2004 - Instituto de Biotecnología - UNAM

uso de compuestos enjaulados, nuevas técnicas para recubrir las celdas para evitar el pegado, la
adquisición rápida (12-20 mseg/imagen) con una cámara CCD muy sensible y rápida y optimizar la
emisión de fotones del flash, nos ha permitido medir cambios en el [Ca2+]i en un espermatozoide
nadando. Hemos podido descubrir una relación precisa y discreta entre fluctuaciones individuales en el
[Ca2+]i superpuestas a un cambio sostenido, con eventos individuales de cambio de dirección que se
consideran clásicos de la quimotaxis. Mejorando aún las condiciones de registro hemos incluso podido
registrar simultáneamente la forma del flagelo y su concentración local de [Ca2+]i. Estos hallazgos
novedosos nos permitirán establecer la conexión en los cambios en el [Ca2+]i y un comportamiento
complejo y dinámico como lo es la movilidad. El trabajo tiene importantes implicaciones en el campo de
la fisiología del espermatozoide y de la fecundación. Existen antecedentes de defectos de motilidad y en
el funcionamiento de canales de Ca2+ con problemas de fecundación o concepción. Entender los
mecanismos moleculares que gobiernan la motilidad y su relación con el [Ca2+]i permitirá avances
significativos en este campo. Los avances de este trabajo no se circunscriben al espermatozoide ya que
muchos tipos de células tienen flagelo y el movimiento es importante para su función. La reacción
acrosomal (AR) del espermatozoide se dispara debido a la activación de canales iónicos. En el erizo de
mar la RA requiere del influjo de Ca2+ y Na+ y eflujo de K+ y H+. Durante esta reacción la membrana
plasmática se fusiona con la membrana del acrosoma, que es una gran vesícula. Como resultado de lo
anterior se producen vesículas híbridas (ARVs) que se liberan al medio externo. Durante este período
caracterizamos esta vesículas en cuanto a la presencia de algunas proteínas de la maquinaria sináptica
como SNAP-25 y VAMP, dos proteínas reguladoras de la exocitosis. En las ARVs estas dos proteínas
están asociadas a la membrana, a juzgar por ensayos de proteólisis y de partición en Triton X-114. La
presencia de actividad de canales iónicos en estas vesículas se caracterizó incorporándolas a bicapas
planas. Dichas bicapas mostraron tres tipos principales de actividad de canal unitario. El más frecuente
fue un canal catiónico con una conductancia principal de 120 pS, pobremente voltaje-dependiente y con
una baja probabilidad de apertura que aumenta a potenciales negativos. Este canal se activa con AMPc,
se bloquea con Ba2+ y tiene una pobre selectividad a cationes monovalentes (PK+/PNa+~5). Las
características de este canal son similares a las de un canal que reportamos en el flagelo. Estas
vesículas híbridas del espermatozoide del erizo de mar representan una preparación novedosa y
potencialmente importante para profundizar en nuestro conocimiento de los canales iónicos involucrados
en la inducción de la RA durante la fecundación. El único canal clonado es el SpHCN, localizado
principalmente en el flagelo del espermatozoide. Como se mencionó anteriormente, el [Ca2+]i fluctúa
espontáneamente y en respuesta al speract. Bloqueadores de canales de Ca2+ voltaje dependientes
(Cav) como el Ni2+ y la nimodipina alteran las fluctuaciones del [Ca2+]i inducidas por el speract.
Utilizando anticuerpos comerciales contra canales Cav y TRPs (transient receptor potential channel) de
mamífero encontramos que tanto la subunidas ï•¡ 1C de los Cav como el canal TRPC6, se localizan en el
flagelo del espermatozoide. Experimentos de Western Blot confirmaron estas observaciones. Por otra
parte, determinaciones de RT-PCR utilizando como templado cDNA obtenido a partir de mRNA de
testículo de S. purpuratus , revelaron la presencia de un fragmento 246 pb, cuya secuenciación
corresponde a un Cav tipo L. Además, inhibidores de los canales TRP´s modifican las fluctuaciones del
[Ca2+]i inducidas por speract, en espermatozoides individuales de S. purpuratus . ï€ La presencia de ï•¡
1C y TRPC6 en el flagelo, sugiere la participan de estos canales en la motilidad. En eucariontes se
expresan dos tipos de ACs, las transmembranales (ACstm) y la soluble (sAC). Las ACstms están unidas
a membrana, sus actividades se regulan por proteínas G y se estimulan con forskolina. La sAC, que se
clonó del testículo y está presente abundantemente en el espermatozoide, está asociada también a
varios organelos intracelulares como la mitocondria y el núcleo, y se estimula por Ca2+ y por
bicarbonato. El AMPc juega un papel importante en la fisiología del espermatozoide tanto en mamíferos
como en erizos de mar. Los niveles de AMPc aumentan considerablemente durante la RA, pero
desconocemos de qué manera están relacionados con dicha reacción. En este sistema la AC se regula