兩 種 速 測 法 在 果 樹 葉 片 葉 綠 素 含 量 測 定 之 應 用

臺 中 區 農 業 改 良 場 研 究 彙 報 59: 37-45 (1998)1兩 種 速 測 法 在 果 樹 葉 片 葉 綠 素 含 量 測 定 之 應 用2張 致 盛 、 張 林 仁摘要傳 統 的 葉 綠 素 測 量 方 法 較 費 工 且 過 程 複 雜 。 為 尋 找 簡 易 、 非 破 壞 性 的 果 樹 葉 片 葉 綠素 含 量 速 測 法 , 本 試 驗 以 色 差 儀 (ZE 2000) 及 葉 綠 素 計 (SPAD-502) 進 行 芒 果 、 荔 枝 及 梨 葉片 葉 綠 素 之 測 量 , 並 與 利 用 丙 酮 萃 取 量 比 較 。 結 果 以 色 差 儀 及 葉 綠 素 計 測 值 與 丙 酮 萃 取量 分 析 比 較 , 其 迴 歸 方 程 式 皆 呈 二 次 效 應 , 決 定 係 數 都 高 於 0.75, 且 葉 綠 素 計 測 值 決 定係 數 都 高 於 色 差 儀 。 色 差 儀 (a*/b*) 2 值 及 葉 綠 素 計 讀 值 與 丙 酮 萃 取 量 比 較 , 決 定 係 數 分 別為 芒 果 0.88 及 0.94、 荔 枝 0.93 及 0.97 和 梨 0.75 及 0.92。 由 本 試 驗 之 結 果 , 利 用 葉 綠 素 計 及 色差 儀 作 為 非 破 壞 性 估 算 葉 片 葉 綠 素 含 量 時 , 應 考 量 葉 片 情 形 , 並 以 不 同 生 長 階 段 之 葉 片作 檢 量 線 以 提 高 準 確 性 。關 鍵 字 : 葉 綠 素 含 量 、 色 差 儀 、 葉 綠 素 計 。前言植 物 葉 片 葉 綠 素 含 量 與 其 氮 含 量 的 狀 態 、RuBP 羧 化 酵 素 (carboxylase) 活 性 及 光 合 成 速率 等 有 關(11) 。 此 外 當 植 物 受 到 逆 境 時 會 降 低 葉 綠 素 含 量(5) ,Thompson 等 人 調 查 ’Zinfandel’葡 萄 受 空 氣 污 染 傷 害 時 , 葉 片 葉 綠 素 含 量 由 48.8 µg/cm 2 降 至 28.8 µg/cm 2(14) , 因 此 葉 片 葉 綠素 含 量 亦 可 作 為 植 物 生 理 狀 況 之 指 標 。葉 綠 素 含 量 之 測 量 傳 統 都 以 研 磨 組 織 萃 取 或 不 經 研 磨 僅 以 溶 劑 萃 取 (2,4,9,14) , 所 利 用 的萃 取 溶 液 包 括 丙 酮(1,2) 、 乙 醇(5) 、 DMF(N,N-dimethylformamide) (9) 及 DMSO(dimethylsulphoxide) (4) 等 。 由 於 許 多 果 樹 葉 片 為 革 質 或 葉 表 有 絨 毛 , 以 溶 劑 萃 取 費 工 而 且 需 較 久 的 時間 , 通 常 約 需 1~3 日 (4,5,9) , 而 因 試 驗 取 樣 摘 除 葉 片 , 可 能 改 變 植 株 的 生 長 及 發 育 , 影 響 隨 後調 查 的 準 確 性 。近 來 被 用 以 進 行 非 破 壞 性 葉 綠 素 含 量 速 測 法 之 儀 器 有 葉 綠 素 計 (chlorophyll meter) 及 色差 儀 (color meter)。Yadava 以 葉 綠 素 計 (SPAD-501) 測 量 22 種 植 物 的 葉 綠 素 含 量 , 與 以 丙 酮 萃取 研 磨 比 較 得 到 之 相 關 係 數 為 0.692 (15) ; Singha 及 Townsend 以 可 攜 帶 式 色 差 儀 (tristimuluscolormeter) 測 量 蘋 果 、 葡 萄 及 桃 葉 片 色 彩 (chromaticity) 值 (L*a*b*), 與 利 用 DMF 萃 取 24 小 時比 較 , 決 定 係 數 (R 2 ) 分 別 高 達 0.9、0.96 及 0.88 (13) 。 顯 然 葉 片 未 經 研 磨 及 溶 劑 萃 取 , 利 用 非 破壞 性 測 量 , 亦 可 估 算 其 葉 綠 素 含 量 , 但 相 同 的 測 量 會 因 儀 器 (6) (12)(12,13,14)、 季 節 及 作 物 種 類而 有 很 大 的 差 異 。 本 試 驗 分 別 利 用 色 差 儀 (ZE 2000 型 ) 與 葉 綠 素 計 (SPAD-502) 測 量 , 探 討 其測 量 芒 果 、 荔 枝 及 梨 等 果 樹 葉 片 葉 綠 素 含 量 , 並 與 丙 酮 萃 取 法 比 較 其 間 之 關 係 。12台 灣 省 台 中 區 農 業 改 良 場 研 究 報 告 第 0464 號 。台 中 區 農 業 改 良 場 助 理 研 究 員 。

38臺 中 區 農 業 改 良 場 研 究 彙 報 第 五 十 九 期材 料 及 方 法材 料 及 調 查 方 法採 取 台 農 一 號 芒 果 、 黑 葉 荔 枝 及 橫 山 梨 完 整 無 病 蟲 害 的 葉 片 , 包 括 正 展 開 嫩 葉 (foldingleaf)、 剛 發 育 完 整 葉 片 (newly well-developed leaf) 及 成 熟 葉 (matured leaf) 等 三 種 發 育 階 段 的 葉片 各 20 片 , 分 別 以 色 差 儀 (color meter,Nippon Denshoku Industries Co., LTD. Toyko, Japan,產 品 型 號 ZE 2000, 以 儀 器 所 附 黑 板 及 標 準 值 X=94.34、Y=92.35、Z=110.89 之 白 板 校 正 ) 測 量葉 上 固 定 區 域 4 點 之 a*、b* 值 之 平 均 為 該 葉 片 之 觀 測 值 , 隨 後 再 以 可 攜 帶 式 葉 綠 素 計 (portablechlorophyll meter,Minolta Corp., 型 號 SPAD-502, Ramsry, N. J.) 測 量 與 色 差 儀 測 量 相 同 4 點之 讀 值 。將 上 述 葉 片 , 使 用 直 徑 6 mm 之 圓 孔 打 孔 器 取 下 色 差 儀 及 葉 綠 素 計 測 量 相 同 位 置 之 葉 圓片 12 片 , 面 積 共 3.39 cm 2 , 加 入 80% 丙 酮 3 ml, 在 冰 浴 下 研 磨 至 殘 渣 無 綠 色 為 止 , 稀 釋 後 再經 Whatman No.1 濾 紙 過 濾 後 , 定 量 至 10 ml, 以 分 光 儀 (spectrophotometer,HITACHI U-3000型 ) 測 量 663nm 及 645nm 之 吸 光 值 。計 算 及 統 計 方 法利 用 色 差 儀 求 得 同 一 葉 片 4 點 之 a*、b* 值 平 均 得 一 葉 片 之 觀 測 值 後 , 參 考 Marquard 及Tipton 所 提 出 之 方 法 , 求 得 (a*/b*) 2 之 值 (7) 。 以 丙 酮 為 溶 劑 研 磨 方 法 之 葉 綠 素 含 量 計 算 係 參 考Argon (2) (1)及 王 等 所 述 , 葉 綠 素 總 量 (mg)=(20.2A 645 +8.02A 663 )×10 ml/1000×A( 面 積 ) 公 式 , 求 得葉 綠 素 含 量 , 所 得 結 果 再 換 算 為 µg/cm 2 之 量 。以 色 差 儀 測 得 值 換 算 為 (a*/b*) 2 值 與 葉 綠 素 計 讀 值 , 求 三 種 不 同 發 育 階 段 各 20 片 葉 與 丙酮 萃 取 葉 綠 素 量 間 決 定 係 數 (coefficient of determination), 並 以 SAS(SAS Institute, Cary, N. C.)程 式 進 行 顯 著 性 分 析 (PROC GLM,SAS Version 6.01) 後 , 再 以 Sigma Plot 程 式 (Version 3.0)計 算 三 種 果 樹 60 片 葉 片 之 迴 歸 方 程 式 並 繪 圖 。結果不 同 生 育 階 段 各 20 片 葉 片 丙 酮 萃 取 葉 綠 素 含 量 與 色 差 儀 及 葉 綠 素 計 讀 值 分 析 結 果 如 表一 。 比 較 三 種 不 同 生 育 階 段 葉 片 丙 酮 萃 取 葉 綠 素 含 量 與 色 差 儀 測 得 之 (a*/b*) 2 值 間 決 定 係數 , 以 荔 枝 成 熟 葉 之 0.79 最 高 , 其 次 為 剛 發 育 完 整 葉 片 之 0.58。 葉 綠 素 計 測 值 與 丙 酮 萃 取 量之 決 定 係 數 較 高 者 亦 為 荔 枝 成 熟 葉 之 0.56, 其 他 不 同 生 育 階 段 葉 片 , 以 丙 酮 萃 取 葉 綠 素 量 與兩 種 儀 器 測 定 值 間 決 定 係 數 都 較 低 。

兩 種 速 測 法 在 果 樹 葉 片 葉 綠 素 含 量 測 定 之 應 用 41圖 三 、 丙 酮 萃 取 荔 枝 葉 片 葉 綠 素 含 量 與 色 差 儀 測 量 (a*/b*) 2 值 之 相 關 圖 。Fig. 3. Relationship between acetone extractable chlorophyll and (a*/b*)2 valuesmeasured from litchi leaves.圖 四 、 丙 酮 萃 取 荔 枝 葉 片 葉 綠 素 含 量 與 葉 綠 素 計 (SPAD-502) 讀 值 之 相 關 圖 。Fig. 4. Relationship between acetone extractable chlorophyll and chlorophyllmeter(SPAD-502) readings measured from litchi leaves.

42臺 中 區 農 業 改 良 場 研 究 彙 報 第 五 十 九 期圖 五 、 丙 酮 萃 取 梨 葉 片 葉 綠 素 含 量 與 色 差 儀 測 量 (a*/b*) 2 值 之 相 關 圖 。Fig. 5. Relationship between acetone extractable chlorophyll and (a*/b*)2 valuesmeasured from pear leaves.圖 六 、 丙 酮 萃 取 梨 葉 片 葉 綠 素 含 量 與 葉 綠 素 計 (SPAD-502) 讀 值 之 相 關 圖 。Fig. 6. Relationship between acetone extractable chlorophyll and chlorophyllmeter(SPAD-502) readings measured from pear leaves.

兩 種 速 測 法 在 果 樹 葉 片 葉 綠 素 含 量 測 定 之 應 用 43討論Fanizza 等 人 以 葉 綠 素 計 (SPAD-502) 測 量 葡 萄 葉 片 在 乾 旱 逆 境 處 理 後 之 讀 值 , 與 溶 劑 萃取 所 得 之 葉 綠 素 含 量 呈 線 性 相 關 (3) , 因 而 認 為 葉 綠 素 計 可 作 為 葡 萄 品 種 耐 旱 性 選 拔 之 工 具 。顯 示 非 破 壞 性 的 葉 綠 素 速 測 法 適 用 於 估 算 植 物 葉 片 之 葉 綠 素 含 量 。 而 Marquard 及 Tipton 以 二部 同 型 之 可 攜 帶 式 葉 綠 素 計 (SPAD-501) 測 相 同 之 材 料 , 所 得 讀 值 並 不 相 同 。 在 12 種 材 料 與用 DMF 萃 取 30 小 時 後 與 二 部 葉 綠 素 計 讀 值 之 比 較 , 其 r 2 (linear relationship) 介 於 0.827~0.969之 間 (7) , 由 此 可 知 , 進 行 非 破 壞 性 葉 綠 素 速 測 法 應 考 量 作 物 及 儀 器 所 產 生 之 誤 差 。本 試 驗 三 種 材 料 不 同 生 育 階 段 各 20 片 葉 片 , 以 二 種 方 法 所 得 之 值 與 丙 酮 萃 取 量 比 較 分析 , 除 荔 枝 成 熟 葉 外 , 其 他 之 比 較 決 定 係 數 都 相 當 低 ( 表 一 ), 顯 然 利 用 速 測 法 應 以 不 同 生 長階 段 之 葉 片 以 得 到 較 正 確 的 檢 量 線 (calibration curve), 否 則 可 能 影 響 所 換 算 之 葉 綠 素 含 量 之值 。Monje 及 Bugbee (6) (3)以 及 Fanizza 等 人 認 為 葉 脈 或 葉 綠 素 分 佈 不 平 均 , 都 會 影 響 以 光 學 儀器 作 非 破 壞 性 葉 綠 素 速 測 法 之 準 確 性 , 雖 然 本 試 驗 測 量 時 已 避 開 葉 片 主 要 葉 脈 , 但 可 能 嫩葉 因 葉 綠 素 分 佈 較 不 均 勻 , 因 而 受 到 的 影 響 較 大 , 以 致 在 嫩 葉 速 測 法 與 丙 酮 萃 取 量 間 決 定係 數 較 低 ( 表 一 )。比 較 色 差 儀 與 葉 綠 素 計 之 讀 值 , 葉 綠 素 計 在 三 種 果 樹 所 得 之 讀 值 與 丙 酮 萃 取 量 分 析 結果 決 定 係 數 均 較 色 差 儀 高 , 而 色 差 儀 在 芒 果 及 荔 枝 與 丙 酮 研 磨 萃 取 之 比 較 分 別 達 0.88 與0.93, 但 梨 僅 有 0.75。 探 討 二 種 方 法 讀 值 與 丙 酮 萃 取 量 間 決 定 係 數 差 異 之 原 因 , 葉 綠 素 計 係以 紅 光 (650nm) 穿 透 葉 片 (8) , 除 色 素 分 佈 不 平 均 或 光 線 穿 透 性 影 響 準 確 度 外 (3,6) , 葉 片 厚 度 應不 超 過 1.2mm (8) , 由 圖 二 、 圖 四 及 圖 六 上 拋 的 二 次 函 數 線 性 模 式 , 顯 然 隨 芒 果 、 荔 枝 及 梨 葉片 葉 綠 素 含 量 增 加 時 ( 可 能 葉 片 變 厚 或 組 織 間 葉 綠 素 累 積 ), 影 響 紅 光 之 穿 透 性 , 因 而 影 響 讀值 。 在 Fanizza 等 人 (3) 、Marquard 及 Tipton (7) (12)、Sibley 等 人 與 Yadava (15) 等 利 用 葉 綠 素 計 所 進行 之 試 驗 , 都 以 一 次 函 數 關 係 說 明 , 僅 Monje 及 Bugbee (6) 提 出 以 二 次 函 數 關 係 可 能 較 一 次 函數 關 係 更 適 當 , 而 本 試 驗 結 果 說 明 葉 綠 素 計 讀 值 與 丙 酮 萃 取 葉 綠 素 量 間 應 是 呈 二 次 效 應 的函 數 關 係 。色 差 儀 以 光 線 反 射 之 原 理 , 因 此 葉 片 厚 度 、 含 水 量 及 表 面 附 著 灰 塵 , 都 會 影 響 其 測 定值 (6,13) , 本 試 驗 測 量 葉 片 顏 色 值 , 係 以 CIE (Commission International I’Eclairage) L*a*b* 公 式計 算(10) , 根 據 公 式 原 理 當 顏 色 偏 綠 時 b* 值 變 大 , 因 此 葉 綠 素 含 量 增 加 時 (a*/b*) 2 之 值 變 小 ,因 此 圖 一 、 圖 三 及 圖 五 皆 呈 二 次 函 數 關 係 , 但 在 Singha 及 Townsend (13) 之 試 驗 , 並 未 提 出 相同 的 看 法 。 另 在 本 試 驗 以 色 差 儀 色 彩 值 與 丙 酮 萃 取 葉 綠 素 量 間 決 定 係 數 , 芒 果 (R 2 =0.88) 與荔 枝 (R 2 =0.93) 較 梨 (R 2 =0.75) 高 , 可 能 是 芒 果 及 荔 枝 葉 片 表 面 光 滑 , 而 梨 葉 脈 之 支 脈 較 為 明顯 , 表 面 較 不 規 則 等 表 面 結 構 造 成 之 影 響 。綜 合 本 試 驗 之 結 果 , 葉 綠 素 計 (SPAD-502) 讀 值 及 色 差 儀 之 (a*/b*) 2 值 作 葉 綠 素 含 量 測定 , 應 利 用 不 同 生 育 階 段 葉 片 作 檢 量 線 , 可 得 到 較 正 確 的 數 值 。 而 二 種 儀 器 之 方 法 在 測 定芒 果 荔 枝 及 梨 之 葉 片 時 , 所 得 到 的 迴 歸 方 程 式 皆 呈 二 次 效 應 , 但 在 某 些 狀 況 , 如 葉 片 厚 度超 過 1.2mm、 葉 綠 素 含 量 較 高 、 分 佈 不 均 勻 或 葉 表 結 構 不 適 合 等 , 都 會 影 響 估 算 值 之 準 確 性 。

44臺 中 區 農 業 改 良 場 研 究 彙 報 第 五 十 九 期參 考 文 獻1. 王 月 雲 、 陳 是 瑩 、 童 武 夫 1994 葉 綠 素 的 吸 收 光 譜 與 定 量 測 量 In: 植 物 生 理 學 試 驗p:93~95 藝 軒 圖 書 出 版 社 台 北 。2.Arnon, D. I. 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Betavulgaris. Plant Physiol. 24:1-15.3.Fanizza, G., L. Ricciardi and C. Bagnulo. 1991. Leaf greenness measurements to evaluatewater stressed genotypes in Vitis vinifera. Euphytica 55:27-31.4.Hiscox, J. D. and G. F. Israelstam. 1979. A method for the extraction of chlorophyll from leaftissue without maceration. Can. J. Bot. 57:1332-1334.5.Knudson, L., T. W. Tibbitts and G. E. Edwards. 1977. Measurement of ozone injury bydetermination of leaf chlorophyll concentration. Plant Physiol. 60:606-608.6.Manje, O. A. and B. Bugbbe. 1992. Inherent limitations of nondestructive chlorophyll meters:a comparison of two types of meters. HortScience 27(1):69-71.7.Marquard, R. D. and J. L. Tipton. 1987. Relationship between extractable chlorophyll and anin situ method to estimate leaf greenness. HortScience 22(6):1327.8.Minolta. 1989. Chlorophyll meter SPAD-502. Industrial meter division. Minolta Corp.,Ramsry, N. J.9.Moran, R. and D. Porath. 1980. Chlorophyll determination in intact tissues using N,N-dimethylformamide. Plant Physiol. 65:478-479.10.Nippon Denshoku. 1994. ZE-2000 color meter user’s manual. Nippon Denshoku IndustriesCo., LTD. Toyko, Japan.11.Seemann, J. R., T. D. Sharkey, J. Wang and C. B. Osmond. 1987. Environmental effects onphotosynthesis, nitrogen-use efficiency, and metabolite pools in leaves of sun and shade plants.Plant Physiol. 84:796-802.12.Sibley, J. L., D. J. Eakes, C. H. Gilliam, G. J. Keever, W. A. Dozier,Jr. and D. G. Himelrick.1996. Foliar SPAD-502 meter values, nitrogen levels, and extractable chlorophyll for redmaple selections. HortScience 31(3):468-470.13.Singha, S. and C. Townsend. 1989. Relationship between chromaticity values and chlorophyllconcentration in apple, grape, and peach leaves. HortScience 24(6):1034.14.Thompson, C. R., E. H. Hensel and G. Kats. 1969. Effect of photochemical air pollution onZinfandel grapes. HortScience 4(3):222-224.15.Yadava, U. L. 1986. A rapid and nondestructive method to determine chlorophyll in intactleaves. HortScience 24(6):1449-1550.

兩 種 速 測 法 在 果 樹 葉 片 葉 綠 素 含 量 測 定 之 應 用 45Two Rapid Determination Methods for TotalChlorophyll Contentin Fruit Tree Leaves 1Chih-Sheng Chang and Lin-Ren Chang 2ABSTRACTSThe objective of this study was to find a rapid and nondestructive method fordetermination of chlorophyll in fruit tree leaves using mango, litchi and pear as materials.Two nondestructive measure methods were compared with 80% acetone extractionmethod. The devices used for nondestructive measurement were color meter (model ZE2000) and chlorophyll meter (model SPAD-502). The results indicated that the regressionmodels express curve relationship, the chlorophyll meter readings correlated well withacetone extraction method. R 2 >0.92 for mango, litchi and pear leaves. But less the linearrelationship was obtained between chromaticity values with color meter and acetoneextraction method for pear leaves (R 2 =0.75). The color meter and chlorophyll meter canbe used for the rapid and nondestructive estimation of leaf chlorophyll content in situ ifthe number of sampling leaf is enlarged and the distribution of chlorophyll in leaf ishomogenous.Key words: chlorophyll content, color meter, chlorophyll meter.1Contribution No. 0464 from Taichung DAIS.2Assitant Pomologist of Taichung DAIS.