Epidemiología de Plum pox virus y Citrus tristeza virus en bloques ...

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6. Validación de “Spot” y “Tissue-print” RT-PCR a tiempo real. Comparación con técnicas serológicas y cálculo de parámetros de diagnóstico Tabla 6.1: Número de grupos formados mezclando plantas positivas (infectadas por PPV) con plantas negativas (sanas) por época del año para determinar el número máximo de plantas de vivero que pueden mezclarse Nº plantas positivas 1 a Nº plantas negativas Mezcla de plantas positivas 110 Total plantas Repeticiones 0 1 6 1 1 2 6 1 2 3 6 1 3 4 6 1 4 5 6 1 5 6 6 1 6 7 6 1 7 8 6 1 8 9 6 1 9 10 6 a Cada grupo de plantas estaba compuesto por tres hojas o yemas según la época del año Todos los grupos formados se analizaron mediante ELISA-DASI y “Spot” RT-PCR a tiempo real según se detalla en los apartados 3.3.1.1.1 y 3.3.1.1.2 del Capítulo 3, respectivamente. 6.3.1.1 Métodos estadísticos Para determinar el número máximo de plantas de vivero que se pueden mezclar en un extracto, se empleó un modelo lineal generalizado (Molenberghs y Verbeke, 2005) suponiendo que la variable de interés (grupos que resultaron positivos) sigue una distribución binomial. Se utilizaron cuatro factores: Patrón, Técnica, Estación del año y Número de plantas por muestra con sus interacciones. Cuando existieron diferencias significativas en un factor, para apreciar entre que niveles dentro de cada factor había diferencias, se aplicaron los intervalos LSD “Least Significant Difference”. Se utilizó el programa para PC, SAS 9.2.
6. Validación de “Spot” y “Tissue-print” RT-PCR a tiempo real. Comparación con técnicas serológicas y cálculo de parámetros de diagnóstico 6.3.2 Validación de “Spot” RT-PCR a tiempo real para la detección de PPV. Comparación con la técnica ELISA-DASI y cálculo de los parámetros de diagnóstico en condiciones de vivero 6.3.2.1 Material vegetal: parcelas experimentales Se utilizaron los resultados obtenidos en los diferentes muestreos efectuados en las distintas parcelas experimentales situadas en Llíria y Carlet (Capítulo 3, apartado 3.2). A su vez, se estableció una nueva parcela plantada en la zona de Llíria en diciembre de 2007. Ésta estaba formada por 500 plantas de vivero procedentes de la parcela de Carlet que resultaron negativas por ambas técnicas en el último muestreo realizado en noviembre de 2007. En abril de 2008, cuando las plantas brotaron, se analizaron tanto por ELISA-DASI como por “Spot” RT-PCR a tiempo real. Por tanto, se utilizaron un total de 5.047 muestras. 6.3.2.2 Cálculo de la concordancia entre técnicas Para medir la concordancia entre técnicas se utilizó el índice de kappa (k) de Cohen (1960). Se utilizó la prueba de Mc Nemar (1947) para detectar diferencias entre los valores marginales de la tabla de contingencia. Si la prueba de Mc Nemar fue significativa se calculó el índice BAK (Byrt et al., 1993). En aquellos casos en los que la prevalencia de la población era mayor de 80% ó menor de 20% se calculó el índice PABAK (Byrt et al., 1993). 6.3.2.3 Cálculo de los parámetros de diagnóstico de las técnicas ELISA- DASI y “Spot” RT-PCR a tiempo real en condiciones de vivero El cálculo de los parámetros de diagnóstico de las dos técnicas evaluadas se realizó por dos procedimientos diferentes en primavera, época del año dónde normalmente se inspeccionan los viveros para detectar plantas infectadas por PPV: 1) Se compararon los resultados obtenidos en 729 plantas de vivero que se analizaron en la parcela de Llíria en dos primaveras consecutivas (mayo de 2007 y abril de 2008). Para esta comparación se tomó como verdadera positiva a toda planta que había resultado positiva por ambos métodos en mayo de 2007. De la misma forma se tomó como verdadera negativa toda planta que había sido negativa por ambos métodos en mayo de 2007. Para resolver las discrepancias entre ambas técnicas se utilizaron los resultados obtenidos en mayo de 2008. Se siguió el protocolo OEPP/EPPO (2004b), considerándose que eran verdaderos positivos aquellas plantas positivas por ambos métodos en mayo de 2008 y verdaderos negativos si fueron negativas por ambas técnicas o al menos por una de ellas. La sensibilidad (proporción de verdaderos positivos detectados por la técnica) y la especificidad (proporción de verdaderos negativos detectados por la técnica) y sus intervalos de confianza (95%) fueron calculados según Altman y Brand (1994a). La razón de verosimilitud positiva (proporción de verdaderos positivos detectados 111
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GENERALITAT VALENCIANA Consellería
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CAPÍTULO 4. SUSCEPTIBILIDAD A PPV-
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