Ciclo reproductivo, cultivo en criadero y en el medio natural de la ...

5. Cultivo en criadero
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La determinación de proteínas se realizó a partir del método de Lowry et al.
(1951). La extracción de los lípidos se realizó con cloroformo‐metanol y se
cuantificaron por gravimetría, según el método utilizado por Folch et al. (1957).
Para la determinación de carbohidratos se utilizó el método de la antrona
(Fraga, 1956), un método distinto al utilizado para el estudio del ciclo gametogénico, el
método enzimático de Keppler y Decker (1984). Con este método se podía cuantificar
la glucosa procedente de la hidrólisis del glucógeno y, por otro lado, la glucosa libre.
Después de utilizarlo para el estudio del ciclo gametogénico, se observó que la
presencia de glucosa libre en las muestras era muy pequeña (entre un 1 y un 3% con
respecto al glucógeno), por lo que la utilización de este método selectivo y más
costoso, se dejó de utilizar.
El método de la antrona (Fraga, 1956) es un método colorimétrico basado en
una reacción específica para los carbohidratos, la reacción de Dreywood. Este método
da buenos resultados cuando se aplica a moluscos marinos. Se partió de 2‐3 mg por
duplicado de tejido liofilizado, al que se le añadió 2 ml de hidróxido potásico. Se
sonicaron las muestras durante 30 seg, se mantuvieron en baño a 90ºC durante una
hora para realizar una hidrólisis y posteriormente, en agitación durante 24 h. El
siguiente paso fue la neutralización con 6 ml de ácido sulfúrico 1N, agitación y
centrifugado a 3.000 rpm durante 5 min. Del sobrenadante se tomaron 3 alícuotas de 1
ml las cuales se sometieron a un baño de hielo en el que se añadió a cada tubo 5 ml del
reactivo de la antrona. Las muestras se agitaron y se colocaron en un baño a 90ºC
durante 16 min. Se enfriaron y leyeron en espectrofotómetro a 625 nm; previa
realización de una recta de calibración con concentraciones de 15 a 105 μg/μl de un
estándar de D(+) glucosa anhidra.
5.2.8 RECOGIDA DE MUESTRAS DE LARVAS
Durante el cultivo larvario se aprovechaban los cambios de agua (cada dos días)
para observar las muestras in vivo al microscopio. Dos veces a la semana se medían y
una vez a la semana se contaban.