1. Muestreo 1.1. Número de muestras 1.2. Método de muestreo ...

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
1. Muestreo
Número de muestras. Método de muestreo aleatorio. Normas generales para el
muestreo. Condiciones para el muestreo. Preparación de la muestra para su
envío al laboratorio. Transporte y conservación de las muestras.
En el muestreo de alimentos para realizar un análisis microbiológico se
separa un número determinado de muestras de un lote, partida, etc con la
finalidad de obtener unos resultados analíticos fiables. Con ello se pretende
que la muestra recogida sea representativa de la totalidad.
La necesidad de un muestreo adecuado se hace patente cuando existe la
posibilidad de que existan gérmenes patógenos o sus toxinas, distribuidos de
forma escasa en un alimento o conjunto de alimentos del mismo origen. Es
igualmente necesario para saber si una remesa de productos alimentarios
cumple o no las normas microbiológicas legales establecidas para dichos
productos.
1.1. Número de muestras
El número de muestras destinadas a un análisis microbiológico está en relación
con la precisión que se desee obtener en los resultados. Este número se suele
fijar cuando se dispone de muchas unidades, sobre todo en forma de lote.
Se suele sugerir que el nº de muestras se corresponda con la raíz cuadrada del
número total de unidades constituyentes del lote. También que, teniendo en
cuenta el volumen del lote, se tome el 1 por 100 del total cuando el lote es grande
y el 10 por 100 cuando el lote es pequeño.
Estos sistemas citados son aplicables a lotes procedentes de industrias cuyo
control se desconoce. Si se trata de productos sometidos a un control regular, es
suficiente analizar 5-10 muestras de cada lote.
1.2. Método de muestreo aleatorio
Consiste en separar del lote un número de muestras, calculado previamente,
utilizando la tabla de números al azar. Esta tabla está integrada por columnas y
filas de dígitos obtenidos mediante cálculos estadísticos.
Una vez establecido el nº de muestras que se deben tomar del lote, se enumeran
ordenadamente cada uno de los paquetes, contenedores o unidades del producto
a muestrear. (ejemplo: si el lote está integrado por 200 unidades, su numeración
se marcará del 1 al 200, correlativamente). Con un lápiz se señala un lugar
cualquiera en la tabla de números al azar, coincidiendo con un dígito a su
proximidad. Este dígito sirve de punto de partida para la separación del número
de muestras destinadas al análisis.
1

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
1.3. Normas generales para el muestreo
La finalidad de la recogida de las muestras de alimentos para los análisis
microbiológicos es conseguir resultados fiables sobre su estado higiénico
sanitario. Por consiguiente, es necesario que el producto alimenticio, en el
momento de su análisis, reúna las mismas condiciones microbiológicas que tenía
al ser muestreado. Por esta razón, son necesarias unas pautas para conseguir la
muestra idónea.
Material utilizado en la recogida de muestras
Envases para la toma de muestras:
Los envases deberán estar perfectamente limpios, secos y estériles. Su tamaño
deberá guardar relación con la muestra que se vaya a tomar. Serán herméticos
e inaccesibles a cualquier contaminación posterior a su esterilización. Se
pueden utilizar los siguientes tipos:
- Envases de vidrio de boca ancha estériles
- Envases de plástico estériles
- Bolsas de plástico estériles
- Envases metálicos estériles
Material para la apertura de envases y recogida de muestras:
La elección del material dependerá del tipo de muestra.
- Pinzas estériles
- Cuchillos estériles
- Bisturís estériles
- Cucharas estériles
- Espátulas estériles
- Guantes de látex
Material para marcar:
- Etiquetas de cartulina
- Etiquetas adhesivas
- Lápiz
- Rotuladores
- Bolígrafos
Equipo para la esterilización y/o desinfección:
- Autoclave a 121 ºC
- Mechero
- Alcohol etílico absoluto para flamear
- Alcohol etílico al 70 % para desinfectar
- Algodón
Equipos para el transporte en refrigeración y/o congelación de las muestras:
- Neveras portátiles
- Congeladores portátiles
2

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
1.4. Procedimiento general de muestreo
El muestreo debe realizarse de forma que se obtenga una muestra
representativa del producto.
A ser posible, las unidades de muestra se tomarán en sus envases originales.
El número de envases muestreados, en este caso, debería ser como mínimo
5.
En los casos en los que los envases sean muy grandes, o si el producto es a
granel o sólido (queso, productos congelados) se tomarán asépticamente una
muestra representativa constituida por porciones de diferentes envases o
productos, de acuerdo con el siguiente procedimiento:
1. Coger un recipiente apropiado estéril.
2. Rotular el recipiente con los datos que identifiquen correctamente la muestra
3. Poner guantes o desinfectar las manos con alcohol etílico al 70 %.
4. Si se va a recoger una muestra a partir de un envase, desinfectar con
algodón empapado en alcohol etílico de 70 % la zona del envase por la que
se proceda a su apertura.
5. Abrir el envase, si es el caso, con un instrumento estéril.
6. Coger las diferentes porciones de la muestra con un instrumento adecuado
(pinzas, espátulas, cuchara, etc) estéril. Si el producto a muestrear tiene
salida por un conducto, se desechan las primeras porciones antes de tomar
la muestra.
7. Recoger una cantidad de muestra superior a 250 g e introducirla
asépticamente en un recipiente estéril (evitar el contacto de la muestra con
cualquier objeto contaminado)
8. Cerrar el recipiente con un cierre hermético para evitar su contaminación
posterior.
1.5. Transporte y conservación de las muestras
Una vez recogidas las muestras, los recipientes deberán de mantenerse a
temperaturas de refrigeración para productos no congelados o en congelación
para las muestras de productos congelados.
Se debe intentar que el espacio de tiempo transcurrido entre la toma de
muestras y el comienzo del análisis sea lo más corto posible. En todo caso, el
espacio de tiempo transcurrido entre ambas acciones no deberá exceder de 12
horas.
3

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
El transporte de las muestras se realizará en recipientes que mantengan
temperaturas de refrigeración o congelación (si los productos lo requieren).
4

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
2. Preparación de las muestras para su análisis
Toma de muestras. Trituración y homogenización de las muestras. Preparación
de diluciones
2.1. Toma de muestras
La preparación de las muestras se debe realizar a todas las muestras
recibidas en el laboratorio, como paso previo a los ensayos analíticos
específicos. Esta operación exige unas reglas de manipulación aséptica
(utilización de cámaras de flujo laminar o en las proximidades de la llama de
un mechero Bunsen o similar), así como el empleo de material y diluyentes
estériles para evitar la contaminación del alimento.
El material utilizado para la apertura de envases y en la toma de muestras
estará de acuerdo con la naturaleza del producto: abridores, pinzas, tijeras,
espátulas, etc.
La fracción de alimento destinada al análisis microbiológico debe ser
representativa de la totalidad de la muestra. En general, la muestra analítica
debe estar constituida aproximadamente, por 250 g de la misma. Para la
puesta en marcha de las distintas determinaciones se utilizan 100 g, y el resto
sirve de reserva por si es necesario repetir el análisis.
2.2. Trituración y homogenización de las muestras
Muestras líquidas: no se efectúa dilución de la misma, sembrándose de
forma directa y efectuando las diluciones seriadas a partir de la muestra.
Muestras sólidas: es necesario someterlos previamente a una suspensión,
utilizando un diluyente estéril.
Conceptos:
Suspensión inicial (solución madre): Suspensión, disolución o emulsión
obtenida cuando un peso o volumen determinados del producto en examen
ha sido mezclada con una cantidad 9 veces superior de diluyente, dejando
que las partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
Diluciones decimales sucesivas: Suspensiones o disoluciones obtenidas al
mezclar un volumen determinado de la suspensión inicial o de la muestra
original (muestras sólidas), con un volumen 9 veces superior de diluyente, y
repitiendo esta operación con diluciones decimales sucesivas hasta llegar a
un nivel de dilución adecuado para la inoculación del medio de cultivo.
Material y equipos para la trituración y homogenización:
- Envase estéril para pesar el alimento/ bolsas estériles para homogenizador
de paletas
- Balanza analítica
5

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
- Pinzas/ abrelatas/ bisturí/ cuchillo/ tijeras/ cuchara estériles para coger la
muestra
- Bandejas
- Homogenizador de paletas
- Botella con el diluyente: agua de peptona salina (APS)/ solución Ringer ¼ /
Agua de peptona tamponada, etc. (si se trata de una muestra sólida).
- Toallas de papel de un solo uso
- Alcohol de 70 ºC para esterilizar el material de metal y mechero.
- Rotulador permanente para marcar el material.
- Cabina de flujo laminar/mechero Bunsen
Preparación de la muestra
- Lavar las manos o guantes (en el caso de que no estuviesen estériles) con
agua y jabón, y con etanol al 70 %.
- Colocar una bolsa estéril o el recipiente estéril que se vaya a utilizar para la
trituración sobre la balanza y tarar la balanza.
- Introducir, asépticamente, una porción adecuada de la muestra en dicho
recipiente. La cantidad a añadir será la necesaria para la realización del
análisis, cogiendo una representación significativa de cada unidad que
comprenda la muestra total.
2.3. Preparación de diluciones
Material:
- Tubos con 9 mL de diluyente
- Pipetas de vidrio de 10 mL de vidrio o automáticas
- Pipetas automáticas con capacidad para 1 mL y 0,1 mL
- Puntas de pipeta estériles con capacidad para 5 mL, 1 mL y 0,1 mL
- Agitador de tubos
- Mechero Bunsen
Suspensión inicial
- A la cantidad de muestra depositada en la bolsa de plástico/recipìente, se le
añade la cantidad de diluyente, necesaria para obtener una dilución 1:10
(10 -1 ).
- La suspensión inicial se pasa por homogenizador de paletas 90 segundos
aproximadamente. No deben transcurrir más de 15 minutos entre la
preparación de la dilución madre y su trituración en el homogenizador de
paletas.
- Se deposita la disolución homogenizada en la botella que contenía el
diluyente, marcada con el número de muestra.
- Para evitar que los microorganismos resulten dañados por cambios bruscos
de temperatura., la temperatura del diluyente durante las operaciones
6

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
indicadas más adelante deberá ser aproximadamente la misma que la
temperatura del entorno.
- Dejar sedimentar las partículas grandes.
- Si la muestra a analizar fuese líquida, no se efectúa dilución de la misma,
sembrándose de forma directa y efectuando las diluciones seriadas a partir
de la muestra.
Diluciones decimales sucesivas
- Se enciende el mechero Bunsen en la mesa de trabajo para que cree un
ambiente de esterilidad.
- Se toma un tubo o botella con 9 o 90 mL de diluyente, se le quita el tapón y
se pasa la boca del tubo o botella por la llama.
- Usando una pipeta estéril se toma 1 o 10 mL de la muestra, en el caso de
líquidos, o 1 ó 10 mL de la dilución inicial en el caso de muestras sólidas, y
se transfiere al tubo con 9 o 90 mL de diluyente. Se agita, obteniéndose de
esta forma la dilución 1:10 (10 -1 ), si la muestra es líquida, o la dilución 1:100
(10 -2 ), en el resto de las muestras.
- Para conseguir una precisión óptima, no deberá introducirse las pipetas más
de 1 cm dentro de la suspensión inicial.
- Evitar el contacto entre la pipeta que contiene el inóculo y el diluyente estéril.
- Para hacer diluciones sucesivas, usar una pipeta nueva estéril en cada paso
de la dilución, y se toma 1 o 10 mL de la dilución precedente y se lleva a un
tubo con 9 ó 90 mL de diluyente, agitándose previamente a su siembra.
- Una vez obtenidas todas las diluciones necesarias para efectuar los
ensayos, se debe seguir el procedimiento específico para cada uno de ellos.
Duración del proceso
El tiempo transcurrido entre le final de la preparación de la suspensión inicial y
el instante en el que el inóculo entra en contacto con el medio de cultivo no
deberá ser superior a los 45 minutos.
En los ensayos de detección de microorganismos donde no se efectúa
cuantificación (Salmonella, Listeria, etc.), la cantidad de muestra de partida será
por defecto de 25 g, y se indicará el resultado como Presencia/Ausencia en X g,
siendo X la cantidad de muestra utilizada en el análisis.
7

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Referencias
- American Public Health Association. 2001. Compendium of methods for the
examination of foods (4 th Edition). American Public Health Association,
Washington, DC.
- Pascual Anderson, M.R. y V. Calderon y Pascual. 2000. Microbiología
Alimentaria, metodología analítica para alimentos y bebidas. Díaz de santos,
S.A., Madrid.
- BAM/FDA. 1998. Bacteriological Analytical manual. 8th Edition Revision A.
AOAC International, Gaithersburg (USA).
- ISO 7218-Microbiología de los alimentos y de los preparados alimenticios
para animales- Reglas generales para el análisis microbiológico.
- ISO 8199. Water quality- General guide to the enumeration of microorganisms
by culture. First edition 1988-06-15.
- UNE-EN ISO 6887-1 Parte 1: Reglas generales para la preparación de la
suspensión inicial y las diluciones decimales.
8

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Recuento de microorganismos aerobios mesófilos a 30 ºC:
técnica de siembra en medio sólido por inclusión
El límite de detección para el recuento en placa de microorganismos aerobios
mesófilos es para productos sólidos < 10 ufc/g y para suspensiones líquidas < 1
ufc/mL.
Microorganismos: bacteria, hongos y levaduras que crecen aeróbicamente bajo
las condiciones especificadas en el presente procedimiento.
Material y aparatos
- Placas de Petri de 90 mm de diámetro
- Pipetas con capacidad para 1 mL
- Puntas de pipeta con capacidad para 1 mL
- Pipetas de vidrio con capacidad para 10 mL ó pipeta y puntas de pipeta con
capacidad para 5-10 mL.
- Material de vidrio: botellas con capacidad inferior a 500 mL
- Baño termostático regulable a 45 ºC
- Incubador regulable a 30 ºC
Medios de cultivo y reactivos
- Agua de peptona (AP): utilizada como líquido de dilución
- Agar de recuento en placa (PCA).
Procedimiento
Realizar todo el proceso en condiciones que eviten la contaminación de los
materiales y medios de cultivo: trabajar en una campana de flujo laminar o al
lado de la llama de un mechero Bunsen.
La porción de muestra empleada y las diluciones se realizarán siguiendo el
apartado de preparación de la muestra para el análisis.
Inoculación e incubación:
1. Coger 2 placas de Petri, vacías y estériles, y marcarlas adecuadamente.
Utilizando una pipeta automática con una punta de pipeta estéril, transferir a
cada placa 1 mL de la muestra a analizar.
Coger y marcar otras 2 placas de Petri vacías y estériles. Utilizando una
punta de pipeta estéril nueva, transferir a cada placa 1 mL de la primera
dilución decimal (10 -1 ).
Repetir el procedimiento con las siguientes diluciones usando nuevas puntas
de pipeta estériles para cada dilución decimal.
2. Dispensar en cada placa de Petri entre 15 y 20 mL de PCA, atemperado a
45 ºC en un baño de agua.
9

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Mezclar con cuidado el inóculo con el medio (mediante movimientos
rotacionales) y permitir que la mezcla solidifique, manteniendo la placa de
Petri en una superficie horizontal.
3. Invertir las placas sembradas e incubarlas en la estufa a 30 ºC durante 72
horas.
Recuento de colonias
Transcurridas las 72 horas se debe realizar el recuento de las colonias en
aquellas placas que contengan entre 15 y 300 colonias.
Cada colonia de la placa puede partir de un grupo de células o de una célula
individual, por lo que debemos referirnos a ella como unidad formadora de
colonia (ufc)
Expresión de resultados: en ufc/mL de producto (tener en cuenta la dilución en
la que se ha realizado el recuento).
Referencias específicas:
- Apha 2001. Chapter 7: aerobic plate count. Compendium of methods for the
microbiological examination of foods. 4 th ed. American Public Health
Association, Washington DC (USA).
- ISO 4833: 1991: Microbiology – General guidance for the enumeration of
micro-organisms – Colony count technique at 30 ºC.
10

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Recuento de enterobacterias totales: técnica de siembra en
medio sólido por inclusión
El límite de detección para el recuento en placa de microorganismos aerobios
mesófilos es para productos sólidos < 10 ufc/g y para suspensiones líquidas < 1
ufc/mL.
Enterobacteriaceae: microorganismos que fermentan la glucosa y muestran una
reacción negativa de la oxidasa cuando se le efectúa un test acorde al método
especificado.
Recuento de Enterobacteriaceae: número de Enterobacteriaceae por mL o por
g de la muestra analizada cuando se realiza el análisis de acuerdo con el
método especificado.
Material y equipos
- Placas de Petri de 90 mm de diámetro
- Pipetas con capacidad para 1 mL
- Puntas de pipeta con una capacidad para 1 mL
- Pipetas de vidrio con capacidad para 10 mL ó pipeta y puntas de pipeta con
capacidad para 5-10 mL.
- Material de vidrio: botellas con capacidad inferior a 500 mL
- Asas de siembra curva de aprox. 3 mm de diámetro
- Asas de siembra recta
- Palillos de madera
- Baño termostático regulable a 45 ºC
- Incubador regulable, a 36 ºC
Medios de cultivo y reactivos
- Agua de peptona salina (APS): utilizada como líquido de dilución
- Agar bilis rojo violeta y glucosa (VRBG) en botellas con capacidad máxima
para 500 mL: utilizado como medio de aislamiento.
- Agar nutritivo (AN) o agar triptona de soja (TSA) en placas de 90 mm de
diámetro
- Agar glucosado (AG) en tubos de vidrio de capacidad superior a 10 mL
- Reactivo de la prueba de la oxidasa
Procedimiento
Realizar todo el proceso en condiciones que eviten la contaminación de los
materiales y medios de cultivo: trabajar en una campana de flujo laminar o al
lado de la llama de un mechero Bunsen.
La porción de muestra empleada y las diluciones se realizarán siguiendo el
apartado de preparación de la muestra para el análisis.
11

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Inoculación e incubación:
1. Coger 2 placas de Petri, vacías y estériles, y marcarlas adecuadamente.
Utilizando una pipeta automática con una punta de pipeta estéril, transferir a
cada placa 1 mL de la muestra a analizar si el producto es líquido, o 1 mL de
la suspensión inicial para los demás productos.
Coger y marcar otras 2 placas de Petri vacías y estériles. Utilizando una
punta de pipeta estéril nueva, transferir a cada placa 1 mL de la primera
dilución decimal (10 -1 ), si el producto es líquido, ó 1 mL de la 1ª dilución
decimal (10 -2 ) de la suspensión inicial en el caso de otros productos.
Repetir el procedimiento con las siguientes diluciones usando nuevas puntas
de pipeta estériles para cada dilución decimal.
2. Dispensar en cada placa de Petri entre 15 y 20 mL de VRBG, atemperado a
45 ºC en un baño de agua.
Mezclar con cuidado el inóculo con el medio (mediante movimientos
rotacionales) y permitir que la mezcla solidifique, manteniendo la placa de
Petri en una superficie horizontal. Una vez solidificado el medio de cultivo,
incorporar una capa fina de VRBG atemperado a 45 ºC sobre el medio
inoculado y permitir que solidifique.
3. Invertir las placas sembradas e incubarlas en la estufa a 36 ºC durante 24
horas.
Recuento de colonias:
- Seleccionar las placas que contengan menos de 150 colonias típicas (color
rosa a rojo-violeta, a veces rodeadas de un halo de precipitación, o mucosas)
con un diámetro de 0,5 mm o mayor; contar estas colonias sospechosas y
considerarlas como presuntas enterobacterias.
- Seleccionar al azar 5 colonias típicas para la confirmación bioquímica después
de su resiembra.
Confirmación:
Resiembra: con ayuda de un asa curva, sembrar en placas de AN o TSA cada
una de las colonias seleccionadas para su confirmación.
Incubar estas placas a 36 ºC durante 24 h. Seleccionar una colonia bien aislada
de cada una de las placas incubadas, para su confirmación bioquímica.
Confirmación bioquímica:
Prueba de la oxidasa
Coger con un palillo estéril una porción de una colonia bien aislada en TSA o
AN. Aplicar la colonia sobre un papel de filtro humedecido con el reactivo de la
oxidasa o sobre un disco disponible comercialmente.
12

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
- Prueba positiva: si al cabo de 10 segundos aparece una coloración violeta.
- Prueba negativa: si el color del papel o disco no se vuelve violeta oscuro en
10 segundos.
Test de confirmación
Usando un asa de siembra recta, sembrar por picadura en tubos de AG las
colonias seleccionadas en el apartado anterior que sean oxidasa negativa.
Incubar a 36 ºC durante 24 h.
- Prueba positiva: si aparece un color amarillo en el tubo. La mayoría de las
cepas producen gas.
Expresión de resultados: en ufc/mL de producto si es líquido o ufc/g si es sólido
(tener en cuenta la dilución en la que se ha realizado el recuento).
- Si al menos el 80 % de las colonias típicas seleccionadas son oxidasa
negativas y glucosa positivas, y por lo tanto confirmadas como enterobacterias,
el número de microorganismos presentes será el mismo que el obtenido en el
recuento hecho en VRBG. En los demás casos se debe corregir el recuento
inicial realizado.
Referencias específicas:
- Apha 2001. Chapter 8: Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli
as Quality and safety. Compendium of methods for the microbiological
examination of foods. 4 th ed. American Public Health Association,
Washington DC (USA).
- Norma ISO 7402:1993. Microbiology – General guidance for the enumeration
of Enterobacteriaceae without resuscitation – NMP technique and colonycount
technique.
13

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Investigación de Salmonella spp: método de presencia-ausencia
Referencias
APHA 2001. Chapter 37: Salmonella. Compendium of methods for the
microbiological examination of foods. 4 th ed. American Public Health
Association, Washington DC (USA).
ISO 6579:202 (E). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal
method for detection of Salmonella spp.
Salmonella spp: bacterias Gram-negativas, anaerobias facultativas,
asporógenas, de forma bacilar. Las formas móviles poseen flagelos peritricos.
Producen ácido, y a veces gas, de la glucosa, suelen ser catalasa positiva y
oxidasa negativas y reducen los nitratos a nitritos. La mayoría de los
representantes de la familia se encuentran en el tracto intestinal del hombre y
de los animales, bien como patógenos, bien como comensales.
Principio del método
Para la determinación de Salmonella spp. Son necesarios 4 pasos sucesivos.
a. Enriquecimiento previo en medio líquido no selectivo: inocular una parte de
la muestra en Agua de Peptona Tamponada e incubar a 36 ºC un tiempo de
entre 16 y 20 horas.
b. Enriquecimiento en un medio líquido selectivo: inocular con el cultivo
obtenido en el apartado a en medio Rappaport-Vasiliadis y Caldo
Tetrationato. Incubar el primero a 42 ºC durante 24 h y el segundo a 36 ºC
tambien durante 24 h.
c. Siembra en placa e identificación: Inocular en medio sólido selectivo los
cultivos obtenidos en el paso anterior. Los medios de cultivo empleados son:
Agar XLD y Agar Hektoen.
Incubar a 36 ºC y examinar después de 24 h y, si es necesario, después de
48 h para comprobar, según sus características, si son colonias
presuntivas de Salmonella. La selección de estos medios sólidos selectivos
se ha efectuado con la finalidad de diseñar un procedimiento que
permitiera detectar la mayoría de serotipos del género Salmonella,
incluidas aquellas variantes que por presentar características bioquímicas
distintas no serían seleccionadas como presuntas de Salmonella, como
está descrito en el paso anterior, y confirmar mediante pruebas
bioquímicas apropiadas.
d. Confirmación: cultivar colonias presuntivas de Salmonella como está descrito
en el paso anterior y confirmar mediante pruebas bioquímicas apropiadas y
tests serológicos.
14

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Material y equipos
- Pipetas con capacidad para 1 mL y 0,1 mL.
- Puntas de pipeta con una capacidad para 1 mL y 0,1 mL.
- Pipetas de vidrio con capacidad para 10 mL ó pipeta y puntas de pipeta con
capacidad para 5-10 mL.
- Material de vidrio: botellas con capacidad inferior a 500 mL
- Tubos de vidrio con capacidad mínima de 5 mL y fondo cónico
- Asas de siembra recta
- Asas de siembra curva
- Palillos de madera estériles
- Baño de agua a 42 ºC
- Baño de agua a 50 ºC
- Incubador regulable, a 36 ºC
Medios de cultivo y reactivos
- Agua de Peptona Tamponada (APS): utilizada como medio de
preenriquecimiento.
- Cardo Rappaport-Vasiliadis cloruro de magnesio verde malaquita (RV)
Caldo Muller Kauffmann Tetrationato (TT)
- Placas de Agar Xilosa Lisina Deoxicolato (XLD): como medio de aislamiento.
- Placas de Agar Hektoen (AH): como medio de aislamiento.
- Agar Nutritivo (AN) o Agar Tristona de Soja (TSA)
- Agar Triple Azucar Hierro (TSI) en tubos de vidrio
- Caldo Urea (UREA)
- Agar Hierro Lisina (LIA)
- Reactivo oxidasa
- Caldo de triptona de Soja (TSB)
- Galería de identificación bioquímica comercial (API 20E, Rapid 20 E, etc)
- Reactivos de revelado de la galería de identificación: VP!, VP2, TDA,
Reactivo James
- Solución salina al 0,85 %
Procedimiento
Realizar todo el proceso en condiciones que eviten la contaminación de los
materiales y medios de cultivo: trabajar en una campana de flujo laminar o al
lado de la llama de un mechero Bunsen.
1. Suspensión inicial
Preparar la suspensión inicial usando como diluyente APS. Dicha suspensión
inicial se preparará añadiendo 25 g o mL de la muestra al diluyente, de forma
que se obtenga una dilución 1:10.
2. Preenriquecimiento no selectivo: incubar la suspensión inicial a 36 ºC
durante 18 h.
3. Enriquecimiento selectivo:
- Transferir 0,1 mL del cultivo obtenido en el apartado anterior a un tubo de
RV y 1 mL de cultivo obtenido en el apartado anterior a un tubo de TT.
15

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
- Incubar el caldo RV a 42 ºC/24 h y el caldo TT a 36 ºC/24 h.
4. Siembra en placa e identificación
- A partir del cultivo obtenido en RV tras una incubación de 24 h, inocular
por medio de un asa de siembra una placa Petri de cada uno de los
medios selectivos: XLD y AH. Sembrar las placas de forma que se
obtengan colonias bien aisladas.
- Proceder de la misma manera con el cultivo obtenido en TT tras una
incubación durante 24 h.
- Invertir las placas e introducirlas en la estufa a 36 ºC/24 h
- Examinar las placas para determinar la presencia de colonias típicas de
Salmonella:
XLD: colonias con una parte central negra y un borde ligeramente
transparente o rojizo debido al viraje de color experimentado por el
indicador.
AH: colonias verde-azuladas con o sin centro negro.
5. Confirmación
Selección de colonias para su confirmación
Seleccionar de las placas de cada medio selectivo, al menos 5 colonias
consideradas típicas o sospechosas que estén perfectamente aisladas.
Sembrar las colonias seleccionadas en la superficie de placas de AN o
TSA de manera que permitan el crecimiento de colonias bien aisladas.
Incubar las placas inoculadas a 36 ºC/24 h. Utilizar estos cultivos puros
para la confirmación bioquímica.
Confirmación bioquímica
A. TSI
Inocular las colonias aisladas en TSI, empleando para ello un asa de
siembra recta. Seleccionar una colonia bien aislada de la placa de TSA;
con el extremo de la aguja de inoculación tocar la colonia seleccionada
y pinchar en el tubo de TSI; retirar el asa del fondo del tubo y sembrar el
pico de flauta con un movimiento en zig-zag. Incubar a 36 ºC/24 h.
Interpretar los cambios en el medio siguiendo los siguientes criterios:
Fondo
• Amarillo: glucosa positivo (fermentación de glucosa).
• Rojo o sin cambios: glucosa negativo (no fermenta la glucosa)
• Burbujas o roturas: formación de gas a partir de la glucosa
• Negro: producción de sulfuro de hidrógeno (H2S)
16

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Superficie del pico
• Amarilla: lactosa y/o sacarosa positiva (utilización de la lactosa y/o
sacarosa)
• Roja o sin cambios: lactosa y/o sacarosa negativa (no utilización de la
lactosa y/o sacarosa)
Los cultivos típicos de Salmonella muestran un pico alcalino (rojo), fondo
con formación de gas y ácidos (amarillos) con formación de H2S
(ennegrecimiento del agar), en el 90 % de los casos.
B. Prueba de la oxidasa
Coger con un palillo estéril una porción de una colonia bien aislada en
TSA o AN. Aplicar la colonia sobre un papel de filtro humedecido con el
reactivo de la oxidasa o sobre un disco disponible comercialmente.
• Prueba positiva: si al cabo de 10 s aparece una coloración violeta.
• Prueba negativa: si el color del papel o disco no se vuelve violeta
oscuro en 10s.
C. Caldo Urea:
Inocular las colonias aisladas en UREA empleando para ello un asa de
siembra recta. Seleccionar una colonia bien aislada de la placa de TSA.
Incubar a 36 ºC/24 h,
• Presencia de ureasa: se observa una alcalinización del medio que vira
a rojo violáceo.
• Ausencia de ureasa: acidificación del medio de cultivo, con coloración
amarilla.
D. LIA:
Inocular las colonias aisladas en LIA empleando para ello un asa de
siembra recta. Seleccionar una colonia bien aislada de la placa de TSA;
con el extremo de la aguja de inoculación tocar la colonia seleccionada y
pinchar en el tubo de LIA hasta llegar a unos milímetros del final del tubo.
Incubar a 36 ºC/24 h.
• Reacción positiva: color violeta.
• Reacción negativa: color amarillo.
Interpretación de las pruebas bioquímicas
Se consideran como presuntas colonias de Salmonella identificadas
bioquímicamente, aquellas que den lugar a las reacciones indicadas en la
Tabla 1.
Identificación bioquímica empleando galerías de identificación
Cada una de las colonias que muestre reacciones típicas de Salmonella se
someterá de forma directa a una galería de identificación bioquímica. Sólo
17

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
se someterán a esta identificación las 5 colonias seleccionadas, si ninguna
de ellas genera un perfil característico. Si una de estas colonias genera un
perfil típico de Salmonella y el test serológico correspondiente es positivo,
se dará por concluido el análisis como presencia de Salmonella.
Confirmación serológica
La investigación de la presencia de antígenos O, Vi y H de Salmonella se
hace por aglutinación sobre portaobjetos o en tubo con los sueros
adecuados y después de eliminar las cepas auto-aglutinantes.
Las colonias aisladas y confirmadas bioquímicamente como Salmonella se
someterán a este tipo de confirmación.
Interpretación de resultados
Los resultados definitivos de este ensayo estarán de acuerdo con los resultados
obtenidos en la interpretación bioquímica y confirmación serológica, indicando la
presencia o ausencia de Salmonella spp. en la muestra por los gramos o mL de
producto empleado en la dilución inicial.
Tabla 1. Reacciones típicas de Salmonella
Test 1 Reacción positiva o negativa
Porcentaje de Salmonella
que muestran esta reacción
TSI Glucosa (formación ácido) + 100
TSI Glucosa (formación gas) + 91,9
TSI Lactosa - 99,2
TSI Sacarosa - 99,5
TSI SH2 + 91,6
Utilización Urea - 99
Reacción decarboxilación de
la lisina
+ 95,0
Citocromo oxidasa - 100
1
Ewing W.H. and Ball M.M., The biochemical reactions of members of the genus Salmonella.
Nacional Communicable Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1996).
18

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Recuento de Staphylococcus aureus: técnica en medio sólido por
extensión
El límite de detección para el recuento en placa de Staphylococcus aureus es
para productos sólidos < 10 ufc/g ó < 100 ufc/g (según el volumen inoculado en
el medio de cultivo de acuerdo con la variante del procedimiento) y para
productos líquidos o suspensiones líquidas < 1 ufc/mL ó < 10 ufc/mL (según el
volumen inoculado en el medio de cultivo de acuerdo con la variante del
procedimiento).
Staphylococcus aureus (S. aureus)
Bacterias que forman colonias típicas y/o atípicas sobre la superficie de un
medio de cultivo selectivo y que dan un resultado positivo a la reacción de la
coagulasa y/o al test de aglutinación en latex con anticuerpos específicos.
Material y equipos
- Pipetas con capacidad para 1 mL y 0,1 mL
- Puntas de pipeta con una capacidad para 1 mL y 0,1 mL
- Pipetas de vidrio con capacidad para 10 mL ó pipeta y puntas de pipeta con
capacidad para 5-10 mL
- Material de vidrio: botellas con capacidad inferior a 500 mL
- Tubos de vidrio con capacidad mínima de 5 mL y fondo cónico
- Asas de siembra recta
- Asa de Drigalsky
- Alcohol de 96 º
- Palillos de madera
- Incubador regulable a 36 ºC
Medios de cultivo y reactivos
- Agua de peptona salina (APS): utilizada como líquido de dilución
- Agar Baird Parker (BP): utilizado como medio de recuento
- Caldo infusión de cerebro-corazón (BHI) en tubos de vidrio de capacidad
superior a 10 mL
- Plasma de conejo rehidratado en agua destilada estéril
- Reactivos para aglutinación en látex (ej: Slidex Staph Plus, BioMerieux)
Procedimiento
Realizar todo el proceso en condiciones que eviten la contaminación de los
materiales y medios de cultivo: trabajar en una campana de flujo laminar o al
lado de la llama de un mechero Bunsen.
La porción de muestra empleada y las diluciones se realizarán siguiendo el
apartado de preparación de la muestra para el análisis.
Inoculación e incubación:
1. Transferir, por medio de una pipeta automática con una punta de pipeta
estéril, 0,1 mL de la muestra a analizar si es líquida ó 0,1 mL de la
suspensión inicial 10 -1 en el caso de otros productos, a cada una de las 2
19

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
placas de Agar Baird Parker marcadas con el código de la muestra. Repetir
el procedimiento para la dilución 10 -2 y para otras diluciones decimales si es
necesario.
2. Si en ciertos productos se desea, o es necesario detectar números bajos de
S. aureus, el límite de detección puede ser incrementado en un factor de 10,
inoculando 1 ml de la muestra a analizar si es líquida, ó 1 mL de la
suspensión inicial (10 -1 ) para otros productos, sobre la superficie de 3 placas
pequeñas de Agar (90 mm). En ambos casos, se realizarán duplicados,
empleando así 6 placas.
3. Mediante el asa de siembra recta de vidrio (asa de Drigalsky), extender
cuidadosamente el inóculo lo más rápido posible sobre las placas de BP.
4. Invertir las placas sembradas e incubarlas en estufa a 36 ºC durante 24-48
h.
Selección de las placas e interpretación:
2. Marcar y contar sobre el fondo de la placa las colonias típicas. Marcar y
contar también cualquier colonia atípica (1)
(2) Las colonias típicas son negras o grises, brillantes y convexas, de 1-5 mm
de diámetro después de una incubación de 24 h, y de 1,5-2,5 mm de
diámetro después de una incubación de 48 h, rodeadas por una zona clara.
Tras la incubación de más de 24 h, puede aparecer en esta zona clara un
anillo opalescente en contacto con las colonias.
Las colonias no características (fundamentalmente cepas de estafilococos coagulasa
positivo que contaminan productos lácteos,…) pueden presentar alguna de las siguientes
morfologías:
a. Colonias negras brillantes con/sin borde estrecho blanco; no existe zona clara o
apenas es visible y no existe el anillo opalescente o apenas se ve.
b. Colonias grises sin zonas claras.
3. Si se extendió 1 mL de inóculo sobre 3 placas, tratar estas placas como si
fueran una sola para todos los recuentos y procedimientos de confirmación.
4. Para realizar un recuento estimado de pequeñas cantidades de S. aureus
considerar todas las placas que contengan alguna colonia típica y atípica.
Seleccionar todas estas colonias para su confirmación siguiendo las
indicaciones dadas anteriormente.
A. Confirmación empleando plasma de conejo:
1. De la superficie de cada colonia seleccionada, coger un inóculo con un asa
recta estéril y transferirla a un tubo de BHI. Incubar a 36 ºC durante 24 h.
2. Añadir 0,1 mL de cada cultivo a 0,3 mL de Plasma de conejo en tubos con
base cónica estériles e incubar a 35 ºC. Examinar la coagulación del plasma
después de 4 a 6 horas de incubación y, en caso de que el test sea negativo,
examinar de nuevo a las 24 h.
20

Máster en Industria e Economía Leiteira.
Microbioloxía do Leite e Productos Lácteos: Prácticas
Test positivo: cuando el volumen del coágulo ocupe más de la mitad del
volumen original del tubo.
B. Confirmación Alternativa: partir de cada colonia aislada en un medio
general (Ej. TSA) y realizar la prueba de la catalasa y si las colonias son
catalasa positiva realizar a continuación el Test Slidex Staph Plus de acuerdo
con las instrucciones del fabricante
Expresión de resultados: en ufc/mL de producto si es líquido o ufc/g si es sólido
(tener en cuenta la dilución en la que se ha realizado el recuento).
- Estimar el nº de ufc teniendo en cuenta los resultados que se han obtenido
en el test de confirmación (si todas las colonias confirmadas han sido
coagulasa positivo, el número de microorganismos presentes será el mismo
que el obtenido en el recuento hecho en BP. En los demás casos se debe
corregir el recuento inicial realizado.
Referencias
- Norma UNE-EN ISO 6888-1 (ISO 6888-1:1999). Microbiología de los
alimentos para consumo humano y animal. Método horizontal para el
recuento de estafilococos coagulasa positivos (Staphylococcus aureus y
otras especies). Parte 1: técnica que utiliza el medo agar de Baird Parker.
- APHA 2000. Capítulo 33. Staphylococcus aureus. Compendium of methods
for the microbiological examination of foods. 4ª edición.
21