Lab. Bioquímica II - Facultad de Ciencias Químicas - Benemérita ...

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Fac. Cs. Qs. Dpto. De BIOQUÍMICA - ALIMENTOS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I
Q.F.B
BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
ÁREA ESPECÍFICA DE: BIOQUÍMICA - ALIMENTOS
NOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE BIOQUÍMICA II
CÓDIGO: FAR 213L
FECHA DE ELABORACIÓN: MARZO 2002
NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: FORMATIVO
TIPO DE ASIGNATURA: CIENCIA DISCIPLINARIA
PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN:
M. C. Ma. Bertha Alvarado Hidalgo
M. C. Rosa Ma. Dávila Márquez
M. C. Eustoquia Ramos Ramírez
Q.F.B.Inés Zoraida García Cerón
M. C. Leticia García Albarrán
HORAS DE TEORÍA: HORAS PRÁCTICA: 2 CRÉDITOS:
PRE-REQUISITOS: Bioquímica I (FAR 111)
RECOMENDACIONES: Ninguna
PRESENTACION GENERAL DEL PROGRAMA
Es necesario integrar el conocimiento de las moléculas presentes en los organismos con las vías
metabólicas de las que forman parte, por ello en este laboratorio se realizan determinaciones de
moléculas relacionadas con el metabolismo de carbohidratos y lípidos. También se aislará DNA

OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO
Al término del curso, el alumno:
Relacionará al Glucógeno con la glucogénesis y la glucogenólisis
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Detectará la presencia de Succinato deshidrogenada y la relacionará con el ciclo de
Krebs y el transporte de electrones
Realizará algunas reacciones de lípidos para cauterizarlos
Determinará la acción de las sales biliares relacionándolas con su papel en la digestión
de lípidos
Determinará la presencia de cuerpos cetónicos relacionándolos con el desequilibrio entre
los metabolismos de carbohidratos y lípidos
Aislará DNA
METODOLOGÍA.
Todo proceso de enseñanza - aprendizaje que tenga como finalidad la construcción de
conocimientos significativos involucra al docente y alumnos en actividades regidas por la
participación y respeto mutuo, en donde se realizan acciones que permiten alcanzar los objetivos
propuestos, por ello en el desarrollo del curso:
Se considerará la asistencia y puntualidad, con la finalidad de promover en el estudiante un
sentido de responsabilidad.
A través de la formación de equipos se promoverá la iniciativa en la toma de decisiones,
creatividad, administración del tiempo y trabajo en equipo.
A través de la discusión de los resultados de las prácticas de laboratorio se promoverá el
desarrollo de la capacidad de solución a diferentes problemas que se le presenten.
INSTRUMENTACIÓN DIDÁCTICA A UTILIZAR
Equipamiento de laboratorio adecuado para cada práctica y pizarrón
CRITERIOS DE EVALUACIÓN
Los alumnos deberán cubrir el 100% de prácticas y reportes
La calificación mínima aprobatoria es de 7.0

PRÁCTICAS DE LABORATORIO PROPUESTAS:
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Están sujetas a la disponibilidad de reactivos y equipo, a continuación se presentan las prácticas
que como mínimo se realizan cada cuatrimestre.
PRÁCTICAS DE LABORATORIO PROPUESTAS:
1. Determinación de Glucógeno Hepático
2. Determinación de la Actividad de la Enzima Succinato Deshidrogenasa
3. Métodos Analíticos para la Caracterización de Lípidos
4. Lecitinas
5. Influencia de la Bilis (sales biliares) sobre la Tensión Superficial del Agua e Hidrólisis
Enzimática de los Lípidos
6. Determinación de Cuerpos Cetónicos
7. Aislamiento de nucleoproteínas y reconocimiento de DNA
NOTA: Después de realizada cada práctica, en la sesión siguiente se discute el
procedimiento y resultados obtenidos
BIBLIOGRAFÍA
Remitirse al programa teórico

INTRODUCCIÓN:
DETERMINACIÓN DE GLUCÓGENO HEPÁTICO
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El glucógeno es un polisacárido el cuál está presente en casi todos los órganos y tejidos.
Presenta una forma globular, tiene la propiedad de ganar o perder moléculas de glucosa con
gran facilidad, es la forma de almacén de la glucosa en los animales.
El glucógeno presenta varias unidades de α-D-glucosa, las cuales están unidas por
enlaces glucosídicos (α 1-4) y (α 1-6). Es importante mencionar que el glucógeno se deposita
principalmente en el hígado (2 a 5%/Kg) y en los músculos (0.5 a 2%/Kg) de donde se toma
cuando es necesario (Glucogenólisis).
OBJETIVO:
MATERIAL:
Cuantificar el contenido del glucógeno hepático.
Relacionar la presencia de glucógeno con la glucogénesis y glucólisis
• 4 tubos de ensaye
• 2 pipetas de 5ml
• 4 tapones de plástico
• 1 embudo
• Baño María (95ºC)
MATERIAL BIOLÓGICO:
• Hígado de rata recién sacrificada.
• Centrifuga
• Refrigerador
• Tijeras (deberá traerlas el alumno)
• Papel filtro
REACTIVOS:
• KOH 30 %
• Etanol absoluto
• Fenol 80 %
• H2SO4 Concentrado
• Glucógeno Solución estándar 5, 10,20,40 mg/ 2 ml
DESARROLLO:
1. Pesar 1g de hígado de rata recientemente sacrificada.
2. Colocar el hígado en un tubo de ensaye que contenga 4ml de KOH al 30%.
3. Con las tijeras cortar el tejido (dentro del tubo).
4. Tapar el tubo con un tapón de caucho e introducirlo en un baño María a 95ºC, dejar
hidrolizar durante 30 min.
5. Retirar el tubo del baño y adicionar 1.2 volúmenes de etanol absoluto,
(aproximadamente 3ml) dejar en el refrigerador durante 20 min.
6. Retirar del refrigerador y centrifugar durante 15 min. Deseche el sobrenadante.

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7. Adicione 10ml de etanol, tape, agite en el vortex y guarde en el refrigerador.
8. Filtre y colecte en un tubo de ensaye limpio.
9. Coloque en dos tubos de ensaye alícuotas de 2ml del filtrado.
10.Adicione a cada tubo 0.1ml de fenol al 80% y 2ml de H2SO4 concentrado TENGA
CUIDADO, esta operación debe realizarse en no más de 5 segundos.
11.Leer en espectrofotómetro a 490 nm.
CURVA PATRÓN.
Se preparan 4 tubos con una solución estándar de glucógeno como lo indica la siguiente
tabla.
NUMERO DE TUBO
GLUCÓGENO 1 2 3 4
5 mg 2.0ml --- --- ---
10 mg --- 2.0ml --- ---
20 mg --- --- 2.0ml ---
40 mg --- --- --- 2.0ml
Fenol 80% 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
H2SO4 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml
Leer absorbancia a 490 nm
Los valores obtenidos del filtrado de hígado se interpolan en la curva patrón, la
concentración así determinada se multiplica por 12.5 que es el factor de dilución.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es la función del KOH?
2. ¿Cuál es la reacción que se realiza en el filtrado al adicionar fenol y H2SO4?
3. ¿Podría detectar almidón con esta técnica?
4. ¿Cómo se relaciona el glucógeno con las vías metabólicas de carbohidratos?

INTRODUCCIÓN:
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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA
SUCCINATO DESHIDROGENASA
La enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del ácido succínico es una
Oxidorreductasa que cataliza la oxidación del succinato para formar fumarato siendo la coenzima
el FAD. Esta enzima se localiza en eucariotes en la membrana mitocondrial interna.
El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible
como el azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o
viceversa.
OBJETIVO:
COOH
FAD
FADH2 COOH
I
CH2
I
I
CH
CH2 HC
I
COOH Succinato deshidrogenasa
I
COOH
FADH 2
Succinato deshidrogenasa
Azul de
metileno
oxidado
Azul de
metileno
reducido
Que el alumno aprecie la actividad de le enzima Succinato Deshidrogenasa
mediante una reacción colorimétrica.
Que el alumno relacione la presencia de esta enzima con el Ciclo de Krebs y el
transporte de electrones
MATERIAL:
• 2 tubos de ensaye
• 2 pipetas de 5ml
REACTIVOS:
• NaOH al 10%
• Ácido succínico al 3%
neutralizado con NaOH al 10%
hasta pH=7.4
II
FAD
• Baño María a 50ºC
• Pinzas para tubo de ensaye
• Fenol al 90%
• Azul de metileno al 0.1%
• Aceite mineral
• Hígado de rata

DESARROLLO:
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1. Pesar 1gr. de hígado de rata recientemente sacrificada.
2. En el mortero molerlo con 3 ó 4ml de ácido succínico hasta obtener una masa.
3. Transferir en partes iguales a 2 tubos y proseguir según la siguiente tabla.
Número de tubo
Reactivo 1 2
Fenol al 90% 1.0ml ---
Azul de metileno 2.0 gotas 2.0 gotas
MEZCLAR CADA TUBO
Aceite mineral 0.5ml 0.5ml
4. Incube ambos tubos 10 minutos en el baño María a 50ºC
5. Observe los cambios
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son los colores del azul de metileno en sus estados oxidado y reducido?
2. ¿Cuál es la función del fenol en la reacción?
3. ¿En qué vías metabólicas está involucrada la enzima succinato deshidrogenasa?.

INTRODUCCIÓN:
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MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LA CARACTERIZACIÓN DE LÍPIDOS
Las funciones que desempeñan los lípidos en los organismos es muy variada, por
ejemplo : Como componentes estructurales de las membranas celulares, como fuentes de
energía, como disolventes para sustancias orgánicas, como precursores de otros componentes
celulares, etc.
Históricamente la química de los lípidos se ocupó inicialmente de las propiedades de
mezclas de gran importancia comercial. Se aplicaban pruebas para establecer si los lípidos eran
comestibles o si servían para preparar jabones o productos de belleza (aún se realizan pruebas
con estos fines)
Debido a la función que desempeñan en la célula o al uso que le asigne el hombre a los
lípidos, es importante saber aplicar diferentes técnicas analíticas para ellos.
OBJETIVOS:
1. Determinar el índice de acidez del aceite de maíz.
2. Formar complejos Urea - ácido graso.
3. Determinar la presencia de insaturaciones en un ácido graso.
4. Realizar reacciones características del colesterol.
MATERIAL:
• 2 vasos de precipitado 200 y 50 ml • 1 bureta
• 1 papel filtro • 1 microscopio
• Baño de hielo • 1 probeta
• 5 tubos de ensaye • 1 embudo
• Baño María a 60 ºC •
•
REACTIVOS:
• Ácido oleico • Colesterol
• Almidón 2 % • Etanol neutralizado
• Fenolftaleína. • Ácido esteárico
• H2SO4 concentrado • Urea en metanol
• NaOH 0.1 N •
El alumno deberá traer:
• Áceite de oliva
• Áceite de maíz

DESARROLLO:
Fundamento:
I. INDICE DE ACIDEZ
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La acidez se debe a la hidrólisis que por diversas causas presentan los aceites (mezclas
de triacil-glicéridos de P.F. bajos); este factor permite cuantificar la calidad o rancidez de un
aceite, valores aceptables están dentro del siguiente rango: 1.2 a 3.5.
El índice de acidez se define como la cantidad de miligramos de KOH necesarios para
neutralizar la acidez libre de 1 gramo de muestra.
Se calcula:
I. a =
Procedimiento:
1. Pese exactamente una muestra entre 10 y 15 gramos de aceite de maíz, sobre un
vaso de precipitado o un matraz previamente tarado.
2. Agregue 50 mls. de etanol neutralizado.
3. Introduzca al baño a 60 ºC, adicione 10 gotas de fenolftaleína y titule con NaOH 0.1N
hasta obtener un color rosa persistente.
4. Calcule el índice de acidez usando la fórmula.
Fundamento:
56 N V
m
II. FORMACIÓN DE COMPLEJOS ÁCIDOS GRASOS
CON UREA.
La formación de complejos permite la obtención de compuestos cristalinos fácilmente
aislables cuyo punto de fusión y forma de cristalización ayudan a la identificación del ácido graso.
Procedimiento:
56= Peso molecular del KOH
N= Normalidad de NaOH utilizado
V= mls de NaOH de normalidad N utilizados
m= gramos de muestra utilizados
1. Si el ácido graso es sólido disuelva 1 gr. en 2 ml. de metanol calentando suavemente
en baño María, tome 1 ml. y colóquelo en el vaso de precipitado de 50 ml, si el ácido
graso es líquido coloque directamente 1 ml. en el vaso de precipitado.
2. Agregue 5 ml. de disolución de urea en metanol, agite intensamente y deje enfriar a
0ºC en un baño de hielo o en el refrigerador.
3. Filtre, seque los cristales por aereación y observe al microscopio. Dibuje los cristales.

Fundamento:
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III. ABSORCIÓN DE I2 POR ÁCIDOS GRASOS INSATURADOS
Los ácidos grasos insaturados presentan reacciones de adición de alógenos formando
derivados halogenados saturados.
Cuando esta prueba es cuantitativa permite conocer adulteración de los alimentos, así
cuando el aceite de oliva tiene valores superiores de 88 probablemente esté adulterado con
aceite de semilla de algodón cuyo índice de iodo es 175 - 202.
Procedimiento:
1. Ponga en un tubo de ensaye 2 ml. de aceite de oliva o ácido oleico, agregue 5 gotas
de lugol y agite, esta mezcla debe ser rojiza, como la disolución de iodo.
2. Caliente a la flama y observe que el color va cambiando. Cuando el color inicial ha
desaparecido totalmente, deje enfriar y agregue 10 gotas de disolución de almidón,
observe e interprete sus resultados.
Fundamento:
IV. REACCIONES DEL COLESTEROL.
El colesterol por acción de agentes deshidratantes como el ácido sulfúrico y anhídrido
acético se transforma en colesterileno, compuesto de dobles enlaces conjugados que presenta
color.
PROCEDIMIENTO:
1. En un tubo de ensaye perfectamente seco, ponga 100 mg. Aproximadamente de
colesterol. Agregue 3 ml. de cloroformo para disolverlo. Reparta esta disolución en dos
tubos para efectuar, con cada mitad las reacciones siguientes.
a) Reacción de SALKOVSKY.
A unos de los tubos agregue 1 ml de H2SO4 concentrado, mezcle suavemente y deje
separar las capas, en la capa superior que contienen cloroformo aparecerá color rojo
y en la inferior un color rojo amarillento con fluorescencia verde.
b) Reacción de LIEBERMAN - BURKHARDT
Añadir 10 gotas de anhídrido acético y 2 gotas de H2SO4 concentrado, mezcle
cuidadosamente. Observe los cambios de coloración que se suceden.
CUESTIONARIO:
1. Defina lípido.
2. Escriba la reacción de hidrólisis ácida de los triacil glicéridos.
3. Escriba la fórmula de los ácidos grasos esenciales.
4. Escriba la reacción de un ácido graso insaturado y el I2.
5. Escriba la fórmula del colesterol.

INTRODUCCIÓN:
L E C I T I N A S
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Los fosfolípidos forman parte de los lípidos compuestos, están ampliamente distribuidos
en los tejidos de los organismos animales; entre los fosfolípidos encontramos a las
fosfatidilcolinas (lecitinas) y las fosfatodietanolaminas (cefalinas). Estos junto con las proteínas
son los principales componentes de las membranas de las células y de sus organelos. También
intervienen en el metabolismo.
Los fosfolípidos de forraje aumentan el aprovechamiento de las sustancias nitrogenadas y
el fósforo.
OBJETIVOS:
1. Aislar lecitina de la yema de huevo y comprobar su presencia
2. Hidrolizar la lecitina obtenida y detectar alguno de sus componentes.
MATERIAL: REACTIVOS:
• 1 vaso de precipitado • Etanol caliente
• 3 tubos de ensaye • Acetona
• 1 agitador • Solución saturada de Cloruro de
cadmio
• 1 embudo • NaOH al 10%
• Papel filtro • Agua destilada
• 2 Pipeta 10 ml. • Fenolftaleína
• 1 Probeta 100 ml. • HCl al 50%
• 3 Pipetas 5 ml.
• Baño maría
METODOS:
I. AISLAMIENTO DE LAS LECITINAS DE LA YEMA DE HUEVO
En un vaso de precipitado se pone la mitad de una yema de huevo, se le añaden 20ml de
alcohol caliente y se mezcla con una varilla de vidrio. La mezcla se enfría y se filtra en un
tubo de ensaye seco.
II. DETECCIÓN DE LAS LECITINAS
En un tubo de ensaye seco vierta 5ml de acetona y se le añade gota agota 1ml del filtrado
obtenido en el método 1. Esperara 20 minutos. La aparición de turbidez indica la
precipitación de lecitina.

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III. REACCIÒN DE RECONOCIMIENTO DE LAS LECITINAS
En un tubo de ensaye seco vierta 2ml de disolución alcohólica de lecitina (filtrado
obtenido en el método uno) y se añade 1ml de solución saturada de cloruro de cadmio.
Espere 20 minutos. Se forma un precipitado blanco en forma de copos de un compuesto
de cadmio con lecitina.
IV. HIDRÓLISIS DE LA LECITINA
En un tubo de ensaye seco vierta 5ml de disolución de lecitina en alcohol (filtrado
obtenido en el método uno). Añada 3ml de NaOH 10% y ponga a hervir la mezcla durante
5 minutos en baño María NO AGITE. La colina que se desprende como resultado de la
hidrólisis se descompone con formación de trimetilamina. Esta última posee un olor
característico de salmuera de arenques y se reconoce fácilmente por este indicio.
V. DETECCIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS
Diluya el hidrolizado alcalino obtenido con 2ml de agua, añada 2 gotas de fenolftaleína y
agregue gota a gota HCl 50% hasta que vire el indicador, separe los ácidos grasos que
suben a la superficie por filtración
REPORTE:
METODO 1.- Objetivo, observaciones, conclusión.
METODO 2.- Objetivo, observaciones, conclusión.
¿Por qué precipitan las lecitinas en presencia de acetona?
METODO 3.- Objetivo, observaciones, conclusión.
¿Por qué el cadmio precipita las fosfatidilcolinas?
METODO 4.- Objetivo, observaciones, conclusión.
Escribir la fórmula de la trimetilamina y de la colina
METODO 5.- Objetivo, observaciones, conclusión.
¿Por qué se separan los ácidos grasos?
CUESTIONARIO:
1. Escriba la clasificación de los ácidos grasos.
2. Escriba la fórmula de la fosfatidilcolina.
3. Escriba en qué organelos celulares se encuentran los lípidos compuestos.

INTRODUCCION.
DETECCIÓN DE COLESTEROL EN CEREBRO
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El colesterol (cuyo nombre químico es 3-hidroxi-5,6-colesteno) es el esteroide más
común. Se encuentra ampliamente distribuido en todas las células del organismo, pero
especialmente en las del tejido nervioso -cerebro y médula espinal.
Es el precursor de las sales biliares, el cual se produce en el hígado y se almacena en la
vesícula biliar.
También es el precursor de la vitamina D y de la pregnenolona, sustancia vital en la
producción de todas las hormonas sexuales humanas (andrógenos, estrógenos y
progestágenos) y otras más igualmente importantes (glucocorticoides y mineralocorticoides).
En las membranas celulares de los mamíferos, el colesterol forma complejos con las
proteínas y los fosfolípidos, y gracias a su sistema de anillos fusionados modula la fluidez de las
membranas.
OBJETIVO.
Detectar la presencia de colesterol en células del Sistema Nervioso Central mediante las
reacciones de Schiff y de Salkovsky.
MATERIAL.
• 1 gradilla.
• 1 mortero con mango.
• 1 círculo de papel filtro.
• 1 embudo.
• Estufa a 40 0 C
• 3 tubos de ensayo de 20X15 (dos) y 15X13 (uno).
• 3 pipetas (1 de 5 ml y las otras de 1 ó 2 ml).
Material que debe traer el alumno:
• Bisturí o navaja.
• 1 placa de vidrio de 10 por 10 cm.
• 1 abate lenguas o espátula metálica
• Yeso
MATERIAL BIOLÓGICO
El alumno deberá traer 2 g de sesos de pollo (aproximadamente el de 1 cabeza). Todo el
grupo puede ponerse de acuerdo y cambiar a sesos de res, el cual es mucho más grande y
puede alcanzar hasta para dos grupos.

REACTIVOS.
• H2SO4 Concentrado
• Acido acético glacial.
• Cloroformo.
DESARROLLO
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1. Se pesan 2 g de sesos y se desmenuzan lo más posible con la navaja en el
mortero. Se añaden 4 g de yeso y se trituran con los sesos usando el
mango del mortero.
2. La masa obtenida se aplica con el abate lenguas o espátula sobre la placa de vidrio
formando una capa fina, luego se seca en la estufa a 40 grados centígrados por un
tiempo de 30 minutos o hasta un secado completo (masa totalmente blanca).
3. Una vez seca la masa se separa de la placa con la navaja o bisturí y se coloca en el
mortero limpio y completamente seco para triturarla hasta obtener polvo.
4. El polvo se coloca en un tubo de ensayo y se le agregan 4 ml de cloroformo. Se agita
cuidadosamente por 5 minutos.
5. Posteriormente se filtra la mezcla anterior a otro tubo de ensaye.
6. Del filtrado anterior se toma 1 ml y se le coloca en 1 tubo de ensaye limpio y seco.
7. Al tubo anterior se le agrega 1 ml de ácido sulfúrico concentrado deslizándolo por las
paredes. Observar la aparición de un anillo coloreado.
8. La mezcla anterior se agita cuidadosamente. Al separarse la capa superior es roja y la
inferior es roja amarillenta y con fluorescencia verde. Dichos colores se observan mejor
con iluminación solar.
9. A la capa inferior añadirle 1 ml de ácido acético glacial y observar el cambio de color
mientras que la fluorescencia continúa. Si no se observa al Sol solo se verá un color
verde seco y opaco, por lo cual se debe observar a la luz solar.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el fundamento de la coloración obtenida por el colesterol?
2. ¿En qué paso ya se tiene separado al colesterol?
3. ¿Cuál es la función del yeso?
4. ¿Cómo puede observarse la fluorescencia?

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INFLUENCIA DE LA BILIS (SALES BILIARES) SOBRE LA TENSIÓN SUPERFICIAL
DEL AGUA
INTRODUCCIÓN:
En la naturaleza existen sustancias capaces de disminuir la tensión superficial de los
líquidos. Ellas se denominan sustancias tensoactivas.
Tales sustancias presentan moléculas con carácter dipolar, es decir, una parte de la
molécula es hidrófila y la otra hidrófoba. Estas moléculas entran en interacción molecular con el
disolvente por su extremo hidrófilo, mientras que el otro extremo tiende a alejarse del líquido.
Como resultado, las sustancias tensoactivas se acumulan en la capa superficial de la disolución.
Su extremo hidrófobo estará dirigido hacia afuera de la fase. Todo esto conduce a la
disminución de la tensión superficial de la solución.
Las sustancias tensoactivas juegan un papel de gran importancia en la naturaleza,
ayudando a mezclar mejor los líquidos que generalmente no se mezclan. Por ejemplo agua y
grasa.
etc.
OBJETIVO:
Son sustancias tensoactivas los jabones, los ácidos grasos, aminoácidos, sales biliares,
Demostrar la capacidad que tienen las sales biliares para disminuir la tensión superficial
del agua.
MATERIAL:
• 1 vaso de precipitado
• 2 tubos de ensaye
• 2 varillas de vidrio
REACTIVOS:
• Alcanfor
• Bilis
• Flor de azufre
• Agua destilada

DESARROLLO:
1. .- PRUEBA DEL ALCANFOR.
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a).- En un vaso de precipitado se vierten 200 ó 250ml de agua, cuidadosamente se ponen
en ella varios pedacitos de alcanfor. Los pedacitos de alcanfor se mueven rápidamente en
la superficie del agua. Esto se explica por el hecho de que los diferentes lados del pedacito
de alcanfor se disuelven en el agua con diferente velocidad y por lo tanto al rededor del
pedacito se crea una tensión superficial desigual, de manera que el pedacito se traslada
hacia donde la tensión superficial es más alta.
b).- Introduzca la varilla en la bilis y después en el vaso donde está el alcanfor. El
movimiento de los pedacitos de alcanfor cesa ya que bilis disminuye la tensión superficial.
2. PRUEBA DE LA FLOR DE AZUFRE:
a).- Coloque en dos tubos de ensaye 3 ó 4ml de agua destilada, a uno de los tubos
agregue de 6 a 8 gotas de bilis.
b).- Sobre la superficie de ambos tubos coloque una pequeña cantidad de flor de azufre.
Observe la distribución del azufre en ambos tubos. ¿Cómo explica la diferencia entre
ambos tubos?
CUESTIONARIO:
1. Defina tensión superficial.
2. ¿Qué es un agente tensoactivo?
3. Escriba los nombres y fórmulas de las sales biliares.
4. Explique las funciones de las sales biliares.

INTRODUCCIÓN:
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LÍPIDOS
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Las lipasas y las esterasas catalizan la hidrólisis de enlaces éster que se encuentran en
un gran número de lípidos saponificables.
CH2 - O - CO - R CH2 - OH
R - OC - O - CH R - OC - O - CH + 2 R - COOH
Lipasa
CH2 - O - CO - R CH2 - OH
Estas enzimas están ampliamente distribuidas el la naturaleza y son especialmente
importantes en el tracto gastrointestinal donde funcionan en la digestión y absorción de grasas.
Debido a que las grasas no son solubles en agua, las enzimas deben actuar en la
interfase lípido-agua, lo cual trae como consecuencia una disminución de la actividad enzimática.
Consecuentemente, será necesario el empleo de los agentes emulsificantes tales como
las sales biliares que producen a menudo una estimulación marcada de la hidrólisis enzimática
de los lípidos, debido al incremento de la interfase lípido-agua. En la leche homogeneizada los
glóbulos de grasa están en un estado muy finamente dividido y este material sirve como sustrato
excelente para las lipasas. En este experimento se emplea como enzima una lipasa muy potente
que se encuentra en el páncreas desecado.
OBJETIVO:
Demostrar la acción de la lipasa pancreática en presencia y ausencia de la bilis.
MATERIAL:
• 8 matraces Erlen Meyer de 125 ml • 1 pipeta de 5 ml
• Pinza para bureta • 1 bureta de 25 ml
• 1 pipeta de 10 ml • 1 soporte universal
• 1 Pipeta de 1 ml • termómetro y baño maría a 37º C
REACTIVOS:
• Pancreatina al 1% en agua • Etanol al 95%
• KOH 0.05 N • Fenolftaleína
El alumno deberá traer:
• Leche homogeneizada
• Bilis.

MÉTODO:
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1. Preparar una serie de matraces Erlen Meyer de acuerdo a la siguiente tabla:
MATRAZ NÚMERO
REACTIVOS (ML) T1 1 2 3 4 5 6 T2
Leche homogeneizada 5 5 5 5 5 5 5 5
Extracto neutro de
pancreatina al 1%
Extracto de pancreatina
0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0
caliente a ebullición por
3 minutos
1.5 0 0 0 0 0 0 1.5
Bilis
Tiempo de incubación
0 0 0 0 1 1 1 1
a 37ºC.
45' 15' 30' 45' 15' 30' 45' 45'
2. después de que cada matraz ha cumplido su tiempo de incubación, retirarlos del baño,
adicionar 12.5 ml de alcohol al 95% y 3 gotas de fenolftaleína y titular con una solución
de hidróxido de potasio 0.05 N.
3. Agitar el matraz durante la titulación tan rigurosamente como sea posible, ya que la
proteína puede enmascarar los ácidos grasos.
4. Titular cada matraz tan rápido como sea posible, contra un fondo blanco, debido a que
la digestión por la lipasa continúa durante la titulación.
RESULTADOS:
a) Datos.- Restar del gasto de hidróxido de potasio de cada uno de los matraces el gasto
de hidróxido de potasio del testigo.
b) gráficas
Gasto de
KOH
corregido
1,2,3.
CUESTIONARIO
Gasto de
KOH
corregido
4,,5,6.
Tiempo de Hidrólisis Tiempo de Hidrólisis
1. ¿Cuál es la interpretación de las gráficas obtenidas?
2. ¿Cuál es el objeto de agregar bilis en el experimento?
3. ¿Cómo se clasifican los lípidos?
4. ¿Cuáles son los ácidos grasos más importantes de la grasa humana?
5. ¿Cuál es la importancia clínica de la lipasa en un diagnóstico?
6. ¿Cuál es la composición y el funcionamiento del tejido adiposo?

INTRODUCCIÓN
DETERMINACIÓN DE CUERPOS CETÓNICOS
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El hábito humano de consumir alimentos pocas veces al día (3 ó 4) conduce a un proceso
cíclico de nutrición.
En condiciones normales los combustibles empleados en los tejidos para obtener energía
son: Glucosa, ácidos grasos, cuerpos cetónicos y aminoácidos.
En caso de ayuno hay cambios que requieren de la adaptación del organismo y esto trae
como consecuencia modificaciones en los patrones metabólicos y por lo tanto en las moléculas
utilizadas como combustibles. Durante las primeras etapas del ayuno se realizan cambios
hormonales, se deja de liberar insulina y se aumenta la liberación de glucagon, lo que ocasiona
un aumento en la Glucogenólisis, estimulación de la Lipólisis, inhibición de la síntesis de
triacilglicéridos, aumento de la Beta - oxidación y producción de cuerpos cetónicos
(Cetogénesis), si el ayuno es prolongado se presenta un desequilibrio entre el metabolismo de
carbohidratos y el de lípidos lo que ocasiona que los niveles de cuerpos cetónicos se eleven en
sangre y sean eliminados por orina donde son detectados fácilmente.
OBJETIVO
Demostrar la presencia de cuerpos cetónicos como consecuencia de un ayuno
prolongado.
MATERIAL:
• 2 Tubos de ensaye
• 1 Pipeta de 10 ml.
• 1 Pipeta de 2 ó 5 ml
MATERIAL BIOLÓGICO.
• La orina de animal en ayunas será proporcionada por el bioterio
• Los alumnos deberán traer orina de personas en ayuno de 8 horas (la primera del día),
diabéticas y normales.
REACTIVOS:
• Reactivo de Imbert (Nitroprusiato de sodio al 5%)
• Amoniaco concentrado o Hidróxido de amonio concentrado

DESARROLLO:
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1. En un tubo de ensaye se colocan 2.5 ml de orina (Rata, perro o humana) y se agregan
10 gotas del reactivo de Imbert. Se mezcla.
2. Deslizando por las paredes del tubo se agrega 0.5 ml de Amoniaco o hidróxido de
amonio para obtener una reacción zonal.
3. Cuando la reacción es positiva, en el punto de contacto aparece un anillo violeta cuya
intensidad es proporcional a la cantidad de cuerpos cetónicos.
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué nombre recibe la presencia de cuerpos cetónicos en sangre y orina cuando se
encuentran en cantidades más altas que las normales?
2. ¿En qué condiciones metabólicas se acumulan cuerpos cetónicos?
3. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de Imbert?

INTRODUCCIÓN
AISLAMIENTO DE RNA
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Los ácidos nucléicos son polímeros de alto peso molecular, sus monómeros son
nucleótidos que se polimerizan al formar enlaces fosfodiéster 3' -- 5'
Los ácidos nucléicos presentes en las células son el ácido Desoxirribonucleico (DNA) y el
ácido Ribonucléico (RNA) que desempeñan diferentes funciones, el DNA es el asiento de la
información genética; del RNA existen tres tipos: RNA mensajero (RNAm) que lleva la
información del DNA a los ribosomas, RNA ribosomal (RNAr)que forma junto con las proteínas a
los ribosomas y RNA de transferencia (RNAt)responsable de trasladar a los aminoácidos del
citoplasma a los ribosomas.
Cuando se trata de aislar RNA debe decidirse primero si se va a extraer RNA total o un
tipo especial de RNA (RNAm, RNAr, RNAt), de esta decisión dependerá la técnica a seguir.
La extracción de RNA total puede realizarse de dos formas diferentes, la primera usando
NaCl, técnica sencilla donde el RNA obtenido esta contaminado con DNA y por lo tanto no puede
utilizarse para estudios que requieran precisión.
La segunda técnica es utilizando fenol, en donde el RNA que se obtiene es más puro
aunque a veces puede presentar una ligera contaminación con polisacáridos.
OBJETIVO:
Aislar RNA total de hígado de rata.
FUNDAMENTO:
TÉCNICA DEL FENOL.- El fenol es un agente desnaturalizante de proteínas y
que además precipita al DNA dejando al RNA en la fase acuosa.
REACTIVOS:
• fenol al 90%
• Etanol: agua (3:1)
• Acetato de potasio 20%
(pH=5 ajustando con HCl)
• Etanol absoluto
• Hielo
• Eter (acetona)
MATERIAL:
• Homogenizadora • 2 pipetas Pasteur
• 12 tubos de ensaye • 1 vaso de precipitado de 250 ml
• 1 pipeta de 5 ml • Gasa
• Centrífuga • 1 matraz Erlen Meyer de 125 ml
• 1 embudo • Papel filtro

El alumno deberá traer:
• 1 rata de tamaño considerable (en ayuno de 12 horas)
• 2 chuzos para las pipetas Pasteur.
• Equipo de disección (Pinzas, bisturí, tijeras).
• 1recipiente pequeño (para hacer baño de hielo)
DESARROLLO:
Antes de iniciar:
a) . Pese el papel filtro y el vaso de precipitado.
b) Ponga en el baño de hielo el vaso (pesado) y el matraz.
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1. Matar a la rata con éter
2. Extraer rápidamente el hígado y colocarlo en el vaso de precipitado frío.
3. Pesar exactamente el hígado.
4. Con el vaso de precipitado dentro del baño de hielo corte con tijeras el hígado (lo
más rápido que pueda).
5. Agregue 25 ml de agua destilada y homogeneice en el homogeneizador durante 1
minuto.
6. Filtre rápidamente sobre gasa doblada en cuatro al matraz frío.
7. Adicione 25 ml de fenol 90% y agite vigorosamente a temperatura ambiente
(CUIDADO, el fenol causa graves quemaduras, en caso de que salpique lavarse con
abundante agua).
8. Enfriar en el baño de hielo 5 minutos.
9. Traslade a tubos de ensaye, equilíbrelos y centrifugue a 3000 r.p.m. durante 15
minutos .
10.Con ayuda de las pipetas Pasteur separe la capa superior y póngala en otro tubo, tire
el precipitado.
11.Centrifugue el sobrenadante obtenido a 3000 r.p.m. durante 5 minutos.
12.Decante pasando al vaso de precipitado y mida el volumen obtenido.
13.Adicione por cada 10 ml de líquido 1 ml de acetato de potasio 20% (pH=5).
14.Enfríe en el baño de hielo y agregue alcohol absoluto en relación de 2 ml por ml
medido (para precipitar el RNA).
15.Repartir en tubos de ensaye y centrifugar a 2000 r.p.m. 5 minutos (tire el
sobrenadante ).
16.Resuspender el precipitado en 5 ml de una mezcla de etanol:agua (3:1) y centrifugar
5 minutos 2000 r.p.m.
17.Tire el sobrenadante y resuspenda con etanol absoluto y centrifugue 5 minutos a
2000 r.p.m.
18.Repetir el paso 17 ahora con éter (o acetona).

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19.Tire el sobrenadante, añada éter o acetona 1 ó 2 ml para resuspender y vacíe al
papel filtro (ya pesado).
20.Dejar secar al aire y pesar.
21.Calcule el rendimiento.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cual es la composición química del RNA?.
2. ¿Por qué el fenol desnaturaliza el DNA?.
3. ¿Cuál es la función del acetato de potasio?.
4. ¿Cuál es la función del etanol y el éter de los pasos 16 y 18?.

INTRODUCCIÓN:
AISLAMIENTO DE NUCLEOPROTEÍNAS Y
RECONOCIMIENTO DE DNA
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Las nucleoproteínas son proteínas compuestas constituidas de proteínas como las histonas
y protaminas conjugadas con ácidos nucleicos.
El DNA o ácido desoxirribonucleico es un componente de los cromosomas del núcleo
celular, el DNA es un polinucleótido, las unidades que lo conforman, llamadas nucleótidos están
constituidas por desoxirribosa, una base nitrogenada (que puede ser púrica o pirimídica) y
fosfato.
Las nucleoproteínas de DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, pero son
insolubles en soluciones salinas diluidas.
Una fuente importante de nucleoproteínas son los tejidos ricos en núcleos (leucocitos,
espermatozoides, células hepáticas, etc.). En soluciones salinas concentradas las
desoxirribonucleoproteínas forman disoluciones muy viscosas y se solubilizan en soluciones
salinas diluidas.
Al ser precipitadas, las nucleproteínas se sedimentan en forma de hilos.
Una de las técnicas empleadas para diferenciar nucleoproteínas de DNA de las
nucleoproteínas de RNA es la reacción con difenilamina, que frente a las nucleoproteínas de
DNA da una coloración azul a diferencia del color verde que da frente a las nucleoproteínas de
RNA
OBJETIVOS
Aislar desoxirribonucleoproteínas a partir de hígado de rata
Realizar una reacción de identificación de DNA
MATERIAL
• Hígado de rata
• Mortero con pistilo
• Vidrio de reloj
• Vaso de precipitado de 500 ml
• Vaso de precipitado de 250 ml
• Bureta
• Tubos para centrífuga
• Pinzas para tubo de ensaye
• Baño maría
• Gradilla
• Pipetas de 5 y 10 ml.

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REACTIVOS
• NaCl 1N
• Agua destilada
• Reactivo de difenilamina
• Na OH al 4%
DESARROLLO.
AISLAMIENTO DE NUCLEOPROTEINA DE DNA
1. Pese 10 gr. de hígado de rata
2. Tritúrelo durante 10-15 min. en el mortero agregando poco a poco 70 ml de NaCl.
3. La disolución viscosa obtenida transfiérala a tubos para centrifuga
4. Centrifugue los tubos durante 10 min. a 2500 rpm
5. Decante el líquido sobre la probeta y mida el volumen obtenido
6. En el vaso de precipitado de 500 ml. Agregue agua destilada en una relación de 6 ml
de agua por ml de sobrenadante obtenido.
7. Vierta lentamente el sobrenadante en el agua que está en el vaso de precipitado y
girando lentamente con la varilla de madera trate de enrollar los hilos de
nucleoproteína de DNA que se va precipitando.
REACCION DE RECONOCIMIENTO DE DNA
1. Filtre el precipitado de nucleoproteínas obtenido anteriormente
2. Tome una pequeña cantidad del precipitado y disuélvalo en un tubo de ensayo con 1
ml de NaOH al 4%
3. Añada 1 ml de reactivo de difenilamina y ponga el tubo durante 15 o 20 min. en baño
maría hirviendo.
4. La aparición de una coloración azul indica la presencia de DNA
CUESTIONARIO:
1. Escriba la estructura de los cuatro nucleótidos que podemos encontrar en el
DNA.
2. ¿Qué función tienen los cromosomas?
3. ¿Cuál es la composición de los cromosomas?
4. ¿Qué diferencia existe entre los nucleótidos de DNA y los de RNA?