兔出血症病毒(RHDV)的基因组序列分析及其非结构蛋白VPg的 ... - abc

兔 出 血 症 病 毒 (RHDV) 的 基 因 组 序 列 分 析 及其 非 结 构 蛋 白 VPg 的 结 构 和 功 能 预 测The analysis of RHDV genome sequence and the prediction of thestructure and function of its unstructured protein VPg报 告 人 : 朱 杰组 员 : 张 悦 邹 洁 驰袁 炜2013 年 6 月 21 日

主 要 内 容RHDV 相 关 介 绍非 结 构 蛋 白 VPg 的 结 构 预 测非 结 构 蛋 白 VPg 的 功 能 预 测讨 论

兔 病 毒 属 (Lagovirus)(RHDV)诺 瓦 病 毒 属 (Norovirius)(NV)杯 状 病 毒 科Caliciviridae扎 幌 样 病 毒 属 (Sappovirus) (SV)水 疱 疹 病 毒 属 (Vesivirus)(SVEV)

1.1 RHDV 基 因 组 分 析•• RHDV 为 单 股 正 链 RNA 病 毒 , 基 因 组 全 长 为 7464bp。 从 相 关 文 献 中 得知 :RHDV 有 两 个 读 码 框 ORF1 和 ORF2, 它 们 在 7025-7378 存 在 重 叠 区域 。• 我 们 利 用 GenBank 中 登 录 号 为 :DQ205345.1 的 RHDV 全 长 基 因 组 序 列进 行 分 析 :• 利 用 plotorf(v6.0.1) 对 全 基 因 组 进 行 分 析 : 显 示 读 码 框 呈 连 续 状态 。。orf 2orf 1• 。

1.2 VPg• VPg 是 由 RHDV 基 因 组 ORF1 编 码 一 个 257kDa 的 蛋 白 的 多 聚 蛋 白前 体 , 该 多 聚 蛋 白 在 胰 蛋 白 样 半 胱 氨 酸 蛋 白 酶 的 水 解 作 用 下 , 产生 包 括 VPg 在 内 的 七 种 非 结 构 蛋 白 和 主 要 的 结 构 蛋 白 (VP60),VPg由 114 个 氨 基 酸 组 成 。 有 研 究 表 明 , 如 果 将 VPg 缺 失 将 会 导 致 病 毒感 染 性 的 丧 失 , 但 其 具 体 的 作 用 机 制 还 不 是 很 清 楚 。 因 此 , 我 们欲 通 过 对 其 进 行 结 构 分 析 , 定 点 突 变 分 析 来 了 解 VPg 中 的 关 键 氨基 酸 位 点 。

0.0147770.012593-0.002183420.002183960.0043670.0043670.0043670.004367Q86119/AST89Q86117/SD/1989/FRQ89273/BS89/1989/ITP27410/Germany/FRG/1989P27411/V351/1991/CK西 班 牙 RHDV_AST 毒 株 与 法 国 分 离 的 RHDV_SD 毒 株 的 VPg 序 列的 亲 缘 关 系 近 ; 捷 克 分 离 株 RHDV_V351 与 德 国 分 离 株 RHDV_FRG的 VPg 序 列 亲 缘 关 系 近 。 而 与 意 大 利 分 离 株 RHDV_BS89 相 对 较 远 。

2.2、VPg 三 维 空 间 结 构 同 源 模 建选 择 登 录 号 为 Q86119 的 RHDV 非 结 构 蛋 白 VPg 进 行 三 维 空 间 结 构同 源 模 建 , 其 蛋 白 序 列 为 :>sp|Q86119|994-1108• GVKGKTKRGRGARVNLGNDEYDEWQAARREFVNAHDMTAEEYLAMKNKAAMGSDDQDSVMFRSWWTRRQLRPDEDQVTVVGRGGVRNEVIRTRVRQTPKGPKTLDDGGFYDNDYE通 过 序 列 比 对 选 择 同 源 模 建 的 模 板 为 登 录 号 为 :P27409的 FCV 的 VPg 序 列 。 模 板 空 间 结 构 的 PDB 数 据 库 ID 为 2M4H。

RHDV 的 VPg 序 列 与 模 板 序 列 进 行 序 列 比 对从 比 对 结 果 中 可 以 看 出 ,RHDV 的 VPg 序 列 与 模 板 序 列 相同 的 位 点 为 40.3%, 大 于 30% 从 而 可 以 以 该 模 板 同 源 构 建 RHDV的 VPg 模 型 。

2.3 使 用 swiss-model 软 件 进 行 模 建Model information:Modelled residue range: 10 to 73Based on template:Sequence Identity [%]:Evalue:[2m4hA] (99.9 Å)40.634.20e-28Quality information:[details] QMEAN Z-Score: -1.39

RHDV_VPg 蛋 白模 板 蛋 白FCV_VPg对 其 进 行 分 析 : RHDV_VPg 存 在 3 个 螺 旋 , 位 于 19-30,39-51,56-66 处 . 还 有 两 个 Tyr 氨 基 酸 , 有 研 究 表 明 ,Tyr 的 尿 苷 酰 化 与 病 毒 RNA共 价 结 合 。

RHDV_VPg 蛋 白模 板 蛋 白 FCV_VPg

氢 键 分 布 图RHDV_VPg 蛋 白模 板 蛋 白 FCV_VPg

主 要 疏 水 区 域RHDV_VPg 蛋 白模 板 蛋 白 FCV_VPg

3、 VPg 的 功 能 预 测• 在 RHDV 基 因 1140nt 处 和 1161nt 处 的 Try 分 别 进 行 突 变 , 设 计 突 变引 物 为 :• Tyr-21 to Ala• Tyr-42 to Phe• Tyr-42 to SerGTTGGTCCAGCCAGAGGTCGTGGGATGATGAATTTGATGAATGGAGGGATGATGAATCCGATGAATGGAGG

RHDV 突 变 体 的 构 建体 外 转 录 物 RNA 转 染 RK-13 细 胞转 染 产 物 接 种 于 RK-13 细 胞RT-PCR 法 检 测 病 毒 基 因 组间 接 免 疫 荧 光 法 检 测 病 毒 突 变 体 蛋 白 的 表 达荧 光 定 量 RT-PCR 检 测 病 毒 突 变 体 的 复 制

小 结• 根 据 Machin 的 研 究 成 果 和 Mitra 的 研 究 成 果 , 第 21 位 Tyr 的 突 变 对RHDV 可 能 是 致 命 性 的 。• 最 终 试 验 结 果 需 要 在 实 验 室 完 成 上 述 实 验 工 作 才 能 得 出 结 论 。

4、 讨 论• 1、 通 过 对 Uniprot 中 的 审 核 过 的 RHDV 的 序 列 的 VPg 片 段 进 行 序 列比 对 和 遗 传 发 育 树 构 建 , 了 解 了 该 数 据 库 5 个 毒 株 VPg 片 段 的 亲 缘关 系 。• 2、 用 同 源 建 模 的 方 法 以 FCV 的 VPg 蛋 白 为 模 板 , 构 建 RHDV_VPg蛋 白 的 三 维 结 构 。 并 分 析 了 两 者 的 结 构 , 发 现 两 者 的 结 构 存 在 较小 的 差 异 。 从 而 预 测 RHDV 的 VPg 与 FCV 的 VPg 具 有 相 似 的 功 能 。• 3、Lellis A D 等 发 现 如 果 FCV 中 的 VPg 缺 失 将 会 导 致 病 毒 感 染 性 的丧 失 , 同 时 也 将 使 FCV 的 RNA 翻 译 效 率 急 剧 下 降 。 同 时 ,Mitra 等通 过 定 点 突 变 分 析 , 发 现 FCV 的 VPg 第 24 位 酪 氨 酸 的 突 变 是 致 死 性的 。 因 此 我 们 RHDV_VPg 序 列 的 第 21 位 和 42 位 上 设 计 了 3 个 突 变 ,然 后 将 通 过 实 验 验 证 酪 氨 酸 是 否 为 关 键 性 氨 基 酸 。

参 考 文 献• [1] Abrantes, Wessel van der loo, et al. Rabbit haemorrhagic disease(RHD) andrabbit haemorrhagic disease virus(RHDV):a review[J]. Veterinary Research,2012,43:12.• [2] A´ngeles Machı´n, etc. Identification of the Amino Acid Residue Involvedin Rabbit Hemorrhagic Disease Virus VPg Uridylylation[J]. J. Biol. Chem.2001, 276:27787-27792.• [3] Tanaji Mitra,etc. Mutagenesis of Tyrosine 24 in the VPg Protein Is Lethalfor Feline Calicivirus[J]. J. Virol. 2004, 78(9):4931.• [4] 相 关 网 站 .

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