Starfish were measured(55 ± 6 mm ray length) and then immediately dissected. For assessing the effect of size(age) on Mg/Ca and Sr/Ca ratios, 92 starfish A. rubens showing a wide range of sizes(17–105 mm ray length) were collected at low tide on a breakwater in Audresselles (Pasde-Calais,France) on October 26th, 2007. Temperature and salinity were respectively12.8 °C and 34 psu. Starfish were measured and then stored at -20°C until treatment.Experimental studyJuvenile A. rubens (10-35 mm in ray length) and mussels were collected in November2006 at low tide on breakwaters in Knokke (Belgium). Temperature and salinity at thesampling site were respectively 12.5°C and 31.8 psu.Starfish were first acclimatized in an aerated, temperature controlled (14°C) closed circuitaquarium system containing 1200 litres of seawater at a salinity of 31.5 psu. The salinitywas decreased by 0.5 psu/10 days until 30 psu by adding fresh water. After 50 days, thestarfish were transferred in eight independent closed-circuit aquariums containing 100litres of Wimereux (Pas-de-Calais, France) seawater at 14°C and 30 psu. The filtrationsystem was made of an external tank containing plastic bioballs, synthetic foam andsynthetic wool. The initial size distributions of the starfish were identical in all aquariums.Temperature and salinity were modified by 0.5 psu/4days and 1 °C/10days to reach theexperimental conditions (11, 18 °C; 25, 28, 32, 35 psu). Temperature was adjusted bythermostatic control of the two cold rooms containing the aquariums (4 aquariums/cold63

Chapitre IIIroom). Salinity was increased by evaporation and was decreased by adding MilliQ water(Millipore). Once the required conditions were reached (at the end of January 2007),starfish arm length was measured monthly, and food was provided freely using ninedifferent batches of mussels from Knokke. Salinity and pH were measured daily andevery two days, respectively, in each aquarium using a WTW Multi 340i multi-meterequipped with a conductivity cell and a pH electrode. Temperature was measured dailyusing the same multi-meter and at intervals of 6 hours using Stow Away Tidbit TempLoggers (ONSET Corporation) as a control. Salinity was adjusted by addition of Milli-Qwater to compensate for evaporation and pH was maintained by adding NaHCO 3 (Sodiumbicarbonate 99.5%, for analysis, Acros Organics). Temperature and salinity conditions ofthe entire experiment are summarized in Table 10. Nitrites, nitrates, KH and calcium werechecked regularly using Tetra tests. Ten percent of the seawater of each aquarium werechanged twice a month using Wimereux seawater diluted with MilliQ water or salted withhw-Sea Salt professional (Wiegandt). Death rate was low except in the aquarium at 18°Cand 35 psu (75%).Table 10: Temperature (°C) and salinity (psu) recorded throughout the aquarium experiment (S.D. =Standard deviation, Min. = Minimum, Max. = Maximum).Temperature (°C)Salinity (psu)Aquarium Mean S.D. Min. Max. Mean S.D. Min. Max.A 11.2 0.1 10.9 11.6 32.0 0.1 31.8 32.3B 11.2 0.1 11.0 11.7 35.0 0.1 34.8 35.3C 10.9 0.2 10.6 11.4 25.0 0.1 24.8 25.4D 10.7 0.1 10.5 11.0 28.0 0.1 27.9 28.3E 18.3 0.2 18.0 19.0 32.0 0.1 31.7 32.3F 18.0 0.1 17.8 18.4 35.1 0.1 34.7 35.2G 17.8 0.2 17.6 18.4 25.1 0.1 24.7 25.5H 17.6 0.1 17.3 18.0 28.0 0.1 27.8 28.2The newly formed parts of juvenile arms, after 4 months of growth under controlledconditions (June 2007), were determined using the monthly size measurements and theresults from a separate calcein labelling experiment (data not shown). The distal newlygrown parts of the starfish arms were dissected in starfish that reached at least 41 mm(maximum size reached was 66 mm) and were stored at -20°C. At the end of theexperiment, water samples were taken in triplicates from the different systems and storedat -20°C until analysis. Ca consumed by the starfish for biomineralization was less than1% of the initial Ca present in the aquarium seawater. Therefore, Ca, Mg and Srconcentrations in the seawater could be considered as constant throughout the experiment.64

Chapitre IIIFurthermore, Mg/Ca ratios in seawater of the different aquariums were not linked tosalinity (p regression > 0.40) at the end of the experiment.Seawater and skeleton analysesWater samples were quickly thawed in an oven at 50°C. They were then filtered over aGF/A Whatman and acidified (10%) with HNO 3 65% (Suprapur, Merck). These solutionswere diluted 20 times before analysis.The body wall was isolated from the other body compartments by dissection. Theskeleton was then cleaned of the associated soft tissues using 2M NaOH (pro analysi,Merck) at 40-50°C. It was rinsed with MilliQ water and dried during 48 hours at 40°C ina drying oven. The cleaned skeleton was stored in either acid rinsed Nalgene tube orEppendorf tubes. In experimental samples, the terminal plate was removed. Forcomparing the different ossicles, these were sorted under a stereomicroscope and 4 mg ofthe following ossicles were isolated: skeleton bulk (from an entire arm), adambulacralspines, adambulacral plates, ambulacral plates, aboral plates and upper marginal plates(Figure 22).Ab. Pl.Up. M.Amb. Pl.Ad. Pl.Ad. Sp.Figure 22: Schematic cross section of Asterias rubens arm. Ab. Pl. = Aboral plate, Up. M. = Uppermarginal plate, Amb. Pl. = Ambulacral plate, Ad. Pl. = Adambulacral plate, Ad. Sp. = Adambulacralspine.For field samples, 0.25 g of cleaned skeleton was mineralized in a Milestone 1200megamicrowave oven (250W (6 min), 400W (6 min), 800W (6 min), and 300W (6 min)) with2.5 ml of HNO 3 65% (Suprapur, Merck) and 1 ml H 2 O 2 30% (pro analysi, Merck). Themineralized skeleton was then filtered over a GF/A Whatman filter and the volume was65

Chapitre IIIbrought to 25 ml with MilliQ water. These solutions were diluted 10 times beforeanalysis.Experimental samples and sorted ossicles were mineralized by adding 840 µl of MilliQwater, 100 µl HNO 3 65% (Suprapur, Merck) and 60 µl H 2 O 2 30% (pro analysi, Merck).These solutions were diluted between 5 and 10 times before analysis.Magnesium, strontium and calcium were analysed on an IRIS Advantage (Thermo JarrelAsh) Induced Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometer (ICP-AES). Thecalibration was achieved using artificial multi-elemental solutions made from certifiedmono-elemental solutions (Merck) and using certified reference materials for qualitycheck : HPS CRM Seawater (High Purity Standard) for the seawater samples and JCp-1(coral) and JCt-1 (giant clam) (Standard Geological Survey of Japan) for the skeletonsamples. Results for the certified reference materials were always within ± 10% of thecertified values.Data analysesThe individual growth rate (GR) was calculated as follows: GR = (R Tf - M T0 ) / Dwith : R Tf : ray length of the individual (mm) at the end of the experiment,M T0 : median size (mm) at the beginning of the experiment,D : duration of the experiment (days).Median size per aquarium at the beginning of the experiment was used as individualjuvenile starfish cannot be tagged.The relationships between Mg/Ca and Sr/Ca ratios and salinity, temperature and growthrate were investigated using forward stepwise multiple linear regressions. The regressionequations between elemental ratios and size in field samples were established by simplelinear regression. The comparison of Mg/Ca and Sr/Ca ratios in the different skeletalplates was achieved by repeated measures analysis of variance model III (sensu Zar 1999)followed by model III Tuckey’s test.All statistical analyses were performed using the Systat 9 © software. The significancelevel was set at α = 0.05.RESULTSField SpecimensThe Mg/Ca and Sr/Ca ratios were measured in the different types of ossicles forming thewhole skeleton (adambulacral plates, adambulacral spines, ambulacral plates, aboralplates, upper marginal plates) (Figure 22). Significant but weak differences were recorded66

Chapitre IIIbetween these different plates (p ANOVA repeated measures < 10 −5 ) (Table 11). The skeletalSr/Ca ratio was significantly dependent on the size of the starfish (Sr/Ca = −0.0028 × size+ 2.6897; R 2 = 0.7812; p regression < 10 −6 ) (Figure 23). On the contrary, the size had nosignificant effect on the skeletal Mg/Ca ratio (p regression = 0.061) (mean ± S.D. = 104 ± 8; n= 92). Over this size range the 95% confidence interval (CI 95) was 87–120 mmol/mol.Table 11: Mg/Ca (mmol/mol) ratios in skeletal plates of Asterias rubens (mean ± standarddeviation; n = 20). Values sharing the same superscript are not significantly different.Type of calcified tissue Mg/Ca (mmol/mol) Sr/Ca (mmol/mol)Skeleton bulk 112 ± 7 c 2.56 ± 0.04 cAdambulacral plates 113 ± 7 c 2.55 ± 0.04 cAdambulacral spines 106 ± 6 b 2.50 ± 0.04 aAmbulacral plates 96 ± 4 a 2.51 ± 0.04 bAboral plates 96 ± 4 a 2.51 ± 0.04 a,bUpper marginal plates 97 ± 3 a 2.53 ± 0.03 b2.75Skeletal Sr/Ca (mmol/mol)2.72.652.62.552.52.452.42.35y = -0.0028x + 2.6897R 2 = 0.7812; p

Chapitre IIIindividual variation was responsible for 43% of the variation with CI 95 ranging between90–98 and 94–115 mmol/mol, i.e., 8%–22% of the mean, according to the consideredconditions. It is noteworthy that the Mg/Ca versus salinity relationships differedaccording to temperature (Figure 24).Table 12: Statistical results of the stepwise multiple regressions between Mg/Ca and Sr/Ca ratios inthe newly formed skeleton and possible dependent variables.Mg/CaSr/Ca1 st variable 2 nd variable 3 rd variable R 2 Sign. of additional variableSalinity 0.25 < 10 -5Salinity Temperature 0.57 < 10 -5Salinity Temperature Growth rate 0.57 0.7Salinity Temperature Size 0.57 0.8Salinity 0.70 < 10 -5Salinity Temperature 0.86 < 10 -5Salinity Temperature Growth rate 0.86 0.7Salinity Temperature Size 0.86 0.9120Skeletal Mg/Ca (mmol/mol)1101009080y = 1.6898x + 51.6829R 2 = 0.685; p = 2.2 10-5y = 0.9443x + 65.4850R 2 = 0.395; p = 7 10-57020 25 30 35 40Salinity (psu)Salinity (psu)Figure 24: Mg/Ca ratio (mmol/mol) in the skeleton of Asterias rubens grown in aquarium accordingto salinity and temperature of growth (———11°C;---------18°C ); equations and parameters of thelinear regressions at each temperature (———11°C;---------18°C).The Sr/Ca ratio was highly dependent on salinity, the latter explaining 70% of thevariation, temperature accounting for a further 16% (Table 12). Sr/Ca ratios versussalinity relations did not differ according to temperature (Figure 25). Individual variationin Sr/Ca was lower, with CI 95 ranging from 2.18–2.26 to 2.25–2.42 mmol/mol, i.e., 4%–7% of the mean.68

Chapitre III2.6Skeletal Sr/Ca (mmol/mol)2.52.42.32.22.1y = 0.0183x + 1.8239R 2 = 0.808; p < 10-6y = 0.0173x + 1.7779R 2 = 0.730; p = 6 10-6220 25 30 35 40Salinity (psu)Salinity (psu)Figure 25: Sr/Ca ratio (mmol/mol) in the skeleton of Aterias rubens grown in aquarium according tosalinity and temperature of growth (———11°C;---------18°C); equations and parameters of thelinear regressions at each temperature (———11°C;---------18°C).DISCUSSIONMg/Ca ratio in different ossicle typesIn contrast to sea urchins, no strong differences of Mg/Ca ratio between ossicles weredetected in Asterias rubens. For example, the test of Echinometra mathaei contains 16.2%MgCO 3 (w/w) and its spines 7.5% MgCO 3 (w/w) (Weber 1969). In A. rubens, the highestmagnesium difference was found between adambulacral plates, 9.3% MgCO 3 (w/w), andambulacral plates, 8.0% MgCO 3 (w/w). Furthermore, no difference between oral andaboral faces and between more or less external ossicle positions were detected. Thisallows the use of the whole starfish skeleton for the Mg/Ca ratio analyses.Size (age) effect on the Mg/Ca and the Sr/Ca ratiosThe Mg/Ca ratio is independent of the starfish size (age), making comparisons betweendifferent populations robust.The Sr/Ca ratio was negatively related to the starfish size, as already shown in planktonicforaminifera, other organisms with a high-magnesium calcite skeleton (Elderfield et al2002). Growth rate is probably the mechanistic basis of this relation. Younger (smaller)starfish grow much faster than older ones and strontium distribution coefficients areknown to increase with increasing precipitation rate (Lorens 1981). On the contrary, nosize effect was detected on the Sr/Ca ratio in the skeleton of the experimental specimens,69

Chapitre IIIprobably because the size range (41–66 mm ray length) was narrower than in the fieldstudy (17–105 mm ray length) and thus impeded to detect an effect.Salinity effect on Mg/Ca ratioUnder experimental conditions, when a wide range of salinity was used, a clear salinityeffect on the Mg/Ca ratio was evidenced in A. rubens. The salinity dependence was linearand accounted for 0.94–1.69 (mmol/mol)/psu, i.e., ~1% to ~1.5%/psu. These values are ofthe same magnitude as the temperature effect on the echinoderm skeleton Mg/Ca ratio,i.e., ~2%/°C (Chave 1954). This result is in contradiction with Richter & Bruckschen’s(1998) field results. In their study, specimens were collected in very contrastedecosystems (Kattegat, North Sea, Atlantic, and Mediterranean), showing different rangesof seawater temperature that correlated with salinity. We suggest that, in the latter case,the salinity effect was masked by the temperature effect and possibly by signatures ofdifferent water masses.The salinity effect reported in the present study was not due to differences in growth ratedepending on salinity. As seawater Mg/Ca ratio showed no relation with salinity (seesection on Material and Methods), such an effect can also be ruled out. Differences in Mgand Ca transport or homeostasis according to salinity could be involved. A. rubens is anosmoconformer, its perivisceral and ambulacral fluids being isosmotic and isoionic withseawater, except for Ca and K, which are regulated (Binyon 1962, Stickle & Diehl 1987).If calcium uptake is at least partly controlled, magnesium concentration in inner fluidswould vary more than calcium ones with seawater concentrations and, thereby, withsalinity. As a consequence, the Mg/Ca ratio of inner fluids would be lower at lowersalinities. In vitro, the Mg/Ca ratio of highly supersaturated solutions was demonstrated todefine the magnesium content of the resulting amorphous calcium carbonate (ACC)precipitate both in the absence and presence of organic matrix-like macromolecules (Razet al 2000, Loste et al 2003, Cheng et al 2007, Gayathri et al 2007). Subsequently, ACCcontaining more Mg crystallized to yield calcites with higher Mg concentrations.Therefore, if in vivo mechanisms (which also include a transient ACC phase) follow thesein vitro processes, the differential regulation of Mg and Ca could be responsible for theobserved effect. Alternatively, salinity could induce a modification in the composition orabundance of the intraskeletal organic matrix, which was suggested to control the Mgcontent of the echinoderm skeleton (Dubois & Chen 1989). Such a hypothesis was70

Chapitre IIIalready proposed by Vander Putten et al (2000) to account for seasonal variations in theMg content of Mytilus edulis calcite shell layer. Acidic organic macromolecules stabilizein vitro the transient ACC phase (Raz et al 2000) and possibly play an important role inthe hydration of this phase, allowing an easier incorporation of the Mg ion, which has arelatively large dehydration barrier (Cheng et al 2007). Furthermore, Robach et al (2006)demonstrated that higher Mg concentrations in the sea urchin tooth were linked to matrixmolecules richer in aspartic acid. Thus, one may hypothesize that more acid matrixmolecules will, in vivo, further stabilize the transient ACC phase, allowing for a higherincorporation of Mg.Using Ries’ (2004) algorithms we reconstructed seawater Mg/Ca ratio and the errorinduced by the salinity effect on the calcite Mg/Ca ratio. This induced an error in deducedseawater Mg/Ca ratio between 2% and 5% at a difference of 1 psu and between 16% and46% for a difference of 10 psu (Figure 26), according to the seawater Mg/Ca ratio. Thehighest error occurs for the lowest seawater Mg/Ca ratio of 1.29, i.e., values inferred for apart of the Phanerozoic oceans (see e.g., Dickson 2002).This result emphasizes the need to consider the salinity effect, with the temperature effect,when reconstructing long-term changes (Δt > 1 m.y.) in the seawater Mg/Ca ratio.Figure 26: Impact (%) of the salinity effect on the seawater Mg/Ca ratio reconstruction based on Ries’(2004) algorithms (Mg/Ca skeleton =(0.0471×Mg/Ca SW 0.668 )71

Chapitre IIITemperature and salinity effects on Sr/Ca ratioThe Sr/Ca ratio in the skeleton of A. rubens grown in experimental conditions dependedon both temperature and salinity. Higher Sr/Ca ratios were recorded at lower temperature.This is consistent with field results in a sand dollar, where a linear inverse relationbetween Sr/Ca ratio and temperature of the collection site was documented (Pilkey &Hower 1960). This relation is unusual for biogenic calcites in which Sr/Ca ratios areeither unrelated or positively linked to temperature (e.g., De Deckker et al 1999, Lea et al1999, Stoll et al 2002). Wasylenki et al (2005) showed that Sr incorporation into abioticcalcite increased with supersaturation. However, supersaturation in seawater increaseswith temperature (Morse & Mackenzie 1990). Supersaturation level in the calcifyingvacuole is unknown, but metabolism increases with temperature and a higher iontransport is expected. To our knowledge, Sr incorporation in ACC has never beeninvestigated. Such a study, including possible interactions and/or competition with Mg,could provide a first insight in the mechanisms of Sr/temperature relationships in theechinoderm skeleton. The thermodynamics of the process should be worth investigating(Sr incorporation in the aragonite lattice is exothermic and responsible for the inverserelation between Sr concentration and temperature in aragonitic minerals).The Sr/Ca ratios in the starfish skeleton increased with salinity. This relation cannot beexplained by kinetic factors, as growth rate had no influence on the skeletal Sr/Ca ratio.Furthermore, because the seawater Sr/Ca ratio remains constant between 10 and 35 psu(Dodd & Crisp 1982, Ingram et al 1998, Shen et al 1996), the variation of skeletal Sr/Caratio cannot be the result of variation in seawater Sr/Ca ratios. A metabolic effect due tosalinity can be proposed, as the one deduced for Mytilus trossulus by Klein et al (1996).In these mussels, intracellular transport of shell-forming inorganic components fromseawater to the site of mineralization dominated intercellular transport. As intracellulartransport is more Ca specific than intercellular transport, Ca concentration will becontrolled and Sr concentration will decrease in response to a salinity decrease. Theskeletal Sr/Ca ratio will then decrease with salinity. It is interesting that, for echinoderms,Ca has also been reported to be controlled in echinoderm inner fluids (see Binyon 1962,Stickle & Diehl 1987), while Sr was not.72

Chapitre IIIIon transport in echinodermsIon transports and especially the mechanisms by which Ca is regulated, while Mg and Srare not, are key issues. In echinoderms, ion transport from seawater is mediated by pumpsand channels (see Dubois & Chen 1989, for a review). Seawater vacuolization as shownin foraminifera (Erez 2003) has never been reported in the numerous transmissionelectron microscopy studies carried out on the integument or tube feet of echinoderms(for a review, see Harrison & Chia 1994). Furthermore, these studies clearly showedbelted desmosomes linking epidermal cells, and making an intercellular pathway throughthe epidermis very unlikely (Carré et al 2006). Seawater can enter the water vascularsystem of the echinoderms through the madreporite, but no evidence of furthertranslocation of seawater through the epithelium lining of this system has ever beenreported.ConclusionA salinity effect on A. rubens skeletal Mg/Ca and Sr/Ca ratios was evidenced underexperimental conditions: it accounted for 0.94–1.69 (mmol/mol)/psu and 0.02mmol/mol)/psu, respectively. This effect induces an error on the reconstructed seawaterMg/Ca that may account for as much as 46% according to the seawater Mg/Ca ratio.Consequently, salinity should not be overlooked when reconstructing seawater Mg/Caratio from echinoderm calcite Mg/Ca ratio. The salinity effect on Sr/Ca ratio is wellconstrained and would deserve a verification in the field. The salinity effect on bothMg/Ca and Sr/Ca ratios seems to be due to the physiological regulation of the Ca ion (andnot of Mg and Sr ions) in inner fluids rather than to thermodynamic or kinetic factors assuggested in other taxa.AcknowledgmentsWe thank anonymous reviewers for fruitful suggestions and Jacques Navez, LaurenceMonin, and Nourdine Dakhani for the very helpful contributions to specimen analyses.This project was supported by the Belgian Federal Science Policy Office, contractSD/CS/02A, and by the National Fund for Scientific Research (contract 2.4532.07)(NFSR, Belgium). Ph. Dubois is a Senior Research Associate of the NFSR and J.Hermans is holder of a “plan Action II” doctoral grant from the Belgian Federal SciencePolicy Office.73

Chapitre III74

DEUXIÈME PARTIEPROCESSUS MINÉRALOGIQUESAFFECTANT L’INCORPORATION DU MAGNÉSIUM75

Chapitre IVCHAPITRE IVAn intriguing relationship between Mg/Ca and S/Ca skeletal ratios in biogeniccalcites: is sulphur linked to magnesium incorporation?Julie Hermans 1&2 , Yannicke Dauphin 3 , Catherine Borremans 1 , Herwig Ranner 1 , Philippe Willenz 2 , LucAndré 4 and Philippe Dubois 1∗Submitted in Chemical GeologyABSTRACTBiogenic calcites are composite materials formed of intimately associated mineral andorganic phases. These biominerals contain relatively high sulphur concentrations. Thedistribution of this sulphur between the organic and/or the mineral phases is currentlyunclear. Furthermore, correlations between sulphur and magnesium concentrations inbiogenic calcites were reported with no obvious explanation. In the present study, wereported a highly significant correlation between Mg/Ca and S/Ca ratios in the skeleton ofthe echinoderms Asterias rubens and Paracentrotus lividus and the massive skeleton ofthe sponge Petrobiona massiliana.In the echinoderm skeletons, sulphur co-occurred in the organic and mineral phases of theskeleton, but is predominantly present in the mineral phase (>98%). The XANES spectrashowed the presence of sulphur in the extracted organic matrix of echinoderms, assulphated sugars and S-containing amino acids.It is suggested that seawater sulphate ions form ion pairs with magnesium ions and reducethe hydration of these as proposed for inorganic calcite growth. This would facilitatemagnesium incorporation into the mineral phase of biogenic calcite and explain thecorrelation between these ions.KEYWORDSBiogenic calcite, sulphur, magnesium, organic matrix, Echinoderms, Hypercalcifiedsponges.∗ 1Marine Biology Laboratory (CP 160/15), Université libre de Bruxelles, 50 Avenue F.D. Roosevelt, Brussels 1050, Belgium2Department of Invertebrates, Royal Belgian Institute of Natural Sciences, 29 Rue Vautier, Brussels 1000, Belgium3 UMR IDES 8148, Bat 504, Université de Paris XI Orsay, F-91405 Orsay Cedex, France4 Section of Petrography-Mineralogy-Geochemisty, Royal Museum of Central Africa, 13 Leuvenstesteenweg,, Tervuren 3080,Belgium77

Chapitre IVINTRODUCTIONBiogenic calcium carbonates are composed of one or several mineral phases, and includean organic phase made of proteins and polysaccharides. Despite its low relative weight(ranging from 0.01 to 10 % w.w. of the skeleton, Lowenstam & Weiner 1989), theorganic phase tightly controls the mineral phase, including nucleation, crystal growth,polymorph determination and morphology and is called, for these reasons, the organicmatrix (for a review see Addadi & Weiner 1992).The mineral phase includes several cations that substitute for calcium in the crystallattice. Magnesium and strontium are usually the most concentrated of these cations andmechanisms controlling their incorporation have been extensively studied including theirpossible value as paleorecorders (see e.g. Morse & Mackenzie 1990, Lea et al 1999, Lea2003, Stephenson et al 2008). Anions like sulphates were also recorded in biogeniccarbonates, in significant amounts, but the mechanisms involved in their incorporation aremuch less investigated. Sulphur contents of biogenic carbonates are relatively high.According to Busenberg & Plummer (1985), the sulphur content is highly determined bythe carbonate polymorph, higher sulphur contents being reported in calcite compared toaragonite. The phase which contains skeletal sulphur is still a matter of debate. Indeed,the organic phase is often intimately associated with the mineral phase (or even embeddedin the latter), and the determination of the sulphur containing phase is not obvious. Manyauthors consider that sulphur is associated to the organic phase of the skeleton (Lorens &Bender 1980, Blake & Peacor 1981, Dauphin & Cuif 1999, Rosenberg & Hugues 1991,Vander Putten et al 2000, Cuif et al 2003, England et al 2007). Organic skeletal sulphur ispresent in sulphated polysaccharides (glycoproteins) and in S-containing amino acids(cystein, cystin and methionin). Sulphated sugars were shown to be predominant inaragonite coral skeletons (Cuif et al 2003) and mollusc shells of Haliotis sp and Nautilussp (Dauphin et al 2005, Crenshaw & Ristedt 1976). Pokroy et al (2006) demonstrated thatlattice distortions in mollusc shells were induced by the presence of organic molecules inthe lattice and were highly correlated to the skeletal sulphur concentrations. On thecontrary Busenberg & Plummer (1985) and Pingitore et al (1995) suggested that sulphateswere substituted to carbonates in the crystal lattice of biogenic carbonates, but theiranalyses focused on the total skeleton and did not provide any direct evidence ofsubstitution. The presence of structurally substituted sulphur was suggested in calciticshell of modern brachiopod by micro-Raman spectroscopy, but the measurements were78

Chapitre IVvery close to the detection limit of this method (Cusack et al 2008a). In inorganic calcites,Kontrec et al (2004) showed that carbonate ions could be partly substituted by sulphateions, causing a distortion of the calcite unit cell.Several studies highlighted a correlation between magnesium and sulphur distribution incalcite skeletons of modern brachiopods (England et al 2007) and bivalves (Rosenberg &Hugues 1991, Wisshak et al 2009). These authors considered sulphur as a typicalcomponent of the organic matrix and explained the observed correlation by the fact thatmagnesium could be partly associated with the organic fraction. However, the possibilitythat magnesium was hosted by the organic components was invalidated in brachiopodshells: this cation was clearly hosted in the mineral component of the shell (Cusack et al2008b). Parallel distributions of magnesium and sulphates were also described in thecalcitic test of the foraminifera Amphistegina lobifera (Erez 2003).In the present work, we investigated the distribution of sulphur between the mineral andorganic phases as well as the relation between magnesium and sulphur in two echinodermspecies and one hypercalcified calcisponge, all three producing high-magnesium calciteskeletons. In order to study this relation on a large range of skeletal Mg/Ca ratios, theanalyses were made on skeletons produced over large temperature and salinity ranges,factors that have been demonstrated to affect the skeletal Mg/Ca ratio of the consideredgroups (Borremans et al 2009, Hermans et al 2010a, Hermans et al, 2010b).MATERIALS AND METHODSOrigin of field specimens and aquarium cultivationField adult specimens of the hypercalcified calcisponge Petrobiona massiliana and thesea urchin Paracentrotus lividus were collected by SCUBA diving in 3 differentMediterranean locations. Specimens of the starfish Asterias rubens were collected at lowtide in the North Sea, in 4 intertidal locations in the Scheldt estuary and plume.Geographical coordinates of the sampling sites are presented in Table 13.Detailed experimental procedures of aquarium cultivation were previously reported inHermans et al (2010b, and chapter 2). Juveniles of P. lividus collected in Marseille weregrown for 4 to 6 month in 8 aquaria under controlled salinity (36 or 39 psu) andtemperature (13, 18.5, 20.5 or 24 °C).79

Chapitre IVAfter collection, the sea urchins and sponges were dried in an oven at 50 °C for 48 hours,and the starfish were stored at -20 °C until treatment. For echinoderms, the body wall wasisolated from the other compartments by dissection.Skeleton cleaningSponge massive skeletons (devoid of substrate) were cleaned from associated organictissues (and from their superficial spicules coat) with a Proteinase K solution (P6556SIGMA) in a 100 mmol/l Tris HCl buffer (pH=7.5) at 37 °C for 3 hours. Cleaned spongeskeletons were then rinsed with a thin Milli Q water spray (Broxo Jet) and dried at 50 °Cfor 48 hours.The echinoderm skeletons were cleaned of associated tissues with 2 M NaOH (proanalysi, Merck) in Teflon beakers at 50 °C, and then rinsed 3 times with Milli Q water.They were dried at 40 °C for 48 hours. Field sea urchin tests were disarticulated andwhole interambulacral columns were ground in an agate mortar. Interambulacral testplates grown only during aquarium experiments were used (see chapter 2 for methods).The cleaned skeletons were stored at room temperature.ICP-AES analysesField collected samples (0.25g of skeleton) were mineralized in a Milestone 1200 megamicrowave oven at 250W (6 min), 400W (6 min), 800W (6 min), and 300W (6 min) with2.5 ml of HNO 3 65 % (Suprapur, Merck) and 1 ml H 2 O 2 30 % (pro analysi, Merck). Themineralized skeleton was then filtered on a GF/A Whatman filter and the volume wasbrought to 25 ml with MilliQ water. Aquarium samples (10 mg of newly formedinterambulacral test plates) were mineralized by adding 100µl HNO 3 (suprapur, Merck),60 µl H 2 O 2 (pro analysi, Merck) and 840µl Milli Q Water (Millipore) in an Eppendorftube. These solutions were diluted 10 times before analysis.Magnesium, sulphur and calcium were analysed on an IRIS Advantage (Thermo JarrelAsh) Induced Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometer (ICP-AES). Thecalibration was achieved using artificial multi-elemental solutions made from certifiedmono-elemental solutions (ICP standard solution 1000µg/ml, Alfa Johnson Matthey,Germany) and using certified reference materials JCp-1 (coral) and JCt-1 (giant clam)(Standard Geological Survey of Japan) for quality check. Results for the certifiedreference materials were always within ± 10 % of the certified values. Adequate cleaning80

Chapitre IV(with pro analysi products) was confirmed by very low Fe/Ca and Mn/Ca ratios.Detection limits (3s) for Ca, Mg and S were respectively 10, 3 and 25 µg/l of solution.CarbonizationBulk skeleton of the starfish A. rubens, cleaned as previously described, was ground in anagate mortar. Nine aliquots of this homogeneous powder were carbonized at 450 °C for240 minutes in a Carbolite CWF 1100 oven. Nine carbonized and 9 non-carbonizedaliquots of the same powder (0.25g) were mineralized following the method describedabove for field collected samples, and their S and Ca contents were analyzed by ICP AES.Skeletal organic matrix extractionStarfish skeletons were cleaned of associated soft tissues with 20 % KOH (pro analysiMerck) and then rinsed with Milli Q water (Millipore) before being air-dried.Approximately 10 g of cleaned skeleton was dialyzed at 4 °C against 2 % acetic acid (proanalysi, Merck) in a Spectrapor dialysis tubing (3500 MW cut-off). Acid acetic solutionwas changed 3 times. After 48 hours, when the skeleton was completely dissolved, theorganic matrix was dialyzed against Milli Q water (6 changes). The volume of the totalextract was then reduced by lyophilization. The extracted matrix was centrifuged at18000g for 15 minutes in order to separate the precipitated insoluble matrix from thesoluble matrix. Both matrices of the starfish were dried by lyophilization, prior toXANES analyses.Fourier Transform Infrared spectrometry (FTIR)FTIR spectra of the lyophilized soluble and insoluble matrix of A. rubens were recordedat 4 cm -1 resolution with 64 scans with a strong Norton-Beer apodization on a Perkin-Elmer Model 1600 FTIR spectrometer within the wave number range from 4000 to 450cm -1 . The spectrometer was equipped with a diffuse reflectance accessory, which permitsDRIFT (Diffuse Reflectance InfraRed Fourier Transform) measurements with highsensitivity on powders. A raw diffuse reflectance spectra appear different from itstransmission equivalent, so that a conversion is applied to compensate these differences.All spectra were corrected using the Kubelka-Munk function. The system was purged andpermanently maintained under nitrogen to reduce atmospheric CO 2 and H 2 O absorption.A background spectrum was measured for pure KBr. Sample spectra were automatically81

Chapitre IVratioed against background to minimize CO 2 and H 2 O bands. To assess reproducibility,several spectra from the same sample were obtained and the results gave correlationcoefficients higher than 95%.X-ray absorption near-edge structure spectroscopy (XANES)X-ray absorption near-edge structure spectroscopy is performed by tuning the energy ofan X-ray beam around an absorption edge of an element of interest. At the sulphur K-edge, the position of the white line has been demonstrated to vary significantly withoxidation state, and this shift is very useful for assessing sulphur speciation. In particular,thiols, disulfides and sulphates spectra exhibit characteristic feature differences.This study was carried out at the X-ray Microscopy Beamline ID21 of the EuropeanSynchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, France. The X-ray beam energy wastuned around the sulphur K-edge (2472 eV) using a fixed exit double crystal Si(111)monochromator, providing an energy resolution of DE/E=10 -4 necessary to resolve theXANES features. In the Scanning X-ray Microscope (SXM), a germanium Fresnel zoneplate optimized for this energy range was used to focus the beam to a submicronmicroprobe. The photon flux in the X-ray microprobe within the bandwidth of the doublecrystal Si(111) monochromator was 4 × 10 8 photons s -1 . A high purity Ge energydispersive detector (Princeton Gamma-Tech, NJ) mounted in the horizontal planeperpendicular to the beam was used to collect the fluorescence photons emitted from thesample. The monitoring of the incoming beam intensity on the sample, which is essentialto correct the acquired XANES spectra and images for beam intensity fluctuations, wasensured using a drilled photo-diode collecting the fluorescence from a 0.75 μm thick Alfoil inserted in the beam path. The SXM was operated under vacuum to avoid the strongabsorption of the sulphur emission lines by air.Reference spectra of standard compounds (S containing amino acids, chondroitin sulfate)were acquired for energy calibration in unfocussed mode (i.e., without the zone plate butwith a 200 μm aperture defining the beam size). For these concentrated standards, theHpGe detector was replaced by a Si photodiode for the fluorescence signal measurements.Standards were finely grounded and deposited between two ultralene foils. Energy scansbetween 2450 eV and 2540 eV were performed with 0.225 eV increments. Lyophilizedsoluble and insoluble organic matrices extracted from the skeleton of A. rubens wereanalyzed using the same conditions.82

Chapitre IVData analysisAll statistical analyses were carried out using the Systat 9 software. Significance levelwas fixed at 0.05. For the 4 data sets, the relation between skeletal Mg/Ca and S/Ca ratioswas described using Pearson correlations. The relations between Mg/Ca and S/Ca ratioswere also characterized by linear regressions. The homogeneity of slopes of the 4regression lines was checked using covariance analysis (ANCOVA). The relationbetween skeletal S/Ca ratio and echinoderm size was established by Pearson correlation.RESULTSSulphur concentrations ranged from 1811 to 1990 µg/g in the massive skeleton of thesponge (with a mean concentration of 1920.11 ± 53.73 µg/g, n=15), from 2461 to 3713µg/g in the starfish skeleton (mean of 3171 ± 311µg/g, n=36) and from 3007 to 4190 µg/gin the sea urchin test (mean of 3559 ± 231 µg/g, n=45). Mean Mg/Ca, S/Ca and Sconcentrations and corresponding standard deviations are presented in Tables 13 and 14.Skeletal Mg/Ca and S/Ca ratios were significantly correlated in field collected sponges(r pearson =0.92, p=10 -6 ), starfishes (r pearson =0.75, p=10 -6 ) and sea urchins (r pearson =0.78,p=10 -8 ) as well as in aquarium grown sea urchins (r pearson =0.37, p=10 -3 ) (Figure 27). Theslopes of the 4 corresponding regression lines were not statistically different, except forthat of aquarium grown sea urchins which was different of those of both field collectedechinoderms (Table 15).83

Chapitre IVTable 13: Sampling locations of analysed specimens and corresponding mean (± S.D., n) skeletalMg/Ca and S/Ca ratios, and S concentrations of field collected specimens measured by ICP-AES.Species Location LatitudeLongitudePetrobionamassiliana(massiveskeleton)La Vesse(France)43°20'28''N05°15'41''EnMeanskeletalMg/Ca(mmol/mol)± S.D.MeanskeletalS/Ca(mmol/mol)± S.D.5 114.77 ± 9.07 15.95 ±0.56Meanskeletal Sconcentration(µg/g ofskeleton)±S.D.1868.25 ±46.69Petrobionamassiliana(massiveskeleton)Capo Caccia(Sardinia,Italy)40°33'40''N08°09'41''E5 125.98 ± 3.47 17.18 ±0.291937.24 ±49.49Petrobionamassiliana(massiveskeleton)Kalithea Bay(Rhodes,Greece)36°22'49''N28°14'22''E5 137.62 ± 2.37 17.80 ±0.321954.57 ±17.77AsteriasrubensOstend(Belgium)51°14’14’’N2°55’12’’E9 113.41 ± 8.41 14.09 ±0.983329.51 ±274.01AsteriasrubensAsteriasrubensAsteriasrubensParacentrotuslividusParacentrotuslividusWestkapelle(TheNetherlands)Breskens(TheNetherlands)Terneuzen(TheNetherlands)Illien ArGwen(France)Cabo Raso(Portugal)51°31’35’’N3°26’02’’E51°24’20’’N3°32’35’’E51°20’18’’N3°50’07’’E48°21’00’’N4°26’37’’E38°42’35’’N9°29’12’’E9 112.86 ± 5.04 14.23 ±0.669 108.48 ± 6.16 12.93 ±0.879 110.43 ± 5.17 12.86 ±0.4410 105.81 ± 8.36 12.58 ±0.795 104.59 ± 2.66 12.22 ±0.473239.13 ±305.482969.66 ±257.343146.79 ±330.863436.67 ±310.073505.90 ±199.60ParacentrotuslividusLa Vesse(France)43°20'28''N05°15'41''E10 110.43 ± 7.09 13.31 ±0.743585.88 ±153.40ParacentrotuslividusParacentrotuslividusCapo Caccia(Sardinia,Italy)Kalithea Bay(Rhodes,Greece)40°33'40''N08°09'41''E36°22'49''N28°14'22''E10 109.48 ± 4.31 13.28 ±0.4310 114.05 ± 6.69 13.95 ±0.543577.23 ±168.763626.64 ±328.6284

Chapitre IVTable 14 Mean (± S.D.) skeletal Mg/Ca and S/Ca ratios of aquarium grown Paracentrotus lividus.Temperature(°C)Salinity(psu)n Mean skeletal Mg/Ca(mmol/mol)± S.D.Mean skeletal S/Ca(mmol/mol)± S.D.13.5 36.02 8 93.33 ± 3.96 10.81 ± 0.7613.23 39.03 6 91.44 ± 5.51 12.14 ± 0.5618.48 36.14 8 108.11 ± 6.99 10.83 ±0.8218.82 39.16 9 113.03 ± 7.14 11.92 ± 1.1920.66 36.12 11 118.58 ± 12.55 11.12 ± 1.3920.83 39.04 8 109.31 ± 6.41 11.71 ± 0.8924.3 36.3 13 118.39 ± 10.50 11.86 ± 0.4524.18 39.17 13 118.51 ± 5.33 12.49 ± 0.75Figure 27: Correlations between skeletal Mg/Ca and S/Ca ratios (mmol/mol) in field collectedAsterias rubens (A), Paracentrotus lividus (B) and Petrobiona massiliana (C), and in aquariumgrown juveniles Paracentrotus lividus (D).85

Chapitre IVTable 15: Probabilities of slopes homogeneity of the relations between Mg/Ca and S/Ca, checked bycovariance analysis for the different investigated species.Field collectedPetrobionamassilianaField collectedAsteriasrubensField collectedParacentrotuslividusAquarium grownParacentrotuslividusField collectedPetrobionamassilianaField collectedAsteriasrubensField collectedParacentrotuslividusAquarium grownParacentrotuslividus1 - - -0.058 1 - -0.238 0.273 1 -0.075 0.001 0.002 1Individual S/Ca ratios and ambital diameter of Paracentrotus lividus (mixed fieldcollected and aquarium grown data) or arm length of Asterias rubens were significantlycorrelated (r Pearson =0.51, p

Chapitre IVThe FTIR spectra of a protein (Bovine Serum Albumin) and of an acidic sulphated sugar(Chondroitin sulphate) were used as references (Figure 29A). Proteins and sugars hadcommon amide A, I and II bands, whereas bands between 1000-1150 cm -1 were presentonly in sugars. Moreover, bands between 1240-1260 cm -1 were indicative of sulphates.Because of the complex composition of the soluble matrices, a precise assignment ofFTIR band was not possible.FTIR spectra of the soluble matrices of A. rubens showed strong amide A and amide Ibands (Figure 29B). Amides were mainly related to C=O and N–H vibrations. The amideI region (1690-1600 cm -1 ) displayed 10 bands, the main band at 1654 cm -1 indicative of aα-helical conformation. Other bands were related to β-sheet and random coil structures. Itwas possible that the strong amide A, I and II bands were also due to sugars, as shown bythe spectra of chrondroitin sulphate. The amide II region (1500-1600 cm -1 ) displayed 8bands demonstrating the complex structure of the matrices. Both sugars and sulphateswere present, as shown by the bands at 1140 and 1241 cm -1 (Figure 29B). The FTIRspectra of the insoluble matrices of A. rubens were also complex and showed the mainamide A, I and II bands (Figure 29C). However, the respective intensities of the bandsknown to be characteristics of sugars (1064 cm -1 ) and sulphates (1234 cm -1 ) differed fromthat of the soluble matrix. Seven bands were present in amide A region, only three bandsin amide II bands. Moreover, bands at 2928 cm -1 and 2854 cm -1 were assigned to lipids.From FTIR data, proteins, sugars and sulphates were present in both soluble and insolublematrices of A. rubens.87

Chapitre IVFigure 29: FTIR spectra of (A) standards: bovine serum albumine and chondroitin sulphate and (B) solubleand (C) insoluble organic matrices extracted from the calcitic skeleton of Asterias rubens.The XANES S-K edge spectrum of cystine, an aminoacid with a disulphide bond, showeda double peak at 2,473 keV (Figure 30A), whereas the sulphated sugar, chondroitinsulphate A, showed a main peak at 2.482 keV (Figure 30A). Sulphur aminoacids,methionine and cysteine, showed a main peak at 2.473 keV (Figure 30B). Similar doublepeak was also present in phenyl disulphides (data not shown).88

Chapitre IVFigure 30: XANES spectra of S-reference compounds (A) Amino acid cystine has a double peakaround 2.473 keV and chondroitin sulphate has a single peak at 2.482 keV (B) Methionine andcystein amino acid spectra display a single peak at 2.473 keV.The XANES spectra of the soluble and insoluble organic matrices of the skeleton ofA. rubens presented a main peak at 2.482 keV and small peaks at 2.473 and 2.476 keV(Figure 31). The main peak was characteristic of sulphated sugars, the 2.473 peak wasdue to the presence of S-containing amino acids (cysteine, methionine) and the 2.476peak to methionine sulphoxide. It must be noticed that in the soluble matrix, theascendant part of the peak at 2.482 did not display the classically observed shoulder.Despite these spectra were not calibrated for a quantitative analysis, the S aminoacid andsulphoxide peaks were more intense in the insoluble matrix.89

Chapitre IVFigure 31: XANES spectra of soluble and insoluble organic matrices extracted from Asterias rubensskeleton.DISCUSSIONThe Mg/Ca and S/Ca ratios in the skeleton of the investigated echinoderms andhypercalcified sponge were highly significantly correlated. Similar relationships werealready reported in other groups producing a calcite skeleton (Rosenberg & Hugues 1991,Erez 2003, England et al 2007, Wisshak et al 2009).Regression lines established from Mg/Ca and S/Ca skeletal data of field collectedPetriobiona massiliana, Paracentrotus lividus and Asterias rubens showed similarangular coefficients, although the specimens of the latter species were collected in ratherdifferent regions (i.e. North Sea vs Mediterranean Sea.). However, the relation foraquarium grown P. lividus had a significantly different coefficient. It is noteworthy thatthese aquarium grown sea urchins were juveniles and that S/Ca ratios appeared linked tosize (Figure 28). Busenberg & Plummer (1985) showed that crystal growth rate can affect2-the amounts of SO 4 incorporated in inorganic calcite. This effect could explain thecorrelation between size and S/Ca in echinoderms, as growth rate is known to beinversely linked to size in this group (Azzolina 1988).To address the mechanism linking magnesium and sulphur in calcite skeletons, it isnecessary to determine the localization of sulphur, either in the organic matrix or in themineral phase. The mean sulphur concentrations in the total skeleton of A. rubens wasreduced by 1.3% after carbonization at 450 °C, which was interpreted as the loss ofsulphur hosted in the organic part of the skeleton. Indeed, degradation and partialdecomposition of organic molecules are known to occur at temperatures of 150-200 °C.90

Chapitre IVThese results suggest that, in echinoderms, sulphur is mainly included in the mineralphase of the skeleton. This hypothesis is further supported by the fact that the totalmeasured sulphur concentrations (ca. 3500µg/g) are higher than the total organic matrixconcentration of echinoderm skeletons. Indeed, the total protein matrix concentration ofP. lividus test is estimated to 0.15 to 0.2 % w.w. of the skeleton (Weiner 1985), which isequivalent to 1500 to 2000 µg/g. Polysaccharides account for ca. 15% of the matrix(Swift et al 1986) and do not change this figure significantly. So, in echinoderms, most ofthe sulphur is in the mineral phase of the skeleton. It can be present in carbonate assulphate substituted to carbonate, as a distinct mineral phase or as an impurity entrappedin the skeleton during calcification. Busenberg & Plummer (1985), Pingitore et al (1995)and Kampschulte & Strauss (2004) suggested that mineral sulphur was substituted in themineral phase of biogenic calcite. More recently, microRaman spectra published byBorzecka-Prokop et al (2007) showed sulphate vibrational bands in the skeleton of P.lividus. Furthermore, the substitution of sulphate to carbonate in abiogenic calcite wasrecently established by Kontrec et al (2004). This suggests that sulphur could be presentin echinoderm skeleton as sulphate substituted to carbonate.Even if sulphur was shown to be predominantly present in the mineral phase ofechinoderm skeleton, its co-occurrence in the organic phase was confirmed by FTIR andXANES analysis performed on extracted organic matrix. Detected organic sulphur formswere S-containing amino acids and sulphated sugars. Amino acid analyses of P. lividusand A. rubens intraskeletal matrix were performed in previous studies (Weiner 1985,Dubois, unpublished) and showed the presence of methionine and the absence of cystein.Sulfated polysaccharides were suggested to cooperate with carboxylate groups inattracting Ca 2+ ions (Addadi & Weiner 1992).Sulphur being mainly associated with the mineral phase, how is it incorporated into thisphase and related to magnesium? Sulphate is a major ion in seawater (2712 mg/L at asalinity of 35 psu, Libes 1992). The major part of seawater sulphates are present as freeions (54%) and as magnesium and sodium paired ions (respectively 21.5 and 21%, Libes1992). Sulphates are also present in animal inner fluids: concentrations of ca. 2497 mg/lhave been measured in coelomic fluid of different echinoderm species (Shumway 1977).Ion pairing between sulphates and magnesium could explain the correlation between theincorporation of these elements. Indeed, magnesium in solution forms strong bonds with91

Chapitre IVwater molecules, which creates a strong hydration sphere around the ion and poisons thegrowing calcite surface (Raz et al 2000). Sulphate ion, by forming strong ion pairs withmagnesium, reduces the hydration of the latter (Kralj et al 2004). This facilitatesmagnesium incorporation into growing calcite crystal and could result in simultaneoussulphate incorporation as an impurity in the mineral phase.In conclusion, strong correlations between skeletal Mg/Ca and S/Ca ratios wereevidenced in the calcitic skeleton of different echinoderms and hypercalcified spongespecies. We hypothesise that this correlation is due to the magnesium chelating propertiesof sulphates in solution, leading to a parallel incorporation of both elements in themineral. Even if sulphur co-occurs in organic and mineral skeletal phases, our resultsshowed that it is principally located in the mineral phase.AcknowledgementsThe authors wish to thanks Ph. Pernet, J. Navez, L. Monin and N. Dakhani for thespecimen analyses. T. Dupont provided technical support. R. Manconi and F. Ledda madepossible sample collection in Sardinia. This work was supported by a “Plan Action 2”grant (contract n r WI/36/F02), a “David and Alice Van Buuren” grant, the CALMARS IIproject from the Belgian Federal Science Policy, Brussels, Belgium (contract n rSD/CS/02A) and FRFC contract (n r 2.4532.07). Ph. Dubois is a Senior ResearchAssociate of the National Fund for Scientific Research (FRS-FNRS Belgium).92

Chapitre VCHAPITRE VRelative influences of solution composition and presence of intracrystalline proteinson magnesium incorporation in calcium carbonate minerals: insight into the vitaleffectsJulie Hermans 1&2 , Luc André 3 , Jacques Navez 3 , Philippe Pernet 1 and Philippe Dubois 1∗In preparationABSTRACTBiogenic calcites may contain considerable magnesium concentrations, significantlyhigher than those observed in inorganic calcites. Control of ion concentrations in thecalcifying space by transport systems and properties of the organic matrix ofmineralization are probably involved in the incorporation of high magnesium quantities.However, the relative effects of the magnesium and organic matrix concentrations in theprecipitation solution on magnesium incorporation into calcite have never beenquantified. In the present study, we performed in vitro precipitation experiments atdifferent Mg/Ca ratios in the solution (Mg/Ca solution ranging from 1:1 to 5:1) in presenceof soluble organic matrix macromolecules (SOM), extracted from sea urchin tests andspines, whose skeletal magnesium concentrations are respectively 9.8 and 3.4 mol%MgCO 3 . Amino acid analyses showed that test SOM were richer in Asx and Gly. HR-ICP-MS measurements of the precipitated minerals showed that, at a constanttemperature, the magnesium incorporation is mainly dependent on the Mg/Ca solution ratio.However, a significant increase in magnesium incorporation was observed in presence ofSOM compared with control experiments. Furthermore, test SOM induced a higherincrease than spine SOM. We suggested that this specificity could be linked to the relativeabundance of aspartic acid rich proteins in the amino acid assemblage. Proteinconcentration also influenced the magnesium concentrations in the in vitro precipitatedminerals. According to SEM observations, amorphous calcium carbonate was precipitatedat high Mg/Ca solution . The observed predominant effect of Mg/Ca solution , probably mediated∗ 1Marine Biology Laboratory (CP 160/15), Université libre de Bruxelles, 50 Avenue F.D. Roosevelt, B-1050, Belgium2Department of Invertebrates, Royal Belgian Institute of Natural Sciences, 29 Rue Vautier, B-1000, Belgium3 Section of Petrography-Mineralogy-Geochemisty, Royal Museum of Central Africa, 13 Leuvenstesteenweg, B-3080 Tervuren,Belgium93

Chapitre Vin vivo by ion transport to and from the calcifying space, was suggested to induce andstabilize a transient magnesium-rich amorphous phase essential to the formation of highmagnesium calcites. Asp-rich proteins further stabilize this amorphous phase. Theinvolvement of the organic matrix in this process can explain the observation thatsympatric organisms or even different skeletal elements of the same individual presentdifferent magnesium concentration in the mineralized skeleton.INTRODUCTIONMarine invertebrates produce calcite skeletons with a large variety of chemicalcompositions and morphologies. These biogenic calcites are composed of a dominantmineral phase including an intimately associated organic phase. The mineral phase maycontain considerable concentrations of magnesium, ranging from a few percents up to43.5 mol% of MgCO 3 , as the major ion substituted to calcium in the mineral lattice(Chave 1954, Schroeder et al 1969). Biogenic calcites may display higher magnesiumconcentrations than inorganically deposited calcites, produced either in nature or in thelaboratory (Cheng et al 2007, Wang et al 2009).The organic phase, the so-called organic matrix of mineralization, is mainly composed ofproteins and glycans. Despite its usually low concentration, the organic matrix ofmineralization plays an essential role in nucleation and crystal growth control. It affectsthe morphology of the deposited mineral and may determine the precipitated polymorph(Lowenstam & Weiner 1989, Simkiss & Wilbur 1989, Addadi & Weiner 1992, Falini etal 1996). In particular, proteins enriched in the carboxyl-rich acidic amino acids aspartateand glutamate are thought to play a significant role in the modulation of biomineralformation (Addadi & Weiner 1985, 1992, Politi et al 2007, Stephenson et al 2008).Magnesium concentrations in marine biogenic calcites are known to vary according toenvironmental parameters, such as temperature, salinity and Mg/Ca ratio in seawater,which prompted the use of calcite skeletons as paleorecorders (Clarke & Wheeler 1922,Lea et al 1999, Lea 2003, Ries 2004, Borremans et al 2009, Hermans et al 2010a, 2010b).However, magnesium concentrations in the skeleton of closely related taxa living in thesame environment can be very different, indicating that biological factors, the so-called“vital effects”, are also involved (Weiner & Dove 2003, Bentov & Erez 2006). The natureof these effects is, in most cases, poorly understood. Organic molecules and a biological94

Chapitre Vcontrol of ion concentrations in the calcifying space were suggested to be involved(Bentov & Erez 2006), but the relative effects of these parameters are still unexplored.At a constant temperature, the Mg/Ca ratio of in vitro deposited calcite is affected by thesame ratio in the solution. Skeletal Mg/Ca ratios of calcifying organisms grown inexperimental conditions were also shown to be directly, but not linearly, controlled by theMg/Ca ratio of seawater (Lorens & Bender 1980, Ries 2004). Biogenic calcites formthrough a transient phase of amorphous calcium carbonate (Aizenberg et al 1996a,Beniash et al 1997, 1999, Politi et al 2004) which has been suggested to affect themagnesium signature of the final crystal (Loste et al 2003, Wang et al 2009). Loste et al(2003) showed that the Mg/Ca ratio of transient amorphous calcium carbonateprecipitated in vitro was related to the Mg/Ca ratio of the precipitation solution, anddetermined the magnesium concentration in the resulting crystals. Han et al (2005) andCheng et al (2007) showed a nearly linear increase of magnesium content of in vitroprecipitated calcium carbonate minerals with the Mg/Ca ratio of the precipitationsolution.The ability of synthetic organic molecules to affect the magnesium concentration incalcites has been demonstrated by in vitro precipitation experiments. Kitano & Kanamori(1966) showed that sodium citrate and malate enhance magnesium incorporation intocalcite and reduce the formation of aragonite, which is the dominant precipitated mineralin inorganic magnesium-rich solutions. Biomimetic peptides and polypeptides (asparticacids) induce similar promoting effects on magnesium incorporation into calcite (Chenget al 2007, Stephenson et al 2008). However, Falini et al (1994) reported that magnesiumincorporation into crystals grown in vitro in presence of poly-L-aspartate was notenhanced, although this compound promoted the formation of calcite in magnesium-richsolution.Very few studies investigated the effect of genuine organic matrix molecules onmagnesium incorporation. According to these, the presence of organic matrix had no orlow impact on magnesium concentration in the precipitated mineral (Raz et al 2003,Gayathri et al 2007). However, these studies used only a single matrix concentration and,one of them a single solution Mg/Ca ratio, preventing a firm conclusion.95

Chapitre VSea urchins produce an intradermic skeleton of high-magnesium calcite. Magnesiumconcentrations in the skeleton differ according to the taxa (Weber 1969). In a consideredspecies, different skeletal elements may have contrasted magnesium concentrations(Weber 1969). For instance, the sea urchin test has a higher magnesium concentrationthan the spines in the same individual. This characteristic offers an interesting model tocompare the effect of possibly differentiated organic matrices without specific bias. In thepresent study, we investigated the relative influences of the Mg/Ca ratio in theprecipitation solution and the concentration and nature of genuine organic matrices on themorphology and Mg/Ca ratio of in vitro precipitated minerals.MATERIALS AND METHODSSpecimen collection and skeletal cleaning. Thirty adult Paracentrotus lividus werecollected by SCUBA diving in La Vesse (Bouches-du-Rhone, France). Their ambitaldiameters, measured using callipers, ranged from 44 to 61 mm with a mean (± S.D.) of50.6 ± 4.7 mm. They were dissected and stored at -20°C. The skeleton of spines and testwere cleaned from associated tissues with 2.5 % NaOCl (pro analysi) at 4°C on a rockingtable, during respectively 3 and 24 hours. Skeletal elements were rinsed 3 times in Milli Qwater (Millipore). The cleaning procedure was checked by an observation in a scanningelectron microscope. Interambulacral plates of the disarticulated test and primary spineswere selected and separately grounded in an agate mortar. These homogeneous skeletalpowders were stored at -20°C.Macromolecule extraction. The intraskeletal organic matrix macromolecules wereextracted from the mineral phase by decalcification using an ion exchange resin. Theskeletal powder (8 g) suspended in Milli Q water was enclosed in a dialysis tube(Spectra/Por MWCO 3.5kD) placed in a Plexiglas cylinder. Dowex (50WX8, 50-100mesh) ion exchange resin, prewashed with Milli Q water, was placed in the cylinder andMilli Q water containing 0.02 % NaN 3 was added to fill it. The cylinder was continuouslyrotated in a propeller-like mode at 4°C. The resin and Milli Q water were daily changed.After complete decalcification of the skeletal powder, the content of the dialysis bag wasdialysed against Milli Q water for 3 days. The volume of the extract was then reduced to2 ml by lyophilization. The soluble and insoluble materials were separated by 3centrifugations at 18.000 g, 4°C, for 15 min. This organic matrix extraction process wascarried out in parallel in four cylinders and the resulting extracts of soluble organic matrix96

Chapitre V(SOM) were combined, divided in aliquots frozen in liquid nitrogen and stored at -80°Cfor further use.Amino acid analysis. Amino acid compositions of spine and test extracts weredetermined by Alphalys. Samples were hydrolysed under reduced pressure, in 6 N HCl,0.1% phenol, 0.1% thioglycolic acid at 110°C for 20 hours. Identification andquantification of the amino acids took place on a BioChrom 30 amino acid analyzer usingion exchange chromatography, post-column derivatization with ninhydrin and detection attwo wavelengths, 570 nm and 440 nm. A known amount of the non-natural amino acidnorleucine (Nle) was added as an internal control standard.Crystal growth experiments. The crystallization experiments were performed in Nuncmultidishes (24 wells, 15 mm diameter), with glass coverslip (13 mm of diameter, VWRInternational) placed on the bottom of each well according to Albeck et al (1993). A totalvolume of 0.5 ml was introduced into each well: calcium chloride and magnesiumchloride solutions (0.05 mol/l, pro analysi, Merck) and SOM extract were poured inamounts fitting with the desired protein concentrations (1, 5 and 10 µg/ml) and molarMg/Ca ratios in the solution (Mg/Ca solution = 1:1; 3:1; 4:1; 5:1). Each well was sealedseparately with aluminium foil and punctured with a needle (21G). The multidish wasplaced into a closed dessicator with a vial containing NH 4 CO 3 (Merck, pro analysi) andcovered with parafilm punctured with a needle. The crystallization was performed for48 hours at a constant temperature of 18°C. Control experiments were carried out inabsence of organic additive, in absence of magnesium (at 0 and 10 µg/ml proteins) andwith Bovine Serum Albumine (BSA, 10 µg/ml) as a non-specific protein. The experimentwas also repeated without ammonium carbonate at Mg/Ca solution of 1:1 and 5:1, in absenceand presence of proteins (1 and 10 µg/ml) to check for magnesium and calciumadsorption on the coverslip. Elemental adsorption on the glass coverslip never exceeded3% of experimental values for both elements, indicating that almost all of the measuredcalcium and magnesium were effectively in the mineral deposits.After 48 hours, the glass coverslips were briefly rinsed with MilliQ water and air dried.Scanning Electron Microscopy (SEM) observations. For each treatment, 1 slide wasmounted on stub with double-side carbon tape. To increase conductivity, the samples97

Chapitre Vwere surrounded with conductive silver glue and gold coated. The slides were observedon a JEOL JSM-6100 SEM.High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy (HR-ICP-MS)analysis. For each treatment, 4 slides were mineralized in 140 µl HNO 3 (65%, suprapur,Merck) and 360 µl MilliQ water in a glass crystallizer. This solution was diluted 20 timesbefore analysis in a solution containing 1 µg/l In, which was used as internal standard.26 Mg and 43 Ca were analysed on a Thermo Finnigan Element 2. The analyticalreproducibility (2s) was 0.43 and 1.54, and accuracy was 1.23% and 3.5% for 26 Mg and43 Ca respectively. A multi-element calibration standard was prepared from certified singleelement stock solution. The certified reference material SLRS-4 was run for qualitycheck. Mg and Ca concentrations in the samples were converted to mol% MgCO 3 .Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry (ICP AES) analysis. Sixaliquots of 0.25g of both spine and test skeletal powders were mineralized in a Milestone1200mega microwave oven in 2.5 ml HNO 3 and 1 ml H 2 O 2 . The resulting solutions werefiltered on a GF/A Whatman filter, brought to a final volume of 25 ml with Milli Q water(Millipore) and diluted 10 times in acidified water prior to analysis. Mg and Caconcentrations of the solutions were analysed with an Iris Advantage (Thermo Jarrel Ash)ICP-AES. The calibration was achieved using artificial multi-elemental solutions madefrom certified mono-elemental solutions (Merck) and certified reference material JCp-1(coral) (Standard Geological Survey of Japan) was used for quality check. Results for thecertified reference materials analysis were always within ± 10% of the certified values.Data analyses. All statistical analyses were carried out using the Systat 9 software.Significance level was fixed at 0.05. For each type of SOM (test and spine), the influenceof Mg/Ca solution and protein concentration was assessed using forward stepwise multipleregression. The effects of 0 and 10 µg/ml concentrations and protein nature (BSA andboth extracts) on the Mg/Ca of formed minerals were also compared using a 2-wayANOVA (protein nature or absence and Mg/Ca solution as independent variables) and Tukeypost hoc test.98

Chapitre VRESULTSMagnesium and amino acid analysis of spine and testMean magnesium concentrations (±S.D., n=6) in the spine and test were, respectively,3.43 ± 0.04 mol% MgCO 3 and 9.84 ± 0.05 mol% MgCO 3 .The amino acid composition of the soluble organic matrix (SOM) of spines and tests arepresented in Table 16. Test SOM showed a higher proportion of Asx and Gly while spineSOM was richer in Pro.Table 16: Amino acid composition (mol %) of test and spine soluble organic matrices used in invitro crystallisation experiments.Test SpinesAsx 16.5 12.9Thr 4.1 6.5Ser 5.4 5.1Glx 10.9 12Gly 31.9 18.1Ala 13.6 11Val 4.4 4.9Met 0.4 2.2Ile 1.9 3.4Leu 1.7 4.6Tyr 1.7 2Phe 5.5 4.3His 0.4 1.1Lys 0 1.1Arg 0.9 1.9Pro 0.7 9Magnesium concentrations in in vitro precipitated mineralsThe magnesium concentrations of in vitro precipitated minerals varied significantlyaccording to the Mg/Ca solution ratio (p Regression < 10 -4 , Figure 32, Table 17) and proteinconcentration (1, 5 and 10 µg/ml, p Regression < 10 -2 , Figure 33, Table 17). It is noteworthythat the mineral Mg/Ca ratio was maximum when concentrations of 5 µg/ml of proteinswere introduced. Whatever the sequence of introduction of the variables, the stepwisemultiple regressions indicated the predominant effect of the Mg/Ca solution ratio (explainingrespectively 85 and 86% of the variation) compared to the effect of protein concentration(Table 17).99

Chapitre V3535Mineral Mg concentration (mol%MgCO3)30252015105Mineral Mg concentration (mol%MgCO3)3025201510500 2 4 6Solution Mg/Ca (mol/mol)00 2 4 6Solution Mg/Ca (mol/mol)ABFigure 32: Mean magnesium concentration (± S.D., n=4) in minerals precipitated in vitro inpresence of test (A) and spine (B) protein extracts, according to precipitation solution Mg/Ca andprotein concentration (♦ 0 µg/ml, ■ 1µg/ml, ▲ 5 µg/ml and × 10 µg/ml). Skeletal MgCO 3 of past seaurchins grown in different seawater Mg/Ca ratios (●) were calculated from Ries’ (2004) algorithmsfor echinoid plate (Mg/Ca skeleton =(0.000719×T+0.0292)Mg/Ca 0.668 SW ) and spine (Mg/Ca skeleton =(0.000837×T+0.0155) Mg/Ca 0.538 SW ), at 18°C.3535Mineral Mg concentration (mol%MgCO3)30252015105Mineral Mg concentration (mol%MgCO3)3025201510500 2 4 6 8 10 1200 2 4 6 8 10 12Protein concentration (µg/ml)Protein concentration (µg/ml)ABFigure 33: Mean magnesium concentration (± S.D., n=4) in minerals precipitated in vitro inpresence of test (A) and spine (B) protein extracts, according to protein concentration and solutionMg/Ca (♦ 1:1, ■ 3:1, ▲ 4:1, × 5:1 mol/mol).100

Chapitre VTable 17: Statistical results of the stepwise multiple regressions between the Mg/Ca ratio ofe in vitroprecipitated minerals and possible independent variables.MineralMg/CaMineralMg/CaAdditionalorganicmatrix1 st variable 2 nd variable 2 nd variable R 2 Sign. ofadditionalvariableSpine Mg/Ca Solution - - 0.85

Chapitre VMorphology of in vitro precipitated mineralsIn the absence of magnesium and organic additive, rhombohedra presenting the classical{1 0 4} faces precipitated (Figure 35A). In the absence of magnesium but in presence of10 µg/ml SOM, crystals exhibited well developed {104} faces terminated with roundededges with steps (Figure 35B).In the presence of magnesium, mineral shape was considerably modified. At lowmagnesium concentration (Mg/Ca=1:1), crystals (ca. 100 µm) were elongated along thec-axis, and showed rough curved surfaces, parallel to the c-axis, capped by rhombohedralfaces (Figure 35C). Progressive changes in morphology were observed with increasingMg/Ca solution . Deposits 35-40 µm in length, formed in a 3:1 Mg/Ca solution , presentedpeanut-like or dumbbell shaped morphologies (Figures 35D and 35E). Polycrystallineaggregates of 50 µm diameter were also observed. At higher Mg/Ca ratios (4:1 and 5:1), afilm covering the glass coverslip with small spherical particles of ~1 µm diameter wasdeposited (Figure 35F).Figure 35: Scanning electron micrograph of precipitated mineral grown (A) in absence ofmagnesium and organic additive, (B) in absence of magnesium with 10 µg/ml of test protein extract,in absence of organic additive in a (C) 1:1, (D and E) 3:1, and (F) 4:1 Mg/Ca solution102

Chapitre VTest and spine SOM also deeply affected the deposit morphology. These were rathersimilar with both extracts. With low protein concentration and Mg/Ca solution , elongatedcrystals, smaller (ca. from 60 to 80 µm) but more abundant than those formed in theabsence of proteins, were observed (Figures 36A and 37A). Higher protein concentrationsat low Mg/Ca solution induced formation of dumbbell shaped minerals, with angularextremities at 5 µg/ml concentrations (Figures 36B and 37B) and rounded extremities at10 µg/ml (Figures 36C and 37C). At 3:1, 4:1 and 5:1 Mg/Ca solution ratios, we couldobserve a dense cover of spherical particles of 1 µm diameter on cracked film (Figures36D and 36E). These particles formed chains resulting in small to large aggregates,without any correlation between the size of the aggregate and the Mg/Ca solution , nature orconcentration of the matrix (Figures 36F and 37D).Figure 36: Scanning electron micrograph of precipitated mineral grown in presence of spine proteinextract: (A) 1:1 Mg/Ca solution, 1 µg/ml protein, (B) 1:1 Mg/Ca solution, 5 µg/ml protein, (C) 1:1Mg/Ca solution, 10 µg/ml protein, (D) 3:1 Mg/Ca solution, 5 µg/ml protein, (E) 4:1 Mg/Ca solution,1 µg/ml protein, (F) 4:1 Mg/Ca solution, 5 µg/ml protein experiments103

Chapitre VFigure 37: Scanning electron micrograph of precipitated mineral grown in presence of test proteinextract: (A) 1:1 Mg/Ca solution, 1 µg/ml protein, (B) 1:1 Mg/Ca solution, 5 µg/ml protein, (C) 1:1Mg/Ca solution, 10 µg/ml protein, (D) 4:1 Mg/Ca solution, 10 µg/ml protein experiments²DISCUSSIONThe magnesium concentration in the deposited minerals increased with the Mg/Ca ratio ofthe solution, as reported in previous studies (Falini et al 1994, Han et al 2005, Cheng et al2007). This factor had a predominant effect on magnesium incorporation in comparisonwith the nature and concentration of soluble organic matrix (SOM). So, a biologicalcontrol of the precipitation solution could be sufficient to reach elevated magnesiumconcentrations reported in biogenic calcites.Most cases of biologically controlled biomineralizations occur in a compartment isolatedfrom the external environment and delimited by a biological membrane (vacuole,intercellular space, Lowenstam & Weiner 1989, Simkiss & Wilbur 1989). The ioniccomposition in the mineralization compartment can therefore be strictly biologicallycontrolled by the exchanges through this membrane. Seawater Mg/Ca ratio has beenshown to influence the skeletal Mg/Ca ratio of calcifying organisms (Lorens & Bender1980, Ries 2004) to a certain degree, and must therefore exert some influence on theMg/Ca of the solution in the calcification site. This dependence to seawater Mg/Caindicates that some non-selective transport mechanisms, like diffusion, are probably alsoinvolved.However, the Mg/Ca ratio of the in vitro inorganically precipitated minerals far exceededvalues measured in both past and present sea urchin skeletons. Using Ries’(2004)104

Chapitre Valgorithms, skeletal Mg/Ca of past sea urchins were calculated according to theexperimental Mg/Ca solution and temperature (Figure 32). All calculated values were muchbelow the ratio measured in in vitro precipitated minerals. So, magnesium-specifictransport mechanisms should be involved in the determination of the Mg/Ca ratio in thecalcifying space, probably lowering the magnesium concentration. In this context, itshould be noticed that in vitro deposits were grown from pure solutions of calcium,magnesium, carbonates and chloride, whereas in nature, ions like sodium are veryprobably present and also influence also the properties of the precipitated biogeniccalcites (Morse & Mackenzie 1990).We recorded a significant enhancement of magnesium incorporation in presence of SOMextracted from the sea urchin skeleton in comparison to precipitation experimentsperformed in absence of organic additive. This effect was not observed with BovineSerum Albumin, which indicates that the SOM effect was specific. Moreover, theenhancement of magnesium incorporation was more pronounced with SOM extractedfrom the test than with those extracted from the spines. The Mg/Ca ratio of P. lividus testbeing higher than the Mg/Ca ratio of the spines, this result further supports the hypothesisthat SOM has a specific effect on magnesium incorporation. This effect is probablymodulated by organic matrix composition and/or concentration.Indeed, amino acid compositions of sea urchin test and spine SOM were relativelydifferent, the test SOM containing more aspartate and glycine and less proline than thespines. High concentrations of glycine had already been reported in the skeletal organicmatrix of seastars (Dubois unpublished results, Gayathri et al 2007). Aizenberg et al(1996a) showed that this amino acid was more abundant in the amorphous than in thecrystalline phase of the spicules of the sponge Clathrina sp, and suggested itsinvolvement in the stabilization of such phases. Aspartic acid relative abundance was alsohigher in the test than in the spine SOM. Aspartic-rich proteins, which possess a domainthat possibly bind magnesium ions (Gotliv et al 2005), were suggested to play animportant role in the incorporation of this cation. Moreover, these proteins were shown tostabilize amorphous calcium carbonate (ACC) (Politi et al 2007) that affected magnesiumsignature of calcite (Loste et al 2003). In sea urchins, the saturation of such protein hasbeen suggested to limit the increase of magnesium incorporation with increasingtemperature (Hermans et al 2010b).105

Chapitre VA quadratic modulation of the magnesium incorporation in the precipitated minerals bythe protein concentration was observed at Mg/Ca solution ≥ 3. The magnesium incorporationwas higher at a protein concentration of 5 µg/ml than at 1 and 10 µg/ml. This could belinked to the inhibitory effect of high concentrations of organic matrix on calciumcarbonate nucleation, as described in numerous studies (Wheeler & Sikes 1984, Wilbur &Bernhardt 1984, Addadi & Weiner 1985, Wheeler et al 1988).The observed enhancement of magnesium incorporation in presence of genuine organicmatrix compared to controls without matrix was maximal in the precipitation experimentsperformed at a 3:1 Mg/Ca solution with a protein concentration of 5 µg/ml, for both matrixextracts. In these treatments, precipitated minerals were richer by 9 mol% MgCO 3 thanthose precipitated in absence of additive. This exceeded considerably the enhancementvalues (3 mol% MgCO 3 ) obtained in vitro with the addition of a simple biomimeticpeptide by Stephenson et al (2008). The extracted organic matrix macromolecules presenttherefore a stronger ability to enhance magnesium incorporation into calcium carbonatethan synthetic molecules.We do notice that our results differed from those of Raz et al (2003), who did not observean increase of magnesium incorporation in minerals precipitated in presence of organicmatrix macromolecules extracted from sea urchin larval spicules. We suggest that thisabsence of effect could be due to either the low Mg/Ca solution (2:1) used by these authors,or to the lyophilization to dryness of the SOM which could have affected theconformation of these macromolecules. The differences observed from the results ofFalini et al (1994) are probably linked to the analytical method, XRD, that did not takeinto account magnesium in the amorphous phase.The morphology of in vitro precipitated minerals was relatively similar to that describedin the literature. The magnesium induced curvation of crystal edges was already reportedby Meldrum & Hyde (2001). The elongation of crystal along the c-axis in presence oforganic additives was observed by Albeck et al (1993, 1996) and Meldrum & Hyde(2001). The dumbbell shaped minerals have been characterized as magnesium calcite(Raz et al 2000, Meldrum & Hyde 2001, Gayathri et al 2007). Peanut like deposits werereported by Loste et al (2003). Spherical particles similar to those observed in this studyat high Mg/Ca solution were reported in previous studies (Han et al 2005, Kwak et al 2005,Cheng et al 2007) and characterized as a mixture of calcite and ACC with high106

Chapitre Vmagnesium concentration. Kwak et al (2005) highlighted the importance of thecrystallization pathway in impurity entrapment into calcite (Kwak et al 2005).Mineralization through an ACC transient phase is suggested to be an essential step in theformation of high magnesium calcites (Raz et al 2000, Loste et al 2003, Cheng et al 2007)and has been showed to be favoured in magnesium-rich solutions (Kwak et al 2005). TheACC has been suggested to be stabilized by high concentration of magnesium in thesolution (Raz et al 2000, Loste et al 2003). Moreover, the stabilization of ACC has beendemonstrated to be also partially completed by the organic matrix (Raz et al 2000, 2003).Once formed, this amorphous phase favours the incorporation of elevated quantities ofmagnesium, and these high concentrations are conserved in the crystal after crystallisationand co-occurring water expulsion (Loste et al 2003). Raz et al (2000) suggested that theincorporation of high magnesium levels results from a combined effect of an elevatedMg/Ca ratio in the precipitation compartment and the involvement of an organic matrixinducing the formation and stabilization of an ACC. Our observations suggest a possiblelink between the relative abundance of aspartic acid rich proteins in the organic matrixand the magnesium incorporation, which probably proceed through ACC stabilization bythe Asp-rich proteins.In conclusion, we showed that solution Mg/Ca ratio is the main factor affectingmagnesium incorporation in in vitro precipitated calcium carbonate deposits. Organicmatrix macromolecules induced an enhancement of magnesium incorporation in themineral. This effect has been shown to be specific and more pronounced for SOMextracted from a magnesium-richer skeletal element. We suggest that the origin of thisenhancement arises from the combined effects of high Mg/Ca ratio in solution andpresence of organic matrix, both inducing and stabilizing a magnesium-rich amorphousphase. The involvement of the organic matrix in this process can explain the observationthat sympatric organisms or even different skeletal elements of the same individualpresent different magnesium concentration in the mineralized skeleton.AcknowledgementsThe authors wish to thanks C. De Bruyn for its SCUBA diving assistance, S. M’zoudi fortechnical support, Ph. Compère for providing the protein extraction device, and N.Dakhani for the specimen analysis. This work was supported by a “Plan Action 2” grant(contract n r WI/36/F02), a “David and Alice Van Buuren” grant, the CALMARS II107

Chapitre Vproject from the Belgian Federal Science Policy, Brussels, Belgium (contract n rSD/CS/02A) and FRFC contract (n r 2.4532.07). Ph. Dubois is a Senior ResearchAssociate of the National Fund for Scientific Research (FRS-FNRS Belgium).108

Discussion généraleDISCUSSION GÉNÉRALE1. Facteurs biologiques et environnementauxLa détermination du rapport Mg/Ca dans les squelettes calcitiques est le résultat de lasuperposition d’effets environnementaux et biologiques.Dans ce travail, les relations entre la concentration en magnésium squelettique et latempérature et la salinité de l’eau de mer ont été caractérisées par des études en conditionscontrôlées pour la première fois chez des échinodermes (chapitres 2 et 3). Ce type d’étuden’a pu être réalisé chez l’éponge hypercalcifiée Petrobiona massiliana, qui ne survit pasen aquarium et qui a donc été étudiée en milieu naturel (chapitre 1). La discontinuité de lacroissance squelettique démontrée chez cette espèce dans le présent travail renddifficilement réalisable l’établissement d’un parallélisme entre la température et lacomposition chimique mesurée par une analyse localisée (de type spectrométrie de massecouplée à une ablation laser). Chez cet organisme, les analyses ont donc été réalisées surl’ensemble du squelette et mises en rapport avec la température moyenne annuelle locale.Dans les 3 modèles étudiés, une fois les facteurs génétiques (espèce) et structurels(élément squelettique) fixés, nous avons mis en évidence un effet positif de la températuresur l’incorporation du magnésium (Tableau 18). Chez Asterias rubens, un effet positif dela salinité a été démontré. Enfin, dans plusieurs taxons calcitiques, le rapport Mg/Ca dusquelette est influencé par celui de l’eau de mer (Lorens & Bender 1977, 1980, Ries2004).Tableau 18 : Tableau récapitulatif de l’importance des différents effets environnementaux etbiologiques affectant le rapport Mg/Ca des squelettes étudiés dans le présent travail, exprimée enterme du pourcentage de la variabilité de ce rapport attribuable au facteur considéré (ND = nondéterminé).Petrobiona massilianaParacentrotus lividusAsterias rubensEffets environnementauxEffets biologiquesTempérature Salinité Taux decroissanceEffets biologiquesà l’exclusion dutaux de croissanceRelation positive ND ND ND72%Relation positive Pas d’effet Pas d’effet 44%56%Relation positive Relation positive Pas d’effet 43%32%25%109

Discussion généraleDans cette discussion générale, nous tenterons de déterminer quels sont les processus quipeuvent expliquer ces effets environnementaux. Pour ce faire, nous commencerons parpasser en revue les facteurs biologiques impliqués dans l’incorporation du magnésiumdans le squelette. En effet, nous considérons que la dichotomie classique appliquée engéochimie entre effets environnementaux et effets « vitaux » n’a pas de raison d’être.Nous essayerons de démontrer que les facteurs de l’environnement ne font que modulerles processus biologiques impliqués (et non le contraire).L’influence prépondérante de la concentration en magnésium de la solution deprécipitation sur la détermination de celle des minéraux de carbonate de calcium qui ysont précipités a été mise en évidence in vitro (chapitre 5). La concentration des différentsions au site de calcification peut notamment être régulée par une localisation des systèmesde transport spécifiques dans la membrane du site de calcification. Chez leséchinodermes, où les ossicules sont formés dans une vacuole intra-syncitiale, ledéveloppement localisé de systèmes de transport spécifiques au magnésium permettrait deréguler le rapport Mg/Ca au site de calcification, sans affecter les concentrations de ceséléments dans le cytosol des sclérocytes, qui doit rester stable pour l’homéostasie de cescellules. Chez P. massiliana, le squelette basal est déposé par les basopinacocytes sur lesquelette déjà formé au niveau de l’espace extrapinacodermal délimité par ces deuxcomposantes (Reitner 1989). Un système de transport vésiculaire et d’exocytose à partirdes basopinacocytes délivre probablement les ions dans l’espace de minéralisation (Gilis,communication personnelle).Les concentrations en magnésium mesurées dans les minéraux formés in vitro dépassentlargement celles des biominéraux déposés par les organismes calcitiques en milieu naturel(chapitre 5). Néanmoins, ces minéraux ont été formés dans des solutions de rapportMg/Ca équivalent à celui de l’eau de mer actuelle, source connue du calcium squelettique(Nakano et al 1963, Dafni & Erez 1987, Lewis et al 1990), et probablement aussi dumagnésium (Planchon, communication personnelle). Ce résultat suggère que le rapportMg/Ca dans le compartiment de minéralisation pourrait notamment être contrôlé par desmécanismes physiologiques d’exclusion du magnésium. L’existence de tels mécanismes adéjà été suggérée dans le cas des mollusques bivalves (Lorens & Bender 1977) et desforaminifères planctoniques (Erez 2003, Zeebe & Sanyal 2002, Segev & Erez 2006). Ilfaut toutefois noter que ces organismes produisent des tests de calcite de rapport Mg/Ca110

Discussion généralenettement inférieur à celui mesuré dans les squelettes d’échinodermes (1 à 10 mmol/molvs 100 mmol/mol respectivement) et doivent posséder des mécanismes d’exclusionbeaucoup plus performants. Bentov & Erez (2006) ont suggéré un modèle decompartimentation spatiale et temporelle des flux de magnésium chez les foraminifèresplanctoniques: chez ces organismes unicellulaires, l’eau de mer serait internalisée dansune vacuole et directement transportée au site de calcification, où elle tient lieu desolution de calcification, probablement caractérisée par un rapport Mg/Ca relativementélevé ; le magnésium excédentaire serait transporté de la vacuole de minéralisation vers lecytoplasme par des canaux sélectifs exploitant le gradient électrochimique ; une partie dumagnésium serait éliminé du cytoplasme par des mécanismes de transport actif et lemagnésium en excès serait chélaté par des phospholipides, protéines, acides nucléiquesvariés, ou séquestré dans des organites (réticulum endoplasmique, mitochondrie) ou parl’ATP de manière à maintenir la concentration cellulaire (Romani & Scarpa 2000). Demême, selon Lorens & Bender (1977), les bivalves, et en particulier Mytilus edulis,seraient capables de réguler la concentration en magnésium dans le site de précipitation,de manière à y maintenir des concentrations optimales. Une fois le mollusque exposé àdes rapports Mg/Ca extrêmes, cette capacité de régulation ionique est toutefois dépasséeet s’effondre, permettant une entrée massive d’ions magnésium dans le fluide deprécipitation résultant en des concentrations squelettiques anormalement élevées.Les mécanismes de transport spécifiques au magnésium décrits à ce jour ont été présentésdans l’introduction générale de cette thèse. Le co-transport Ca 2+ /Mg 2+ est particulièrementintéressant dans le cas qui nous occupe. Un transporteur de type antiport Ca 2+ /Mg 2+ ,semblable à ceux décrits chez des cellules de mammifères (Cefaratti et al 1998, 2000), serévèlerait doublement efficace dans une réduction du rapport Mg/Ca dans lecompartiment de minéralisation. Il faut noter qu’étant donné l’absence actuelle d’étudesdes systèmes de transport du magnésium propres aux organismes calcitiques, l’existenced’un tel transporteur chez les échinodermes reste spéculative.Les calcites biogéniques étudiées dans le présent travail contiennent de fortesconcentrations en magnésium, largement supérieures à celles des calcites inorganiques.Néanmoins, en solution fortement concentrée en magnésium, telle que l’est l’eau de mer,la formation de calcite, défavorisée thermodynamiquement au profit de celle d’aragoniteen conditions inorganiques, est favorisée par la présence des molécules de la matrice111

Discussion généraleorganique produites par l’organisme calcifiant (Falini et al 1996, Wada et al 1999, Raz etal 2000, Takeuchi et al 2008). Les mécanismes permettant l’incorporation de hautesconcentrations en magnésium dans ces calcites sont toutefois encore relativement malconnus. La principale contrainte s’opposant à l’incorporation du magnésium dans lacalcite en formation est la forte hydratation de ce cation. Les deux mécanismes principauxpermettant de contourner cette contrainte sont la présence de chélateurs du magnésium etle passage par une phase transitoire de carbonate de calcium amorphe (CCA).L’intervention de ces deux mécanismes concorde avec les résultats obtenus au cours de cetravail (chapitres 2, 3, 4, 5).La présence d’agents chélateurs permet de diminuer la concentration en ions magnésiumfortement hydratés en solution (Kralj et al 2004). Cette fonction a notamment étésuggérée pour les molécules de la matrice organique (Kitano & Hood 1965, Albeck1993). Selon Albeck (1993), ces molécules jouent le rôle de chélateur du magnésium, demanière à ce que ce cation arrive au nucléus en croissance partiellement déshydraté,contribuant ainsi à diminuer la barrière énergétique s’opposant à l’incorporation de cecation dans la calcite. Dans le présent travail, nous avons décrit une corrélation entre lesrapports Mg/Ca et S/Ca de la phase minérale du squelette des échinodermes (chapitre 4).Le magnésium en solution formant de fortes paires ioniques avec les sulfates (Kralj et al2004), nous suggérons que ces derniers jouent un rôle de chélateur ionique similaire àcelui des molécules de la matrice favorisant ainsi l’incorporation du magnésium dans leminéral et permettant la formation de calcite hautement magnésienne.Un mécanisme complémentaire permettant l’incorporation de concentrations élevées demagnésium dans une calcite biogénique est le passage par une phase intermédiaire decarbonate de calcium amorphe (CCA). Ce minéral est plus modulable qu’une phasecristalline et peut incorporer de grandes quantités de magnésium (partiellement) hydratédans sa structure. Or, le CCA est un minéral particulièrement soluble et doit être stabilisé.Sa formation et sa stabilisation peuvent résulter de la présence de fortes concentrations enmagnésium dans le compartiment de précipitation et de l’action des molécules de lamatrice organique. Il a en effet été démontré que les ions étrangers incorporés dans laphase de CCA, tels que le magnésium et les phosphates, contribuent à sa formation et à sastabilisation (Loste et al 2003, Addadi et al 2008). Le magnésium en solution augmente ledegré de sursaturation et induit la précipitation de particules métastables amorphes,cristallisant ensuite en une polymorphe déterminée par les conditions ambiantes (Raz et al2000). Nos observations morphologiques des minéraux de carbonate de calcium formés in112

Discussion généralevitro dans une solution de rapport Mg/Ca élevé (Mg/Ca ≥ 4 mol/mol) indiquent laprésence d’une phase morphologiquement identique à du CCA. Les analyses chimiqueseffectuées démontrent une concentration élevée en magnésium dans les minéraux ainsiformés.Il a récemment été démontré que les protéines de la matrice organique riches en acidesaspartiques (Asp) interviennent dans la stabilisation temporaire de la phase de CCA descalcites biogéniques (Politi et al 2007). Dans les minéraux formés in vitro, la présence dematrice organique extraite du test de Paracentrotus lividus résulte en une incorporation demagnésium supérieure à celle induite par la matrice extraite des piquants, concordant avecle fait que, chez les oursins, le test contient des concentrations en magnésium plus élevéesque les piquants (Weber 1969 et chapitre 5). Nous attribuons ces résultats à la plus grandeabondance relative en Asp dans la matrice du test par rapport à celle des piquants, révéléepar les analyses d’acides aminés. Nous suggérons que, via leur capacité à stabilisertemporairement l’ACC, ces protéines permettent l’incorporation de grandes quantités demagnésium dans la calcite. En effet, l’abondance relative de l’Asp dans l’assemblage totaldes acides aminés est systématiquement élevée dans les calcites magnésiennesbiogéniques, notamment chez les foraminifères (King & Hare 1972, Weiner & Erez 1984,Robbins & Drew 1990), les brachiopodes (Jope 1967), les mollusques (Weiner 1979) etles échinodermes (Weiner 1985, chapitre 5). Cette hypothèse est renforcée par le fait queles protéines riches en Asp, absentes de la partie aragonitique, semblent être spécifiquesdes parties calcitiques de la coquille des mollusques (Gotliv et al 2005).Comment les processus biologiques décrits ci-dessus sont-ils influencés par les facteursenvironnementaux ? La relation entre le rapport Mg/Ca du squelette et celui de l’eau demer, notamment observée chez des oursins (Ries 2004), suggère que l’incorporation dumagnésium implique aussi des mécanismes de diffusion. Les transports ioniques chez leséchinodermes sont encore mal connus. Chez ces animaux osmoconformes, la compositiondu liquide coelomique est très proche de celle de l’eau de mer, à l’exception desconcentrations en calcium et en potassium qui y sont régulées (Binyon 1962, Stieckle &Diehl 1967). De plus, la dépendance à la salinité du rapport Mg/Ca squelettique observéechez Asterias rubens nous permet de supposer que ces deux éléments seraient incorporésà partir du liquide coelomique (chapitre 3). Ceci signifierait donc que des systèmes detransport du magnésium, excluant celui-ci du site de calcification, agiraient de façonconstante à partir du rapport Mg/Ca imposé par l’eau de mer (et non suivant un processus113

Discussion généralede régulation tendant vers une valeur cible). Cette hypothèse est consistante avec un cotransportCa 2+ /Mg 2+ de type antiport. Le calcium devant être transporté vers le site decalcification, une proportion correspondante de magnésium (indépendante de laconcentration initiale de cet ion) en serait exclue. L’effet de la salinité est égalementcompatible avec cette hypothèse. Les mécanismes de régulation du calcium modifieraientle rapport Mg/Ca du liquide coelomique, celui-ci diffusant ensuite dans les tissus. L’effetde la température est plus complexe à expliquer. La précipitation du minéral se déroulepar l’intermédiaire d’une phase amorphe (et ce phénomène serait généralisé, Weiner et al2003). L’effet thermodynamique postulé pour expliquer l’effet de la température peut-ilencore être invoqué ? Dès lors, comment expliquer l’effet de la température surl’incorporation du magnésium ? La formation des paires ioniques entre le magnésium etles sulfates étant inversement liée à la température (Kester & Pytkowicz 1970), ne peutêtre à l’origine de cet effet. On pourrait supposer que l’incorporation du magnésium dansle CCA est, comme dans le cas de la calcite, un processus endothermique favorisé auxhautes températures. Néanmoins, il n’existe à ce jour pas de données thermodynamiquesconfirmant une telle hypothèse. Une autre hypothèse possible est la stabilisation accrue duCCA à température élevée, liée par exemple à la relation inverse liant la solubilité de cettephase minérale avec la température (Brečević & Nielsen 1989), ou à un optimumthermique de l’activité des protéines de la matrice organique.La relation positive entre le rapport Mg/Ca du test de P. lividus et la température de l’eause stabilise pour former un plateau aux hautes températures (chapitre 2). Nous avonssuggéré que le plateau observé puisse être lié à une saturation des macromolécules de lamatrice hydratant la phase de CCA, ne permettant ainsi plus d’incorporationsupplémentaire de magnésium hydraté au sein de cette phase (chapitre 2). Il pourrait aussis’agir d’une saturation de la capacité de la matrice organique à stabiliser le CCA. Unetelle saturation du rapport Mg/Ca aux hautes températures n’a jamais été signalée dansd’autres groupes calcitiques au rapport Mg/Ca squelettique élevé, et semble donc propreaux échinodermes.Chez les échinodermes, nous avons observé que 43 à 44% de la variabilité du rapportMg/Ca squelettique est liée à des effets biologiques distincts du taux de croissance(Tableau 18). Cette variation individuelle peut résulter de contrôles physiologiques directsou indirects, tels qu’une chimie variable de la solution de précipitation résultant d’un114

Discussion généralecontrôle biologique des transports ioniques vers ou en dehors du compartiment deprécipitation (Freitas et al 2008). Une telle variabilité du rapport Mg/Ca squelettique liéeà des processus physiologiques a aussi été observée dans les autres groupes calcitiques.Des foraminifères benthiques cultivés en conditions contrôlées présentent des variationsinterindividuelles non négligeables, attestant de l’importance de l’influence de lavariabilité biologique chez ces organismes (Hintz et al 2006). Chez les mollusquesbivalves, le rapport Mg/Ca n’est que faiblement corrélé à la température mais est affectépar une grande variabilité inter et intra-individuelle (Freitas et al 2008).Des modulations de la localisation et la densité des mécanismes de transport à la surfacedu site de calcification d’une part, et de la composition et de la concentration en matriceorganique d’autre part peuvent donc être à l’origine de la variation des concentrationssquelettiques en magnésium entre espèces sympatriques, même proches. Ces modulationspeuvent aussi expliquer la variabilité individuelle au sein d’une même espèce et entreéléments squelettiques au sein d’un même individu.Pour synthétiser, nous proposons que, chez les organismes pluricellulairesosmoconformes, le rapport Mg/Ca des squelettes calcitiques dépende de mécanismesbiologiques modulant les processus minéralogiques et les effets environnementaux selonle modèle suivant (Figure 38). L’eau de mer diffuserait vers les fluides internes,éventuellement avec une régulation des concentrations de certains ions, dont le calcium.Ces fluides internes atteindraient eux-mêmes le site de calcification par diffusion, d’oùune partie du magnésium serait exclu par des transporteurs spécifiques. Le rapport Mg/Caau site de calcification resterait cependant suffisamment élevé pour induire la formationde CCA, et l’incorporation du magnésium dans cette phase amorphe serait facilitée par lachélation partielle de cet ion par les sulfates. Ce CCA serait stabilisé par lesmacromolécules de la matrice riches en Asp. Il cristalliserait ensuite par expulsion del’eau, le cristal conservant le rapport Mg/Ca du CCA. Durant ce processus, la températureaugmenterait le rapport Mg/Ca en agissant sur la phase amorphe. La salinité et le rapportMg/Ca de l’eau de mer affecteraient le rapport Mg/Ca des fluides internes respectivementau travers de la régulation sélective du calcium dans les fluides internes et la diffusion desions à travers les structures biologiques.115

Discussion généraleFigure 38 : Modèle d’incorporation du magnésium dans le squelette des échinodermes, établi surbase des résultats de la présente thèse et représentant les facteurs environnementaux etphysiologiques affectant le processus d’incorporation de cet ion.2. Le rapport Mg/Ca en tant qu’enregistreur des conditions environnementalesLe rapport Mg/Ca peut-il être considéré comme un enregistreur valable des conditionsenvironnementales ? L’aspect spécifique se doit d’être pris en compte ainsi qu’en attestel’importance des processus biologiques impliqués. Il semble exclu de considérer lesassemblages poly-spécifiques comme enregistreurs. Ceci rend l’utilisation de fossilesdélicate, seules les morpho-espèces pouvant être déterminées, dont rien n’indique qu’ellesne rassemblent pas des espèces jumelles à la physiologie contrastée. En outre, lavariabilité individuelle n’est, le plus souvent, pas prise en compte dans les études decalibration du rapport Mg/Ca en tant qu’enregistreur de la température ou du rapportMg/Ca de l’eau de mer. Chez les foraminifères, les régressions liant la variation durapport Mg/Ca squelettique et la température sont le plus souvent établies sur base dedonnées qui, en plus d’être d’un effectif peu élevé, sont moyennées par température, cequi annule la variabilité individuelle (et augmente le R 2 de manière non négligeable, cfLea et al 1999, Kisakürek et al 2008).Cette variabilité biologique introduit une erreur importante dans les reconstructionsutilisant le rapport Mg/Ca comme traceur des conditions environnementales. En outre,elle peut elle-même différer en fonction des conditions ambiantes (Weiner & Dove 2003).116

Discussion généraleLa plus grande prudence s’impose donc dans l’utilisation des rapports Mg/Casquelettiques dans le cadre de reconstructions paléo-environnementales. Uneconnaissance accrue des processus biologiques sous-jacents apparaît particulièrementnécessaire.117

Discussion générale3. PerspectivesIl apparaît clairement que la détermination des voies d’incorporation du magnésium estprimordiale. Contrairement au calcium, l’utilisation d’isotopes radioactifs permettant unevisualisation directe des flux au travers l’épiderme n’est que difficilement applicable dansle cas du magnésium: en effet, les seuls isotopes utilisables de cet élément ont des duréesde demi-vie particulièrement courtes (le 28 Mg n’a qu’une durée de demi-vie de 21 heures,Lusk & Kennedy 1969). Les voies d’incorporation pourraient être déterminées vial’exposition à différents rapports Mg/Ca. Le magnésium pourrait être détecté enmicroscopie électronique à transmission couplée à une sonde de micro-analyses à rayonsX, une technique déjà utilisée chez les coraux (Marshall 2002, Marshall et al 2007). Demanière à éviter les artéfacts chimiques, des techniques de cryofixations et decryosubstitution permettraient d’observer des coupes de spécimens non décalcifiés. Si ellene pose pas de problème dans le cas de l’éponge, où l’espace de minéralisation estrelativement simple à situer, l’application de cette technique aux échinodermes se révèlede prime abord possible mais extrêmement aléatoire. En effet, chez ces organismes,l’espace de calcification est intradermique et de très petite taille (1 à 5 µm, Ameye et al1998, 1999), et ne peut être localisé avec certitude comme c’est le cas de l’espace extrapinacodermaldes éponges hypercalcifiéesL’application de la spectrométrie de masse à ionisation secondaire (SIMS et nano-SIMS àhaute résolution) sur ces coupes, qui présente les mêmes aléas chez les échinodermes quela précédente méthode, permettrait une visualisation directe des ions dans la cellule et lecompartiment de minéralisation (cf Marshall et al 2007 chez les coraux). On pourrait ainsicomparer des spécimens soumis à des incubations dans des eaux de mer de différentsrapports Mg/Ca ou à des rapports d’isotopes stables du magnésium et du calciummodifiés.La détermination du rapport Mg/Ca au niveau du site de calcification résoudrait denombreuses incertitudes. La minéralisation a-t-elle lieu à un rapport Mg/Ca équivalent àcelui de l’eau de mer ou diminué par exclusion du magnésium du site de calcification ?Les colorants fluorescents sont couramment utilisés pour étudier le transport et larégulation des éléments dans les systèmes biologiques. Le Furaptra (mag-fura-2) est uncolorant fluorescent liant le magnésium qui permet de déterminer la concentrationintracellulaire en ce cation, de manière similaire au FURA-2 pour le calcium (Raju et al1989, Günther 2006). Il émet une fluorescence proportionnelle à la concentration118

Discussion généraleintracellulaire. Nous suggérons des expériences de cultures cellulaires de cellulesmésenchymateuses primaires 1 de larve d’oursins en présence de ces colorants, à différentsrapports Mg/Ca. De même, les larves d’oursins, translucides, permettent des mesures invivo en microscopie confocale. Néanmoins, l’exactitude de cette technique reste limitéepar l’existence d’une certaine affinité du Furaptra pour le calcium.Une approche moléculaire pourrait être intéressante. En effet, la caractérisation génétiqueet biochimique de plusieurs transporteurs du magnésium a été réalisée dans une grandediversité d’organismes allant des bactéries (Gardner 2003) jusqu’aux mammifères(Quamme 2010). Le génome de l’oursin ayant été décrit (The Sea Urchin GenomeSequencing Consortium 2006), il serait possible, via leurs séquences, de retrouver quelstypes de transporteurs sont présents et dans quels tissus ils s’expriment.1 Les cellules mésenchymateuses primaires sont les seules cellules squelettogènes d’échinoderme qui ontété mises en culture avec succès (pour une synthèse, voir Wilt & Benson 2004)119

Discussion générale120

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AnnexesANNEXESANNEXE 1Tableau 19: Taux de croissance individuels et rapports Mg/Ca et Sr/Ca squelettiques desParacentrotus lividus élevés en aquarium dans différentes conditions, et température et salinitécorrespondantes (Chapitre 2).température salinité individu Taux de croissance Mg/Ca squelttique Sr/Ca squelettique°C psu mg/d mol/mol mol/mol1 0.05 0.0931 0.00292 0.09 0.0941 0.00303 0.22 0.0886 0.002913.5 36.024 0.13 0.0884 0.00295 0.37 0.0930 0.00306 0.06 0.0920 0.00287 0.16 0.0992 0.00308 0.14 0.0983 0.00301 0.17 0.0885 0.00282 0.18 0.1011 0.002913.23 39.033 0.14 0.0924 0.00284 0.14 0.0921 0.00285 0.30 0.0846 0.00296 0.15 0.0899 0.00281 0.04 0.1050 0.00302 0.02 0.1248 0.00323 0.21 0.1053 0.003218.48 36.144 0.33 0.1021 0.00325 0.02 0.1064 0.00316 0.42 0.1071 0.00317 0.28 0.1082 0.00318 0.38 0.1059 0.00331 0.27 0.1166 0.00312 0.13 0.1042 0.00303 0.34 0.1130 0.00304 0.29 0.1223 0.003018.82 39.16 5 0.04 0.1129 0.00286 0.17 0.1059 0.00317 0.02 0.1060 0.00288 0.15 0.1120 0.00309 0.12 0.1244 0.0029

Annexestempérature salinité individu Taux de croissance Mg/Ca squelttique Sr/Ca squelettique°C psu mg/d mol/mol mol/mol1 0.21 0.1380 0.003120.66 36.1220.83 39.0424.3 36.32 0.03 0.1076 0.00293 0.27 0.1129 0.00344 0.11 0.1338 0.00325 0.25 0.1296 0.00326 0.10 0.1079 0.00297 0.44 0.1188 0.00338 0.25 0.1123 0.00329 0.20 0.1017 0.003010 0.16 0.1098 0.003111 0.25 0.1319 0.00331 0.22 0.1131 0.00302 0.12 0.1132 0.00313 0.05 0.1202 0.00284 0.43 0.1037 0.00315 0.07 0.1039 0.00336 0.60 0.1132 0.00327 0.04 0.1036 0.00288 0.09 0.1036 0.00281 0.19 0.1236 0.00302 0.31 0.1079 0.00303 0.03 0.1081 0.00294 0.10 0.1143 0.00305 0.06 0.1180 0.00296 0.24 0.1378 0.00317 0.08 0.1112 0.00298 0.08 0.1101 0.00269 0.13 0.1180 0.003210 0.02 0.1304 0.003011 0.04 0.1102 0.002712 0.35 0.1365 0.003113 0.06 0.1131 0.0029

Annexestempérature salinité individu Taux de croissance Mg/Ca squelttique Sr/Ca squelettique°C psu mg/d mol/mol mol/mol1 0.10 0.1170 0.003124.18 39.172 0.09 0.1114 0.00273 0.21 0.1289 0.00304 0.08 0.1142 0.00305 0.06 0.1186 0.00306 0.12 0.1130 0.00307 0.10 0.1236 0.00288 0.07 0.1158 0.00289 0.08 0.1138 0.002910 0.32 0.1195 0.003111 0.08 0.1271 0.002712 0.02 0.1195 0.002813 0.11 0.1183 0.0031

AnnexesANNEXE 2Tableau 20: Rapports Mg/Ca et Sr/Ca squelettiques des Asterias rubens élevées en aquarium dansdifférentes conditions, et température et salinité correspondantes (Chapitre 3).Température Salinité Mg/Ca Sr/Ca(°C) (psu) mmol/mol mmol/mol92.66 2.4288.79 2.4491.79 2.4590.84 2.4511 3290.81 2.4189.24 2.4198.64 2.4799.05 2.4195.64 2.4396.19 2.4094.38 2.48106.32 2.45104.58 2.41104.39 2.4511 3596.12 2.49102.60 2.4692.49 2.47105.19 2.4096.23 2.4586.66 2.2996.10 2.3586.66 2.2611 2589.92 2.2388.29 2.3288.46 2.2893.35 2.2495.80 2.3398.78 2.3387.05 2.3311 2891.61 2.2492.79 2.3490.57 2.3393.72 2.3487.81 2.37100.86 2.39114.36 2.2618 32 102.52 2.34102.19 2.33105.37 2.3518 35 112.73 2.3994.66 2.2518 2595.93 2.2291.03 2.2395.34 2.2092.97 2.20

AnnexesTempérature Salinité Mg/Ca Sr/Ca(°C) (psu) mmol/mol mmol/mol95.25 2.2897.30 2.3099.10 2.2018 28 104.80 2.28100.00 2.2296.05 2.26102.77 2.24

Annexes