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helenawww.helena-biosciences.comBioSciencesEuropeInstructions For UseSAS-1 Pentavalent ScreenCat. No. (200301 + 200406)SAS-1 Dépistage PentavalentFiche techniqueRéf. (200301 + 200406)SAS-1 Pentavalent ScreenGebrauchsanweisungKat. Nr. (200301 + 200406)Screen pentavalente SAS-1Istruzioni per l’usoCod. N. (200301 + 200406)Cribado pentavalente SAS-1Instrucciones de usoNº Cat. (200301 + 200406)ContentsEnglish 1Français 7Deutsch 13Italiano 19Español 25

SAS-1 PENTAVALENT SCREENINTENDED PURPOSEThe SAS-1 Pentavalent Screen Kit is intended for the screening of serum and urine samples formonoclonal gammopathies, by agarose gel electrophoresis and immunofixation.Immunofixation electrophoresis (IFE) is a two stage procedure using high resolution agaroseelectrophoresis in the first stage, and immunoprecipitation in the second phase.The greatest demand for IFE is in the clinical laboratory, where it is used primarily for the detection ofmonoclonal gammopathies. A monoclonal gammopathy is a primary disease state in which a singleclone of plasma cells produce elevated levels of an immunoglobulin of a single class and type.Such immunoglobulins are referred to as monoclonal proteins, M-proteins or paraproteins.Their presence may be of a benign nature or of uncertain significance. In some cases, they areindicative of a malignancy, such as multiple myeloma or Waldenström's macroglobulinaemia.Differentiation must be made between polyclonal and monoclonal gammopathies, as polyclonalgammopathies are a secondary disease state due to clinical disorders such as chronic liver disease,collagen disorders, rheumatoid arthritis and chronic infection.Urinary proteins are derived primarily from plasma proteins that filter through the kidney.The appearance of abnormal plasma proteins in the urine is of great value in evaluating renal function.The appropriate study of proteinuria should include quantitative and qualitative assessment of the typeand amount of proteins excreted 1-5 .Alfonso first described immunofixation in the literature in 1964 6 . Alper and Johnson published a morepractical procedure in 1969, and published a number of studies utilising this technique 7-9 .Immunofixation has been used as a procedure for the investigation of immunoglobulins since 1976 10-11 .WARNINGS AND PRECAUTIONSAll reagents are for in-vitro diagnostic use only. Do not ingest or pipette by mouth any kit component.Wear gloves when handling all kit components. Refer to the product safety data sheet for risk andsafety phrases and disposal information.COMPOSITION200301:1. SAS-1 GelContains agarose in a Tris / Barbital buffer with thiomersal and sodium azide as preservative.The gel is ready for use as packaged.2. Acid Violet Stain ConcentrateNOT FOR USE WITH THE PENTAVALENT SCREEN KIT.3. Destain Solution ConcentrateContains concentrated Destain Solution. Dilute the contents of the bottle to 2 litres with purifiedwater. Store in a tightly stoppered bottle.4. Wash SolutionContains 100ml of concentrated Wash Solution. Dilute 20ml to 1 litre with saline solution.5. Sample DiluentContains Tris / Barbital buffer with bromophenol blue and sodium azide as preservative.The diluent is ready for use as packaged.1English

6. Other Kit ComponentsEach kit contains Instructions For Use (not for use with Pentavalent Screen) and sufficient BlottersC, D and Blotter Combs to complete 10 gels.200406:1. Acid Blue Stain ConcentrateContains concentrated Acid Blue stain. Dilute the contents of the bottle to 700ml with purifiedwater. Stir overnight and filter before use. Store in a tightly stoppered bottle.2. Other Kit ComponentsEach kit contains Instructions For Use.STORAGE AND SHELF-LIFE200301:1. SAS-1 IFE GelGels should be stored at 15...30°C and are stable until the expiry date indicated on the package.DO NOT REFRIGERATE OR FREEZE. Deterioration of the gel may be indicated by 1) crystallineappearance indicating the gel has been frozen, 2) cracking and peeling indicating drying of the gelor 3) visible contamination of the agarose from bacterial or fungal sources.2. Acid Violet StainNOT FOR USE WITH THE PENTAVALENT SCREEN KIT.3. Destain SolutionThe destain concentrate should be stored at 15...30°C and is stable until the expiry date indicatedon the label. Diluted destain solution is stable for 6 months at 15...30°C.4. Wash SolutionThe Wash Solution concentrate should be stored at 15...30°C and is stable until the expiry dateindicated on the label. Diluted wash solution is stable for 6 months at 15...30°C. Cloudiness mayindicate deterioration.5. Sample DiluentThe Sample Diluent should be stored at 15...30°C and is stable until the expiry date indicated onthe label. Cloudiness may indicate deterioration.200406:1. Acid Blue StainThe stain concentrate should be stored at 15...30°C and is stable until the expiry date indicated onthe label. Diluted stain solution is stable for 6 months at 15...30°C. It is recommended to discardused stain immediately to prevent depletion of staining capability. Poor staining performance mayindicate deterioration.ITEMS REQUIRED BUT NOT PROVIDEDCat. No. 210200 Sample Applicator Blades (1 x 10)Cat. No. 210300 Sample Applicator Blades (5 x 10)Cat. No. 321200 Pentavalent Antiserum (For urine and Serum samples) 3mLCat. No. 321300 Pentavalent Antiserum (For urine and Serum samples) 10 x 3mLCat. No. 210100 Disposable sample cups (100)Cat. No. 3100 REP Prep2

ii) SAS-3 users:Step Time (mm:ss) Temperature (°C) Voltage OtherLoad Sample 00:30 21 Speed 1Apply Sample 00:30 21 Speed 1*Electrophoresis 17:00 21 100Apply antisera 10:00 21Insert Combs 02:00 21Blotter D 05:00 40Dry 08:00 54* Use Location 2NOTE: For Serum Screen, 1 sample application is required. For Urine Screen, 10 sampleapplications are required. Remove the gel blocks prior to drying.8. Following electrophoresis, (SAS-1 Plus users: remove the cover), remove the electrodes from thesurface of the gel. (SAS-3 users: remove the alignment guide). Position the antiserum applicationtemplate onto the gel surface. NOTE: The milled antisera channels should be aligned centrallyover the printed box on the gel in which the samples are applied.9. Apply 60µL of Pentavalent Antiserum into each hole of the antiserum application template. Ensurethat the antisera has completely filled the channels.10. Incubate the gel.11. Following incubation, place a blotter comb into the holes of the antiserum template. Allow 2minutes for the excess antisera to be absorbed, then remove the blotter combs and the templatefrom the gel surface.12. Place a blotter D (smooth side down) onto the surface of the gel, leave for 10 seconds and remove.13. Place a blotter D (smooth side down) onto the surface of the gel and replace the antiserumtemplate to hold the blotter flat. Blot the gel. NOTE: Immediately after use, clean the antiseratemplate with a mild biocidal detergent.14. Remove the blotter D. SAS-3 users: Dry the gel, and start initial 3 second chamber wash onSAS-4 unit.15. Remove the gel blocks and attach the gel to the staining chamber holder, and complete the finalsteps on the SAS-2 or SAS-4.16. At the end of the staining cycle, remove the gel from the staining chamber. The gel is now readyfor examination.a) SAS-2 (Auto-Stainer)Step Solution Time (mm:ss) Port Temp (°C)Dry —- 10:00 55Wash Wash solution 07:00 4Stain Acid Blue Stain 03:00 6Destain Destain solution 02:00 2Dry —- 05:00 65Wash Wash solution 03:00 4Wash Wash solution 03:00 4Dry —- 05:00 654

SAS-1 PENTAVALENT SCREENb) SAS-4 (Auto-Stainer)Step Time (mm:ss) Temp (°C) OtherWash 00:03 Recirculate ONWash 10:00 Recirculate ONStain 04:00 Recirculate ONDestain 02:00 Recirculate ONDestain 02:00 Recirculate ONDry 12:00 63INTERPRETATION OF RESULTSThe majority of monoclonal proteins migrate in the cathodic, gamma region of the protein pattern, butdue to their abnormal nature, they may migrate anywhere within the globulin region on proteinelectrophoresis. The abnormal protein should now identified with a full IFE.When low concentrations of abnormal protein are present, the abnormal band may appear as a bandwithin the normal polyclonal immunoglobulin. A band can also be seen within a polyclonal backgroundwhen there is a large polyclonal immunoglobulin presence also.QUALITY CONTROLKemtrol Abnormal (Cat. No. 7025) will give a single monclonal band, within polyclonal background.LIMITATIONS1. Antigen Excess.Antigen excess will occur if there is not a slight antibody excess or antigen/antibody equivalence atthe site of precipitation. Antigen excess in IFE is usually due to an excess of the immunoglobulinin the patient sample. Antigen excess is characterised by prozoning (unstained areas in the centreof the immunofixed protein band, with staining around the edges). A higher dilution of the sampleshould be used in this event to optimise the immunoglobulin concentration.PERFORMANCE CHARACTERISTICSa) SensitivityUsing the urine method (10 applications), 10mg/L was determined as the lowest concentration ofprotein which was evident as a discrete band on the completed gel.b) LinearityLinearity is a function of densitometer specification as well as gel performance. It is recommendedthat each customer determine the linearity of the method based upon the densitometer in use inthe laboratory.5English

BIBLIOGRAPHY1. Fauchier, P. and Catalan, F. ‘Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis’ Alfred FournierInstitute, Paris, France, 1988.2. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. ‘Finding Clues to Disease in Urine’ DiagnosticMedicine, 1980 ; May/June : 69-75.3. Umbreit, A. and Wiedemann, G. ‘Determination of Urinary Protein Fractions. A ComparisonWith Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations’Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.4. Wiedemann, G. and Umbreit, A.‘Determination of Urinary Protein Fractions by Different Electrophoretic Methods’, Clin. Lab.;1999, 45 : 257-262.5. Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S. ‘AComparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria’ Ann. Clin.Biochem., 1997, 34 : 371-374.6. Alfonso, E., ‘Quantitation Immunoelectrophoresis of Serum Proteins’, Clin. Chim. Acta., 1964;10 : 114-122.7. Alper, C.A and Johnson, A.M., ‘Immunofixation Electrophoresis: A Technique for the Study ofProtein Polymorphism’, Vox. Sang., 1969; 17 : 445-452.8. Alper, C.A.,’Genetic Polymorphism of Complement Components as a Probe of Structure andFunction’, Progress in Immunology. First International Congress of Immunology. 1971 : 609-624,Academic Press, New York.9. Johnson, A.M., ‘Genetic Typing of Alpha(1)-Antitrypsin in Immunofixation Electrophoresis.Identification of Subtypes of Pi M.’, J. Lab. Clin. Med., 1976; 87 : 152-163.10. Cawley, L.P., Minard, B.J, Tourtellotte, W.W., Ma, B.I. and Chelle, C., ‘ImmunofixationElectrophoretic Technique Applied to Identification of Proteins in Serum and Cerebrospinal Fluid’,Clin. Chem., 1976; 22 : 1262-1268.11. Ritchie, R.F and Smith, R. ‘Immunofixation III, Application to the Study of Monoclonal Proteins’,Clin. Chem., 1976; 22 : 1982-1985.6

SAS-1 DÉPISTAGE PENTAVALENTUTILISATIONLe kit SAS-1 Dépistage Pentavalent est utilisé pour le dépistage des gammapathies monoclonales àpartir d'échantillons de sérum et d'urine, moyennant électrophorèse sur gel d'agarose puisimmunofixation.L'immunofixation (IFE) est une procédure en deux étapes utilisant l'électrophorèse haute résolution surgel d'agarose dans en premier temps puis l'immunoprécipitation dans un deuxième temps.C'est en biologie médicale que l'on utilise le plus fréquemment l'IFE pour la détection desgammapathies monoclonales. Une gammapathie monoclonale est une maladie idiopathique danslaquelle un seul clone de cellule plasmatique produit en quantité élevée une immunoglobuline d'uneseule classe et d'un seul type.Ces immunoglobulines sont appelées protéines monoclonales, protéines-M ou paraprotéines. Leurprésence peut être bénigne ou de signification incertaine. Dans certains cas, elles révèlent unemalignité comme les myélomes multiples ou la macroglobulinémie de Waldenström. Il faut faire unedifférence entre les gammapathies polyclonales et les gammapathies monoclonales, car lesgammapathies polyclonales sont des pathologies occasionnées par certains troubles cliniques, commeles maladies hépatiques chroniques, l'altération du collagène, la polyarthrite rhumatoïde et lesinfections chroniques.Les protéines urinaires proviennent principalement de la filtration des protéines plasmatiques par lerein. L'apparition de protéines plasmatiques anormales dans l'urine est un élément important dansl'évaluation de la fonction rénale. L'étude d'une protéinurie doit inclure l'évaluation qualitative etquantitative du type et de la quantité de protéines excrétées [1-5].Alfonso a été le premier à décrire l'immunofixation dans la littérature en 1964 [6]. Alper et Johnson ontpublié une procédure plus simple en 1969, puis de nombreuses études utilisant cette technique [7-9].L'immunofixation est utilisée comme procédure pour l'étude des immunoglobulines depuis 1976 [10-11].AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONSTous les réactifs sont à usage diagnostique in vitro uniquement. Ne pas ingérer ou pipeter à la boucheaucun composant. Porter des gants pour la manipulation de tous les composants du kit. Se reporteraux fiches de sécurité des composants du kit pour la manipulation et l'élimination.COMPOSITION200301:1. Plaque SAS-1Contient de l'agarose dans un tampon Tris-barbital additionné de thimérosal et d'azide de sodiumcomme conservateurs. Le gel est prêt à l'emploi.2. Colorant violet acide concentréNE PAS UTILISER AVEC LE KIT DE DÉPISTAGE PENTAVALENT.3. Solution décolorante concentréeContient la solution décolorante concentrée. Diluer le contenu du flacon avec de l'eau distilléepour obtenir 2 litres de solution. Conserver en bouteille hermétiquement fermée.7Français

4. Solution de lavageContient 100 ml de solution de lavage concentrée. Diluer 20 ml de concentré avec de la solutionphysiologique pour obtenir 1 litre de solution de lavage.5. Diluant échantillonContient un tampon Tris-barbital additionné de bleu de bromophénol et d'azide de sodium commeconservateurs. Le diluant est prêt à l'emploi.6. Autres composants du kitChaque kit contient également une fiche technique (à ne pas utiliser avec le dépistage Pentavalent),des buvards C, D et des peignes pour 10 gels.200406:1. Colorant bleu acide concentréContient du colorant bleu acide concentré. Diluer le contenu du flacon avec de l'eau distillée pourobtenir 700 ml de colorant, laisser sous agitation toute une nuit. Filtrer avant utilisation.Conserver en bouteille hermétiquement fermée.2. Autres composants du kitChaque kit contient une fiche technique.STOCKAGE ET CONSERVATION200301:1. Plaque SAS-1 IFELes gels doivent être conservés entre 15 et 30 °C ; ils sont stables jusqu'à la date de péremptionindiquée sur l'emballage. NE PAS RÉFRIGÉRER OU CONGELER. Les conditions suivantesindiquent une détérioration du gel : 1) des cristaux visibles indiquant que le gel a été congelé, 2)des craquelures indiquant une déshydratation du gel, 3) une contamination visible, bactérienne oufongique.2. Colorant violet acideNE PAS UTILISER AVEC LE KIT DE DÉPISTAGE PENTAVALENT.3. Solution décoloranteLe décolorant concentré doit être conservé entre 15 et 30 °C ; il est stable jusqu'à la date depéremption indiquée sur l'étiquette. Après reconstitution, la solution décolorante est stable 6 moisentre 15 et 30 °C.4. Solution de lavageLa solution de lavage concentrée doit être conservée entre 15 et 30 °C ; elle est stable jusqu'à ladate de péremption indiquée sur l'étiquette. Une fois reconstituée, elle est stable 6 mois entre 15et 30 °C. Un aspect floconneux indique une détérioration du produit.5. Diluant échantillonLe diluant échantillon doit être conservé entre 15 et 30 °C ; il est stable jusqu'à la date depéremption indiquée sur l'étiquette. Un aspect floconneux indique une détérioration du produit.200406:1. Colorant bleu acideLe colorant concentré doit être conservé entre 15 et 30 °C ; il est stable jusqu'à la date depéremption indiquée sur l'étiquette. Une fois reconstitué, il est stable 6 mois entre 15 et 30 °C. Ilest recommandé de jeter le colorant utilisé afin d'éviter que la capacité de coloration ne diminue.Si les performances de coloration diminuent, cela indique une détérioration de la solutioncolorante.8

ii) SAS-3 :Étape Durée (mm:ss) Température (°C) Tension AutreCharger échantillon 00:30 21 Vitesse 1Déposer échantillon 00:30 21 Vitesse 1*Électrophorèse 17:00 21 100Déposer antisérum 10:00 21Insérer peignes 02:00 21Buvard D 05:00 40Sécher 08:00 54* Utiliser Emplacement 2 (Loc 2)REMARQUE : Pour les échantillons de sérum, il est nécessaire de réaliser 1 dépôt. Pour leséchantillons d'urine, il est nécessaire de réaliser 10 dépôts. Enlever les ponts d'agarose avant deprocéder au séchage.8. Une fois la migration terminée, (SAS-1 Plus : enlever le couvercle), enlever les électrodes de lasurface du gel. (SAS-3 : Enlever le guide d'alignement). Placer le masque applicateur antisérum surla surface du gel. REMARQUE : Les cases antisérums du masque doivent s'aligner sur le centre dela case imprimée du gel sur lequel les échantillons sont déposés.9. Pipeter 60 µl d'antisérum anti-pentavalent dans chacune des cases du masque applicateur. Vérifierque l'antisérum remplit complètement les cases.10. Incuber le gel.11. Une fois l'incubation terminée, placer un peigne sur les orifices du masque applicateur. Attendre2 minutes que l'antisérum en excès soit absorbé puis retirer les peignes et le masque de la surfacedu gel.12. Placer un buvard D (côté lisse vers la bas) sur la surface du gel, attendre 10 secondes puis l'enlever.13. Placer un buvard D (côté lisse vers le bas) sur la surface du gel et replacer le masque antisérumssur le buvard afin de bien le maintenir à plat. Sécher le gel à l'aide du buvard. REMARQUE :Immédiatement après utilisation, nettoyer le masque applicateur antisérums avec une solutiondétergente douce et biocide.14. Enlever le buvard D. SAS-3 : Sécher le gel puis démarrer un lavage initial de 3 secondes dans lemodule SAS-4.15. Enlever les ponts d'agarose, fixer le gel sur le support de la chambre de coloration puis terminerles étapes finales dans le SAS-2 ou le SAS-4.16. Une fois le cycle de coloration terminé, enlever le gel de la chambre de coloration. Le gel est alorsprêt pour être examiné.a) SAS-2 (module de coloration)Étape Solution Durée (mm:ss) Orifice Température (°C)Sécher -- 10:00 55Laver Solution de lavage 07:00 4Colorer Colorant bleu acide 03:00 6Décolorer Solution décolorante 02:00 2Sécher -- 05:00 65Laver Solution de lavage 03:00 4Laver Solution de lavage 03:00 4Sécher -- 05:00 6510

SAS-1 DÉPISTAGE PENTAVALENTb) SAS-4 (module de coloration)Étape Durée (mm:ss) Température (°C) AutreLaver 00:03 Recycler ONLaver 10:00 Recycler ONColorer 04:00 Recycler ONDécolorer 02:00 Recycler ONDécolorer 02:00 Recycler ONSécher 12:00 63INTERPRÉTATION DES RÉSULTATSLa plupart des protéines monoclonales migrent du côté cathodique, c'est-à-dire dans la zone gammadu protéinogramme, mais, en raison de leur caractère anormal, il est possible qu'elles migrent ailleursdans la zone des globulines. Les protéines anormales doivent alors être identifiées avec uneimmunofixation complète.Lorsque la concentration en protéines anormales présentes est faible, il est possible que la bandeanormale apparaisse dans la zone de l'immunoglobuline polyclonale normale. Il est aussi possible dedétecter une bande dans la zone polyclonale lorsqu'une grande quantité d'immunoglobuline polyclonaleest présente.CONTRÔLE QUALITÉLe contrôle Kemtrol anormal (réf. 7025) donne une bande monoclonale unique, située à l'intérieur dela bande polyclonale.LIMITES1. Excès d'antigènesOn parle d'excès d'antigènes lorsqu'il n'y a ni un léger excès d'anticorps ni une équivalenceantigènes/anticorps sur le lieu de précipitation. L'excès d'antigènes en IFE est en général dû à unexcès d'immunoglobuline dans l'échantillon du patient. Il se caractérise par un phénomène de zone(zones non colorées dans le centre de la bande de la protéine immunoprécipitée, avec unecoloration du contour). Il faut utiliser un échantillon plus dilué dans ce cas afin d'optimiser laconcentration en immunoglobuline.PERFORMANCES DU DOSAGEa) SensibilitéLa sensibilité, établie en utilisant des échantillons d'urine (10 dépôts), est de 10 mg/l, concentrationla plus faible en protéines permettant la visualisation d'une fine bande une fois le gel terminé.b) LinéaritéLa linéarité est fonction du densitomètre ainsi que des performances du gel. Il est recommandé àchaque laboratoire de déterminer la linéarité de la méthode en fonction du densitomètre utilisé.11Français

BIBLIOGRAPHIE1. Fauchier, P. et Catalan, F. 'Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis' Alfred Fournier Institute,Paris, France, 1988.2. Killingsworth, L. M., Cooney, S. K. et Tyllia, M. M. 'Finding Clues to Disease in Urine' DiagnosticMedicine, 1980 ; mai/juin : 69-75.3. Umbreit, A. et Wiedemann, G. 'Determination of Urinary Protein Fractions. A Comparison WithDifferent Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations' Clin.Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.4. Wiedemann, G. et Umbreit, A. 'Determination of Urinary Protein Fractions by DifferentElectrophoretic Methods', Clin. Lab. ; 1999, 45 : 257-262.5. Wong, W. K., Wieringa, G. E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. et Lockhart, S. 'AComparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria' Ann. Clin.Biochem., 1997, 34 : 371-374.6. Alfonso, E., 'Quantitation Immunoelectrophoresis of Serum Proteins', Clin. Chim. Acta., 1964 ; 10: 114-122.7. Alper, C. A et Johnson, A. M., 'Immunofixation Electrophoresis: A Technique for the Study ofProtein Polymorphism', Vox. Sang., 1969 ; 17 : 445-452.8. Alper, C. A. 'Genetic Polymorphism of Complement Components as a Probe of Structure andFunction', Progress in Immunology. First International Congress of Immunology. 1971 : 609-624,Academic Press, New York.9. Johnson, A. M., 'Genetic Typing of Alpha(1)-Antitrypsin in Immunofixation Electrophoresis.Identification of Subtypes of Pi M.', J. Lab. Clin. Med., 1976; 87 : 152-163.10. Cawley, L. P., Minard, B. J, Tourtellotte, W. W., Ma, B. I. et Chelle, C., 'ImmunofixationElectrophoretic Technique Applied to Identification of Proteins in Serum and Cerebrospinal Fluid',Clin. Chem., 1976; 22 : 1262-1268.11. Ritchie, R. F et Smith, R. 'Immunofixation III, Application to the Study of Monoclonal Proteins', Clin.Chem., 1976 ; 22 : 1982-1985.12

SAS-1 PENTAVALENT SCREENANWENDUNGSBEREICHDas SAS-1 Pentavalent Screen-Kit ist zum Screening von Serum- und Urinproben auf monoklonaleGammopathien durch Elektrophorese im Agarose-Gel und Immunfixation bestimmt.Die Immunfixationselektrophorese (IFE) läuft in zwei Phasen ab. Die erste Phase besteht aus einerAgarose-Elektrophorese in hoher Auflösung, gefolgt von der Immunpräzipitation in der zweiten Phase.Der größte Bedarf für eine IFE liegt im klinischen Laborbereich, hier vor allem in der Diagnosemonoklonaler Gammopathien. Bei einer monoklonalen Gammopathie handelt es sich um einePrimärerkrankung, in der ein einzelner Plasmazellklon vermehrt erhöhte Mengen von Immunglobulineiner einzelnen Klasse und eines einzelnen Typs produziert.Solche Immunglobuline werden als monoklonale Proteine, M-Proteine oder Paraproteine bezeichnet.Ihre Anwesenheit kann harmlos oder von unspezifischer Bedeutung sein. In manchen Fällen ist ihrNachweis ein Hinweis auf das Vorliegen einer malignen Erkrankung, wie dem multiplen Myelom oderMorbus Waldenström. Man muss zwischen polyklonalen und monoklonalen Gammopathienunterscheiden. Polyklonale Gammopathien sind sekundäre Erkrankungszustände, die durch chronischeLebererkrankungen, Kollagenosen, rheumatoide Arthritis und chronische Infektionen hervorgerufenwerden.Proteine im Urin stammen hauptsächlich von durch die Niere gefilterten Plasmaproteinen ab.Das Vorkommen abnormaler Plasmaproteine im Urin ist bei der Beurteilung der Nierenfunktion vongroßer Bedeutung. Die richtige Studie der Proteinurie sollte quantitative und qualitativeUntersuchungen von Typ und Menge der ausgeschiedenen Proteine umfassen 1-5 .1964 beschrieb Alfonso zum ersten Mal die Immunfixation in der Literatur 6 . Alper und Johnsonveröffentlichten 1969 eine etwas praktischer Vorgehensweise und veröffentlichten auch eine Anzahlvon Studien, in denen diese Technik angewendet wurde 7-9 . Die Immunfixation wird als Methode seit1976 zur Untersuchung von Immunglobulinen verwendet 10-11 .WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMENAlle Reagenzien sind nur zur in-vitro Diagnostik bestimmt. Nicht einnehmen oder mit dem Mundpipettieren. Beim Umgang mit den Kit-Komponenten Handschuhe tragen. Siehe Sicherheitsdatenblattbezüglich der R- und S-Sätze sowie Informationen zur Entsorgung.INHALT200301:1. SAS-1 GelEnthält Agarose in einem Tris / Barbitalpuffer mit Thiomersal und Natriumazid alsKonservierungsmittel. Das Gel ist gebrauchsfertig verpackt.2. "Saures-Violett" FarbstoffkonzentratNICHT ZUR VERWENDUNG MIT DEM PENTAVALENT SCREEN-KIT.3. Entfärbelösung-KonzentratEnthält konzentrierte Entfärbelösung. Den Inhalt der Flasche mit dest. Wasser auf 2 Literverdünnen. In einer fest verschlossenen Flasche aufbewahren.4. WaschlösungEnthält 100 ml konzentrierte Waschlösung. 20 ml mit 1 Liter Kochsalzlösung verdünnen.13Deutsch

5. Proben-VerdünnungspufferEnthält Tris-Barbital-Puffer mit Bromphenolblau und Natriumazid als Konservierungsmittel. DerVerdünnungspuffer ist gebrauchsfertig verpackt.6. Weitere Kit-KomponentenJeder Kit enthält eine Methodenbeschreibung (nicht mit den Pentavalent Screen verwenden) sowieausreichend Blotter C, D und Blotterkämme für 10 Gele.200406:1. "Saures-Blau" FarbstoffkonzentratEnthält konzentrierte "Saures-Blau" Farbstofflösung. Den Inhalt der Flasche mit dest. Wasser auf700 ml verdünnen. Über Nacht rühren und vor Gebrauch filtrieren. In einer fest verschlossenenFlasche aufbewahren.2. Weitere Kit-KomponentenJedes Kit enthält eine Gebrauchsanweisung.LAGERUNG UND STABILITÄT200301:1. SAS-1 IFE-GelGele sollten bei 15 bis 30 °C gelagert werden und sind bis zum aufgedruckten Verfallsdatum stabil.NICHT IM KÜHLSCHRANK ODER TIEFKÜHLSCHRANK AUFBEWAHREN! Der Zustand desGels kann sich verschlechtern. Dafür gibt es folgende Merkmale: 1) Kristallisation weist aufvorangegangenes Einfrieren hin, 2) Risse und Ablösen weisen auf ein Austrocknen des Gels hin,und 3) sichtbare Kontamination der Agarose durch Bakterien oder Pilze.2. "Saures-Violett" FarbstoffNICHT ZUR VERWENDUNG MIT DEM PENTAVALENT SCREEN-KIT.3. EntfärbelösungDas Entfärbekonzentrat sollte bei 15 bis 30 °C gelagert werden und ist bis zum aufgedrucktenVerfallsdatum stabil. Verdünnte Entfärbelösung ist bei einer Temperatur von 15 bis 30°C für 6Monate stabil.4. WaschlösungDie Waschlösung sollte bei 15 bis 30 °C gelagert werden und ist bis zum aufgedrucktenVerfallsdatum stabil. Verdünnte Waschlösung ist bei einer Temperatur von 15 bis 30 °C für 6Monate stabil. Trübung kann auf den Verfall hinweisen.5. Proben-VerdünnungspufferDer Proben-Verdünnungspuffer ist bei 15 bis 30 °C gelagert bis zum aufgedruckten Verfallsdatumstabil. Trübung kann auf Verfall hinweisen.200406:1. "Saures-Blau" FarbstoffDas Farbstoffkonzentrat sollte bei 15 bis 30 °C gelagert werden und ist bis zum aufgedrucktenVerfallsdatum stabil. Die verdünnte Farbstofflösung ist bei einer Temperatur von 15 bis 30 °C für6 Monate stabil. Es wird empfohlen, benutzten Farbstoff sofort zu entsorgen, um eine Minderungder Färbeleistung zu verhindern. Schlechte Färbeleistung kann auf Verfall hinweisen.14

SAS-1 PENTAVALENT SCREENNICHT MITGELIEFERTES, ABER BENÖTIGTES MATERIALKat. Nr. 210200 Probenapplikatorkämme (1 x 10)Kat. Nr. 210300 Probenapplikatorkämme (5 x 10)Kat. Nr. 321200 Pentavalent Antiserum (für Urin- und Serumproben) 3 mlKat. Nr. 321300 Pentavalent Antiserum (für Urin- und Serumproben) 10 x 3 mlKat. Nr. 210100 Einweg-Probengefäße (100)Kat. Nr. 3100 REP-Prep-LösungPROBENENTNAHME UND VORBEREITUNGFrisch entnommene Serum- oder Urinprobe ist das Untersuchungsmaterial der Wahl. Für einStandard-5-Bandenmuster6 können Serumproben bei 15 bis 30 °C bis zu 4 Tage, bei 2 bis 6 °C bis zu2 Wochen, oder bei -20 °C 6 Monate gelagert werden. Die Beta-2-Globulinbande (Komplement C3)degeneriert allerdings bei Lagerung sehr schnell. Die Urinproben können im Kühlschrank bei 2 bis6 °C bis zu 72 Stunden oder 2 Wochen bei -20 °C aufbewahrt werden. Urinproben zunächstunkonzentriert und unverdünnt verwenden, außer das Gesamtprotein ist bekannterweise über 1000mg/l.SCHRITT-FÜR-SCHRITT METHODE1. Urin: 35 µl Probe in die entsprechenden Einweg-Probengefäße pipettieren. Proben vorVerdunstung schützen.SERUM: Jede Probe mit dem IFE-Verdünnungspuffer 1+2 verdünnen. 35 µl der verdünntenProbe in die entsprechenden Einweg-Probengefäße pipettieren. Proben vor Verdunstungschützen.2. Elektrophoreseeinheit einschalten und:i) SAS-1 Plus Benutzer: Die Probenplatte vorsichtig auf den Applikatoreinschub stellen. Daraufachten, dass die Platte in Position fest eingerastet ist.ii) SAS-3 Benutzer: Mit den Haltestiften der Probenbasis die Probenplatte vorsichtig einrichten.Sicherstellen, dass die Platte richtig eingesetzt ist.3. Das Gel aus der Verpackung nehmen und:i) SAS-1 Plus Benutzer: 400 µL REP-Prep-Lösung auf die Kühlplatte verteilen. Das Gel mit derAgaroseseite nach oben auf die Kühlplatte legen, positive und negative Seite an den passendenElektrodenhaltern ausrichten. Darauf achten, dass unter dem Gel keine Luftblasen sind.ii) SAS-3 Benutzer: Die Führungsschiene auf die Stifte setzen und 400 µl REP Prep auf dieKammermitte verteilen. Das Gel mit der Agaroseseite nach oben in die Kammer legen und mitHilfe der Schiene die positive und negative Seite an den entsprechenden Elektrodenhalternausrichten. Darauf achten, dass unter dem Gel keine Luftblasen sind.4. Die Geloberfläche mit einem Blotter C blotten und Blotter verwerfen.5. i) SAS-1 Plus Benutzer: Die Abdeckung über Gel und Elektroden geben und für einen gutenKontakt 5 Sekunden lang fest aufdrücken.ii) SAS-3 Benutzer: Die Elektroden auf den Elektrodenhaltern befestigen, damit sie mit denGelblöcken in Kontakt stehen.6. 2 Applikatorkamm-Halterungen in Position auf dem Gerät anbringen, (SAS-3 Benutzer: Schlitz Aund 10).7. Die Pentavalent Screen Elektrophorese durchführen:i) SAS-1 Plus Benutzer: Elektrophorese: 100 Volt, 18 Min., 20°CInkubationsschritt 1: 8 Min, 37°C (inkubieren)Inkubationsschritt 2: 8 Min., 40°C (D-Blot)15Deutsch

Bitte beachten: Zum Serum-Screen ist 1 Probenauftrag erforderlich. Zum Urin-Screen sind 10Probenaufträge erforderlich.ii) SAS-3 Benutzer:Schritt Dauer (mm:ss) Temperatur (°C) Spannung AnderesProbenaufnahme 00:30 21 Geschwindigkeit 1Probenapplikation 00:30 21 Geschwindigkeit 1 *Elektrophorese 17:00 21 100Antiseren auftragen 10:00 21Kämme einführen 02:00 21Blotter D 05:00 40Trocknen 08:00 54* Platz 2 verwenden.Bitte beachten: Zum Serum-Screen ist 1 Probenauftrag erforderlich. Zum Urin-Screen sind 10Probenaufträge erforderlich. Die Gel-Blöcke vor dem Trocknen entfernen.8. Nach der Elektrophorese, (SAS-1 Plus Benutzer: Abdeckung entfernen), die Elektroden von derGeloberfläche entfernen. (SAS-3 Benutzer: Die Führungsschiene entfernen). Schablone zumAuftragen des Antiserums auf die Geloberfläche positionieren. Bitte beachten: Die gestanztenRinnen für das Antiserum sollten zentriert über dem beschrifteten Rahmen auf dem Gelausgerichtet werden, in der die Proben aufgetragen werden.9. 60 µl Pentavalent-Antiserum in jede Vertiefung der Antiserum-Auftragsschablone geben.Sicherstellen, dass die Spuren vollständig mit Antiserum gefüllt sind.10. Gel inkubieren.11. Nach der Inkubation einen Blotterkamm in die Öffnungen der Antiserum-Schablone stecken. Dasüberschüssige Antiserum 2 Minuten lang aufsaugen lassen, dann den Blotterkamm und dieSchablone von der Geloberfläche entfernen.12. Einen Blotter D (mit der glatten Seite nach unten) auf die Geloberfläche legen, nach 10 Sekundenentfernen.13. Blotter D mit der glatten Seite nach unten auf die Geloberfläche legen und zum Flachhalten desBlotters die Antiserum-Schablone wieder auflegen. Gel blotten. Bitte beachten: Sofort nachGebrauch die Antiserum-Schablone mit einem milden, bioziden Reinigungsmittel säubern.14. Blotter D entfernen. SAS-3 Benutzer: Gel trocknen und erstes 3-Sekunden Kammerwaschenstarten auf SAS-4-Gerät.15. Die Gelblöcke entfernen und das Gel an der Halterung der Färbekammer befestigen. Die letztenSchritte auf dem SAS-2 oder SAS-4 beenden.16. Am Ende des Färbevorgangs das Gel aus der Färbekammer nehmen. Das Gel kann nunausgewertet werden.a) SAS-2 (Auto-Stainer)Schritt Lösung Dauer (mm:ss) Anschluss Temp. (°C)Trocknen -- 10:00 55Waschen Waschlösung 07:00 4Färben "Saures-Blau" Farbstoff 03:00 6Entfärben Entfärbelösung 02:00 2Trocknen -- 05:00 65Waschen Waschlösung 03:00 4Waschen Waschlösung 03:00 4Trocknen -- 05:00 6516

SAS-1 PENTAVALENT SCREENb) SAS-4 (Auto-Stainer)Schritt Dauer (mm:ss) Temp. (°C) AnderesWaschen 00:03 Umlauf EINWaschen 10:00 Umlauf EINFärben 04:00 Umlauf EINEntfärben 02:00 Umlauf EINEntfärben 02:00 Umlauf EINTrocknen 12:00 63AUSWERTUNG DER ERGEBNISSEDie Mehrzahl der monoklonalen Proteine wandern in den katodischen Gammabereich desProteinmusters, können aber aufgrund ihrer pathologischen Beschaffenheit bei der Protein-Elektrophorese überall innerhalb des Globulinbereichs hin wandern. Das abnormale Protein sollte nunmit einem vollständigen IFE identifiziert werden.Sind niedrige Konzentrationen pathologischen Proteins vorhanden, kann diese pathologische Bandeinnerhalb des normalen polyklonalen Immunglobulins auftreten. Auch bei großer polyklonalerImmunglobulinpräsenz kann eine Bande auch innerhalb eines polyklonalen Hintergrunds erkanntwerden.QUALITÄTSKONTROLLEKemtrol Abnormal (Kat. Nr. 7025) ergibt eine einzige monoklonale Bande innerhalb eines polyklonalenHintergrunds.EINSCHRÄNKUNGEN1. AntigenüberschussAntigenüberschuss tritt auf, wenn am Präzipitationsort kein leichter Antikörperüberschuss oderAntigen-/Antikörperäquivalenz vorhanden ist. Antigenüberschuss bei der IFE liegtgewöhnlicherweise an einem Überschuss an Immunglobulin in der Patientenprobe.Antigenüberschuss wird durch das Prozonenphänomen (ungefärbte Bereiche in der Mitte derimmunfixierten Proteinbande mit einer Färbung im Kantenbereich) charakterisiert. In diesem Fallsollte zur Optimierung der Immunglobulinkonzentration die Probe höher verdünnt werden.LEISTUNGSEIGENSCHAFTENa) EmpfindlichkeitMit der Urinmethode (10 Applikationen) wurde 10mg/l als niedrigste Proteinkonzentrationermittelt, die als diskrete Bande auf dem fertigen Gel zu erkennen war.b) LinearitätDie Linearität ist abhängig von der Densitometer-Spezifikation sowie der Leistung des Gels. Eswird jedem Kunden empfohlen, die Linearität der Methode mit dem im Labor verwendetenDensitometer selbst zu bestimmen.17Deutsch

LITERATUR1. Fauchier, P. and Catalan, F. 'Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis' Alfred FournierInstitute, Paris, France, 1988.2. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. 'Finding Clues to Disease in Urine' DiagnosticMedicine, 1980 ; May/June : 69-75.3. Umbreit, A. and Wiedemann, G. 'Determination of Urinary Protein Fractions. A ComparisonWith Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations'Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.4. Wiedemann, G. and Umbreit, A. 'Determination of Urinary Protein Fractions by DifferentElectrophoretic Methods', Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.5. Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S. 'AComparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria' Ann. Clin.Biochem., 1997, 34 : 371-374.6. Alfonso, E., 'Quantitation Immunoelectrophoresis of Serum Proteins', Clin. Chim. Acta., 1964; 10: 114-122.7. Alper, C.A and Johnson, A.M., 'Immunofixation Electrophoresis: A Technique for the Study ofProtein Polymorphism', Vox. Sang., 1969; 17 : 445-452.8. Alper, C.A.,'Genetic Polymorphism of Complement Components as a Probe of Structure andFunction', Progress in Immunology. First International Congress of Immunology. 1971 : 609-624,Academic Press, New York.9. Johnson, A.M., 'Genetic Typing of Alpha(1)-Antitrypsin in Immunofixation Electrophoresis.Identification of Subtypes of Pi M.', J. Lab. Clin. Med., 1976; 87 : 152-163.10. Cawley, L.P., Minard, B.J, Tourtellotte, W.W., Ma, B.I. and Chelle, C., 'ImmunofixationElectrophoretic Technique Applied to Identification of Proteins in Serum and Cerebrospinal Fluid',Clin. Chem., 1976; 22 : 1262-1268.11. Ritchie, R.F and Smith, R. 'Immunofixation III, Application to the Study of Monoclonal Proteins',Clin. Chem., 1976; 22 : 1982-1985.18

SCREEN PENTAVALENTE SAS-1SCOPO PREVISTOIl kit Screen pentavalente SAS-1 è stato formulato per lo screening di campioni di siero e urina pergammopatie monoclonali mediante elettroforesi su gel di agarosio e immunofissazione.L'immunofissazione (IFE) è una procedura che avviene in 2 passaggi: inizialmente viene eseguitaun'elettroforesi ad alta risoluzione, successivamente avviene l'immunoprecipitazione.La maggior parte delle richieste di IFE è nei laboratori clinici, dove viene impiegata essenzialmente perla determinazione delle gammopatie monoclonali. La gammopatia monoclonale è una malattia in cui unsingolo clone di cellule plasmatiche produce elevati livelli di immunoglobuline di una singola classe etipo.Queste immunoglobuline vengono denominate proteine monoclonali, proteine M o paraproteine.La loro presenza può essere di natura benigna oppure di dubbio significato. In alcuni casi sono indicativedi tumori maligni come mielomi multipli o la macroglobulinemia di Waldenström. Bisogna differenziarele gammopatie policlonali da quelle monoclonali. Le gammopatie policlonali sono il secondo stato dimalattie dovute a disturbi clinici quali l'epatopatia cronica, disordini del collagene, artrite reumatoide einfezioni croniche.Le proteine presenti nell'urina derivano principalmente dalle proteine plasmatiche filtrate dal rene.La comparsa di proteine del plasma anomale nell'urina è estremamente importante per la valutazionedella funzionalità renale. Un accurato esame della proteinuria deve comprendere una valutazionequantitativa e qualitativa del tipo e della quantità di proteine escrete [1-5].Il primo a descrivere l'immunofissazione in letteratura nel 1964 [6] fu Alfonso. Nel 1969, Alper eJohnson divulgarono una procedura più pratica e pubblicarono svariati studi che adottavano questatecnica [7-9]. A partire dal 1976 [10-11], l'immunofissazione è stata impiegata come procedura per lostudio delle immunoglobuline.AVVERTENZE E PRECAUZIONITutti i reagenti sono destinati esclusivamente alla diagnostica in vitro. Non ingerire né pipettare con labocca i componenti del kit. Indossare i guanti quando si maneggiano tutti i componenti del kit. Per leindicazioni relative alle frasi di rischio e di sicurezza e per le informazioni sullo smaltimento, fareriferimento alla scheda tecnica del prodotto.COMPOSIZIONE200301:1. Gel SAS-1Contiene agarosio in tampone Tris / Barbital con tiomersal e sodio azide come conservante. Il gelè pronto per l'uso.2. Colorante acido viola concentratoDA NON UTILIZZARE CON IL KIT SCREEN PENTAVALENTE.3. Soluzione decolorante concentrataContiene soluzione decolorante concentrata. Diluire l'intero flacone a 2 litri con acqua distillata.Conservare in una bottiglia chiusa ermeticamente.4. Soluzione di lavaggioContiene 100 ml di soluzione di lavaggio concentrata. Diluire 20 ml a 1 litro con soluzione salina.19Italiano

5. Diluente per campioniContiene tampone Tris / Barbital con blu di bromofenolo e sodio azide come conservante. Ildiluente viene fornito in confezione pronta per l'uso.6. Altri componenti del kitOgni kit contiene le istruzioni per l'uso (da non utilizzare con lo screen pentavalente) e una quantitàdi blotter C, D e pettini blotter sufficiente per 10 gel.200406:1. Colorante concentrato acido bluContiene colorante concentrato Acido Blu. Diluire l'intero contenuto del flacone a 700 ml conacqua distillata. Agitare per tutta la notte e filtrare prima dell'uso. Conservare in una bottigliachiusa ermeticamente.2. Altri componenti del kitOgni kit contiene le istruzioni per l'uso.CONSERVAZIONE E STABILITA’200301:1. Gel SAS-1 IFEI gel devono essere conservati ad una temperatura compresa tra 15 e 30°C e sono stabili fino alladata di scadenza riportata sulla confezione. NON REFRIGERARE NÉ CONGELARE. Ildeterioramento del gel può essere indicato da 1) formazioni cristalline ad indicare che il gel è statocongelato, 2) screpolature e fessurazioni ad indicare che il gel è stato essiccato oppure 3)contaminazione visibile dell'agarosio causata da batteri o funghi.2. Colorante acido violaDA NON UTILIZZARE CON IL KIT SCREEN PENTAVALENTE.3. Soluzione decoloranteLa soluzione decolorante concentrata deve essere conservata ad una temperatura compresa tra 15e 30°C ed è stabile fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. La soluzione decolorante diluitaè stabile per 6 mesi ad una temperatura di 15 - 30°C.4. Soluzione di lavaggioLa soluzione di lavaggio concentrata deve essere conservata ad una temperatura compresa tra 15e 30°C ed è stabile fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. La soluzione di lavaggio diluitaè stabile per 6 mesi ad una temperatura di 15 - 30°C. La presenza di torbidezza può indicaredeterioramento.5. Diluente per campioni:Il diluente per campioni deve essere conservato ad una temperatura compresa tra 15 e 30°C ed èstabile fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. La presenza di torbidezza può indicaredeterioramento.200406:1. Colorante Acido BluIl colorante concentrato deve essere conservato ad una temperatura compresa tra 15 e 30°C edè stabile fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. La soluzione colorante diluita è stabile per6 mesi ad una temperatura di 15 - 30°C. Si raccomanda di gettare immediatamente il coloranteutilizzato onde evitare la riduzione della capacità colorante. Risultati insoddisfacenti dellacolorazione possono indicare un deterioramento.20

SCREEN PENTAVALENTE SAS-1MATERIALI NECESSARI MA NON IN DOTAZIONECod. N. 210200 Lamelle di applicazione dei campioni (1 x 10)Cod. N. 210300 Lamelle di applicazione dei campioni (5 x 10)Cod. N. 321200 Antisiero pentavalente (per campioni di urine e siero) 3 mlCod. N. 321300 Antisiero pentavalente (per campioni di urine e siero) 10 x 3 mlCod. N. 210100 Coppette per campioni monouso (100)Cod. N. 3100 Preparazione REPRACCOLTA E PREPARAZIONE DEL CAMPIONEI campioni ideali sono costituiti dal siero fresco o urine. Mentre i campioni di siero possono essereconservati fino a 4 giorni ad una temperatura di 15 - 30°C, fino a 2 settimane ad una temperatura di 2- 6°C o fino a 6 mesi a -20°C, per i tracciati a 5 bande standard 6, la banda della beta-2-globulina(complemento C3) subisce un rapido degrado. I campioni di urine possono essere conservati infrigorifero ad una temperatura di 2 - 6°C per un max. di 72 ore o per 2 settimane a -20°C. Inizialmentei campioni di urine dovrebbero essere utilizzati senza alcuna concentrazione o diluizione, a meno chenon sia già noto che la quantità di proteine totali supera i 1000 mg/l.PROCEDURA1. URINE: Pipettare 35 µl di campione nelle coppette per campioni monouso appropriate. Evitareche i campioni evaporino.SIERO: Diluire ciascun campione a una diluizione 1 + 2 utilizzando un diluente IFE. Pipettare 35 µl dicampione diluito nelle coppette per campioni monouso appropriate. Evitare che i campioni evaporino.2. Accendere l'unità di elettroforesi e:i) Per gli utilizzatori di SAS-1 Plus: Collocare con cautela il vassoio per campioni sul cassetto diapplicazione. Assicurarsi che il vassoio sia saldamente inserito in posizione.ii)Per gli utilizzatori di SAS-3: Collocare con cautela il vassoio per campioni utilizzando i fermi diposizionamento della base di campioni. Assicurarsi che il vassoio sia posizionato saldamente.3. Rimuovere il gel dalla confezione e:i) Per gli utilizzatori di SAS-1 Plus: Distribuire 400 µL di preparazione REP sul dissipatore di calore.Collocare il gel sul dissipatore di calore con l'agarosio rivolto verso l'alto, allineando i lati positivo enegativo rispetto ai corrispondenti puntali degli elettrodi, prestando attenzione ad evitare bolled'aria sotto il gel.ii)Per gli utilizzatori di SAS-3: Collocare la guida di allineamento sui fermi e distribuire 400 µL dipreparazione REP al centro della camera. Collocare il gel nella camera con l'agarosio rivolto versol'alto; utilizzando la guida, allineare i lati positivo e negativo rispetto ai corrispondenti puntali deglielettrodi, prestando attenzione ad evitare bolle d'aria sotto il gel.4. Asciugare la superficie del gel con un blotter C e poi eliminarlo.5. i) Per gli utilizzatori di SAS-1 Plus: Sistemare il coperchio sul gel e sugli elettrodi e premere condecisione per 5 secondi per consentire il contatto.ii) Per gli utilizzatori di SAS-3: fissare gli elettrodi all'esterno dei puntali, in modo tale che entrino acontatto con i blocchi di gel.6. Collocare 2 gruppi di lamelle di applicazione sullo strumento (per gli utilizzatori di SAS-3: slot A e 10).7. Elettroforesi dello screen pentavalente:i) Per gli utilizzatori di SAS-1 Plus: Elettroforesi: 100 Volt per 18 minuti a 20°CFase di incubazione 1: 8 minuti a 37°C (incubare)Fase di incubazione 2: 8 minuti a 40°C (blot D)NOTA: Per lo screen del siero è richiesta un'applicazione di campione. Per lo screen delle urinesono richieste 10 applicazioni di campione.21Italiano

ii)Per gli utilizzatori di SAS-3:Fase Tempo (mm:ss) Temperatura (°C) Tensione Altro-Caricamento del campione 00:30 21 Velocità 1-Applicazione del campione 00:30 21 Velocità 1*-Elettroforesi 17:00 21 100-Applicazione degli antisieri 10:00 21-Inserimento dei foglidi carta assorbente 02:00 21-Blotter D 05:00 40-Essicazione 08:00 54* Utilizzare la posizione 2NOTA: Per lo screen del siero è richiesta un'applicazione di campione. Per lo screen delle urinesono richieste 10 applicazioni di campione. Rimuovere i blocchi di gel prima dell'essiccazione.8. In seguito all'elettroforesi (per gli utilizzatori di SAS-1 Plus: rimuovere il coperchio), rimuovere glielettrodi dalla superficie del gel. (Per gli utilizzatori di SAS-3: rimuovere la guida di allineamento).Posizionare il template per l'applicazione dell'antisiero sulla superficie del gel. NOTA: Controllareche i canali zigrinati per la somministrazione degli antisieri siano allineati centralmente rispetto allecorsie stampate presenti sul gel su cui vengono applicati i campioni.9. Applicare 60 µL di antisiero pentavalente in ciascun foro del template per l'applicazionedell'antisiero. Controllare che gli antisieri riempiano completamente i canali.10. Incubare il gel.11. Al termine dell'incubazione, collocare un pettine blotter nei fori della mascherina dell'antisiero.Attendere 2 minuti affinché la quantità di antisiero in eccesso venga assorbita, quindi rimuovere ipettini blotter utilizzati ed il template dalla superficie del gel.12. Posizionare un blotter D (con il lato liscio verso il basso) sulla superficie del gel, lasciarvelo per 10secondi e quindi rimuoverlo.13. Posizionare un blotter D (con il lato liscio verso il basso) sulla superficie del gel e riposizionare lamascherina dell'antisiero in modo da lasciare in piano il blotter. Asciugare il gel. NOTA: Subitodopo l'uso, pulire i template antisiero con una soluzione detergente germicida delicata.14. Rimuovere il blotter D. Per gli utilizzatori di SAS-3: Asciugare il gel e procedere ad un primolavaggio di 3 secondi della camera nell'unità SAS-4.15. Rimuovere i blocchi di gel e fissare il gel al supporto della camera di colorazione e completare lefasi finali su SAS-2 o SAS-4.16. Al termine del ciclo di colorazione, rimuovere il gel dalla camera di colorazione. Ora il gel è prontoper essere esaminato.a) SAS-2 (Auto-Stainer)Fase Soluzione Tempo (mm:ss) Porta Temp. (°C)Essiccazione -- 10:00 55Lavaggio Soluzione di lavaggio 07:00 4Colorazione Colorante Acido Blu 03:00 6Decolorazione Soluzione decolorante 02:00 2Essiccazione -- 05:00 65Lavaggio Soluzione di lavaggio 03:00 4Lavaggio Soluzione di lavaggio 03:00 4Essiccazione -- 05:00 6522

SCREEN PENTAVALENTE SAS-1b) SAS-4 (Auto-Stainer)Fase Tempo (mm:ss) Temp. (°C) AltroLavaggio 00:03 Ricircolo ONLavaggio 10:00 Ricircolo ONColorazione 04:00 Ricircolo ONDecolorazione 02:00 Ricircolo ONDecolorazione 02:00 Ricircolo ONEssicazione 12:00 63INTERPRETAZIONE DEI RISULTATILa maggior parte delle proteine monoclonali migra nella regione gamma del catodo del patternproteico, ma a causa della loro natura anomala, potrebbero migrare in qualsiasi punto della frazioneglobulinica in seguito ad elettroforesi proteica. Le proteine anomale dovrebbero essere ora individuatemediante un IFE completo.Dove sono presenti basse concentrazioni di proteine patologiche, le bande possono apparire senza lenormali immunoglobuline policlonali. In presenza di una grande quantità di immunoglobulinapoliclonale, è inoltre possibile che compaia una banda all'interno di uno sfondo policlonale.CONTROLLO QUALITÀIl Kemtrol anomalo (Cod. N. 7025) produrrà un'unica banda monoclonale all'interno di uno sfondopoliclonale.LIMITI1. Eccesso di antigene.Si verifica un eccesso di antigene se non si manifesta un lieve eccesso di anticorpo o l'equivalenzaantigene/anticorpo nel punto della precipitazione. L'eccesso di antigene nell'IFE è normalmentedovuto a un eccesso di immunoglobulina nel campione del paziente. Tale eccesso di antigene ècaratterizzato dalla pro-zona (aree non colorate al centro della banda proteica immunofissata, concolorazione attorno ai bordi). In questo caso è opportuno utilizzare una diluizione più alta delcampione al fine di ottimizzare la concentrazione di immunoglobulina.CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONIa) SensibilitàCon il metodo delle urine (10 applicazioni), 10 mg/l per banda è stato determinato come laconcentrazione minima di proteine visibili sotto forma di banda distinta presente sul gelcompletato.b) LinearitàLa linearità è una funzione della specificazione densitometrica nonché delle prestazioni del gel. Siraccomanda a ciascun cliente di determinare la linearità del metodo sulla base del densitometro inuso nel laboratorio.23Italiano

BIBLIOGRAFIA1. Fauchier, P. and Catalan, F. 'Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis' Alfred FournierInstitute, Paris, France, 1988.2. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. 'Finding Clues to Disease in Urine' DiagnosticMedicine, 1980 ; May/June : 69-75.3. Umbreit, A. and Wiedemann, G. 'Determination of Urinary Protein Fractions. A ComparisonWith Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations'Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.4. Wiedemann, G. and Umbreit, A. 'Determination of Urinary Protein Fractions by DifferentElectrophoretic Methods', Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.5. Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S. 'AComparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria' Ann. Clin.Biochem., 1997, 34 : 371-374.6. Alfonso, E., 'Quantitation Immunoelectrophoresis of Serum Proteins', Clin. Chim. Acta., 1964; 10: 114-122.7. Alper, C.A and Johnson, A.M., 'Immunofixation Electrophoresis: A Technique for the Study ofProtein Polymorphism', Vox. Sang., 1969; 17 : 445-452.8. Alper, C.A.,'Genetic Polymorphism of Complement Components as a Probe of Structure andFunction', Progress in Immunology. First International Congress of Immunology. 1971 : 609-624,Academic Press, New York.9. Johnson, A.M., 'Genetic Typing of Alpha(1)-Antitrypsin in Immunofixation Electrophoresis.Identification of Subtypes of Pi M.', J. Lab. Clin. Med., 1976; 87 : 152-163.10. Cawley, L.P., Minard, B.J, Tourtellotte, W.W., Ma, B.I. and Chelle, C., 'ImmunofixationElectrophoretic Technique Applied to Identification of Proteins in Serum and Cerebrospinal Fluid',Clin. Chem., 1976; 22 : 1262-1268.11. Ritchie, R.F and Smith, R. 'Immunofixation III, Application to the Study of Monoclonal Proteins',Clin. Chem., 1976; 22 : 1982-1985.24

CRIBADO PENTAVALENTE SAS-1USO PREVISTOEl Kit de cribado pentavalente SAS-1 está pensado para el cribado en muestras de suero y orina degammapatías monoclonales mediante electroforesis en gel de agarosa e inmunofijación.La electroforesis por inmunofijación (IFE) es un proceso de dos fases en el que, en la primera de ellas,se utiliza electroforesis con agarosa de alta resolución e inmunoprecitación en la segunda fase.La mayor demanda de IFE proviene de los laboratorios clínicos, donde se utiliza principalmente en ladetección de gammapatías monoclonales. La gammapatía monoclonal es una enfermedad primaria enla que un único clon de células plasmáticas produce elevados niveles de inmunoglobulina de una solaclase y tipo.Estas inmunoglublinas se conocen como proteínas monoclonales, proteínas M o paraproteínas. Supresencia puede ser o bien benigna o de importancia indeterminada. En algunos casos, son indicativasde la presencia de un tumor maligno, como el mieloma múltiple o la macroglobulinemia deWaldenström. Es preciso distinguir entre las gammapatías policlonales y las gammapatíasmonoclonales, pues las gammapatías policlonales son enfermedades secundarias debidas a trastornosclínicos como las afecciones crónicas del hígado, los trastornos de colágeno, artritis reumatoide einfección crónica.Las proteínas de la orina proceden principalmente de proteínas plasmáticas que se filtran a través delriñón. La aparición de proteínas plasmáticas anormales en la orina tiene un gran valor para la evaluaciónde las funciones renales. El estudio adecuado de la proteinuria debe incluir valoraciones cuantitativasy cualitativas del tipo y cantidad de las proteínas excretadas [1-5].Alfonso fue el primero en describir la inmunofijación en la literatura de 1964 [6]. Alper y Johnsonpublicaron un procedimiento más práctico en 1969, así como una serie de estudios en los que se utilizóesta técnica [7-9]. La inmunofijación se ha utilizado como un procedimiento para la investigación de lasinmunoglobulinas desde 1976 [10-11].ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONESTodos los reactivos son exclusivamente para uso diagnóstico in-vitro. No ingerir ni pipetear con laboca ningún componente del kit. Usar guantes para manejar todos los componentes del kit. Consultarla hoja con los datos de seguridad del producto acerca de los riesgos de los componentes, avisos deseguridad y consejos para su eliminación.COMPOSICIÓN200301:1. SAS-1 GelContiene agarosa en un tampón de Tris-Barbital, con Tiomersal y azida de sodio comoconservante. El gel viene envasado listo para usar.2. Concentrado de Colorante Violeta ÁcidoNO DEBE USARSE CON EL KIT DE CRIBADO PENTAVALENTE.3. Solución decolorante concentrada.Contiene solución decolorante concentrada. Diluir el contenido del frasco en 2 litros con aguadestilada. Guardar en un frasco herméticamente cerrado.4. Solución de lavadoContiene 100 ml de solución de lavado concentrada. Diluir 20 ml hasta 1 litro con solución salina.25Español

5. Diluyente de muestrasContiene tampón Tris / barbital con bromofenol azul y azida sódica como conservante. Eldiluyente viene envasado listo para usar.6. Otros componentes del kitCada kit contiene una hoja de instrucciones (no para usar con el cribado pentavalente) y secantesC, D y combinados suficientes para completar 10 geles.200406:1. Concentrado de colorante azul ácidoContiene colorante concentrado azul ácido. Diluir el contenido del vial en 700 ml con aguadestilada. Dejar agitando durante toda la noche y filtrarlo antes del uso. Guardar en un frascoherméticamente cerrado.2. Otros componentes del kitCada kit contiene instrucciones de uso.ALMACENAMIENTO Y PERIODO DE VALIDEZ200301:1. Gel de IFE SAS-1Los geles han de almacenarse a 15 - 30°C y permanecen estables hasta la fecha de caducidadindicada en el envase. NO REFRIGERAR NI CONGELAR. El deterioro del gel puede estarindicado por: 1) apariencia cristalina, indicativo de que el gel ha sido congelado, 2) agrietamiento ydescamación, indicativo del resecamiento del gel, ó 3) contaminación visible de la agarosa porfuentes bacterianas o micóticas.2. Colorante violeta ácidoNO DEBE USARSE CON EL KIT DE CRIBADO PENTAVALENTE.3. Solución decoloranteEl concentrado decolorante debe guardarse a 15 - 30°C y permanece estable hasta la fecha decaducidad indicada en el envase. La solución decolorante diluida es estable hasta 6 meses a 15 -30°C.4. Solución de lavadoLa solución de lavado concentrada debe guardarse a 15 - 30°C y permanece estable hasta la fechade caducidad indicada en la etiqueta. La solución de lavado diluida permanece estable durante 6meses a una temperatura entre 15 y 30°C. La turbiedad puede ser indicativo de deterioro.5. Diluyente de muestrasEl diluyente de muestras ha de almacenarse a 15 - 30°C y permanece estable hasta la fecha decaducidad indicada en la etiqueta del envase. La turbidez puede indicar deterioro.200406:1. Colorante azul ácidoEl colorante concentrado ha de almacenarse a 15 - 30°C y es estable hasta la fecha de caducidadindicada en el envase. La solución colorante preparada es estable durante 6 meses a 15 - 30°C. Esaconsejable desechar inmediatamente el colorante usado para evitar el agotamiento de sucapacidad de coloración. Un mal rendimiento de coloración puede indicar deterioro.26

CRIBADO PENTAVALENTE SAS-1ARTÍCULOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOSNº Cat. 210200 Aplicadores de muestras 1 x 10Nº Cat. 210300 Aplicadores de muestras 5 x 10N.° Cat. 321200 Antisuero pentavalente (para muestras de orina y suero) 3 mlN.° Cat. 321300 Antisuero pentavalente (para muestras de orina y suero) 10 x 3 mlNº de catálogo 210100 Vasos de recogida de muestras desechables 100Nº Cat. 3100 REP PrepRECOGIDA Y PREPARACIÓN DE MUESTRASSe ha de elegir como muestra suero u orina recién recogidos. Aunque las muestras de suero puedenalmacenarse 4 días a 15 - 30°C, 2 semanas a 2 - 6°C, ó 6 meses a -20°C para un modelo estándar de5 bandas6, la banda beta 2-globulina (Complemento C3) se degradará rápidamente al almacenarse. Lasmuestras pueden guardarse refrigeradas a 2 - 6°C hasta 72 horas o 2 semanas a -20°C. Inicialmente,las muestras de orina se utilizarán sin concentración ni dilución, a no ser que se sepa que las proteínastotales excedan los 1.000 mg/l.PROCEDIMIENTO PASO A PASO1. ORINA: Con una pipeta, introducir 35 µl de la muestra en los vasos de recogida de muestrasdesechables adecuados. Proteger las muestras de la evaporación.SUERO: Diluir cada muestra a una dilución 1 + 2, usando diluyente de IFE. Con una pipeta,introducir 35 µl de la muestra en los vasos de recogida de muestras desechables apropiados.Proteger las muestras de la evaporación.2. Encender la unidad de electroforesis y:i) Usuarios de SAS-1 Plus: Colocar cuidadosamente la bandeja con la muestra en la gaveta delaplicador. Asegurarse de que la bandeja está firmemente introducida en su posición.ii) Usuarios de SAS-3: Colocar cuidadosamente la bandeja con la muestra utilizando los pasadores delocalización de la base de la muestra. Asegurarse de que la bandeja está en una posición segura.3. Sacar el gel del envase y:i) Usuarios de SAS-1 Plus: pipetear 400 µL de REP Prep en el disipador térmico. Colocar el gel enel disipador térmico, con el lado de agarosa hacia arriba, alineando los lados positivo y negativo conlos bordes, teniendo cuidado de evitar las burbujas de aire debajo del gel.ii) Usuarios de SAS-3: colocar la guía de alineación en los pasadores y administrar 400 µL de REP Prepen el centro de la cámara. Colocar el gel en la cámara con la agarosa hacia arriba, utilizar la guíapara alinear los lados positivo y negativo con los bordes, teniendo cuidado de evitar las burbujasde aire debajo del gel.4. Secar la superficie del gel con un secante C y luego desechar el secante.5. i) Usuarios de SAS-1 Plus: Colocar la cubierta sobre el gel y los electrodos, presionar con firmezadurante 5 segundos para asegurar un buen contacto.ii) Usuarios de SAS-3: conectar los electrodos a los bordes, de forma que estén en contacto conlos bloques de gel.6. Colocar 2 unidades de aplicadores en la posición del instrumento (usuarios de SAS-3: ranuras A y10).7. Realizar la electroforesis de cribado pentavalente:i) Usuarios de SAS-1 Plus: Electroforesis: 100 Voltios, 18 mins, 20°CPaso de incubación 1: 8 min., 37°C (incubar)Paso de incubación 2: 8 min., 40°C (secado D)27Español

NOTA: Para el cribado en suero, se requiere 1 aplicación de la muestra. Para el cribado de orina,se necesitan 10 aplicaciones de muestra.ii) Usuarios de SAS-3:Paso Tiempo (min:s) Temperatura (°C) Voltaje OtrosCargar muestra 00:30 21 Velocidad 1Aplicar la muestra 00:30 21 Velocidad 1 *Electroforesis 17:00 21 100Aplicar antisueros 10:00 21Insertar peine 02:00 21Secante D 05:00 40Secar 08:00 54* Utilizar la posición 2NOTA: Para el cribado de suero, se requiere 1 aplicación de la muestra. Para el cribado de orina,se requieren 10 aplicaciones de la muestra. Retirar los bloques de gel antes del secado.8. Después de la electroforesis, (Usuarios de SAS-1 Plus: retirar la cubierta), retirar los electrodos dela superficie del gel. (Usuarios de SAS-3: sacar la guía de alineación). Colocar la plantilla deaplicación de antisuero sobre la superficie del gel. NOTA: Los canales laminados del antisuerodeben alinearse en el centro por encima de la caja impresa sobre el gel en el que se aplican lasmuestras.9. Aplicar 60 µl de antisuero pentavalente en cada orificio de la plantilla de aplicación del antisuero.Asegurarse de que el antisuero ha empapado completamente los canales.10. Incubar el gel.11. Finalizada la incubación, colocar una combinación de secantes en los agujeros de la base de laplantilla del antisuero. Dejar 2 minutos para que se absorba el antisuero sobrante y después retirarlos peines de secantes y la plantilla de la superficie del gel.12. Colocar un secante D (la cara suave hacia abajo) sobre la superficie del gel, dejar 10 segundos yretirar.13. Colocar un secante D (la cara suave hacia abajo) sobre la superficie del gel y sustituir la plantilla delantisuero para que el secante quede liso. Secar el gel. NOTA: Inmediatamente después de suutilización, limpiar la plantilla del antisuero con un detergente suave y biocida.14. Retirar el secante D. Usuarios de SAS-3: Secar el gel y comenzar el lavado de la cámara inicial de3 segundos en la unidad SAS-4.15. Retirar los bloques de gel y fijar el gel al soporte de la cámara de tinción y completar los pasosfinales en la SAS-2 o SAS-4.16. Finalizado el ciclo de coloración, sacar el gel de la cámara de coloración. Ahora, el gel está listopara ser examinado.a) SAS-2 (Colorador automático)Paso Solución Tiempo (min:s) Orificio Temp (°C)Secar -- 10:00 55Lavar Solución acuosa 07:00 4Teñir Colorante azul ácido 03:00 6Decolorar Solución decolorante 02:00 2Secar -- 05:00 65Lavar Solución acuosa 03:00 4Lavar Solución acuosa 03:00 4Secar -- 05:00 6528

CRIBADO PENTAVALENTE SAS-1b) SAS-4 (Colorador automático)Paso Tiempo (min:s) Temp (°C) OtrosLavar 00:03 Recirculación ONLavar 10:00 Recirculación ONTeñir 04:00 Recirculación ONDecolorar 02:00 Recirculación ONDecolorar 02:00 Recirculación ONSecar 12:00 63INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSLa mayoría de las proteínas monoclonales migran en la región gamma catódica del patrón de proteínas,pero, debido a su naturaleza anómala, lo hacen a cualquier lugar de la región globulina durante laelectroforesis de la proteína. La proteína anormal ahora debe identificarse con un IFE completo.Cuando están presentes pequeñas concentraciones de proteínas anómalas, la banda anómala puedeaparecer como una banda dentro de la inmunoglobulina policlonal normal. También puede detectarseuna banda dentro de un fondo policlonal cuando hay una alta presencia de inmunoglobulina policlonal.CONTROL DE CALIDADKemtrol Anormal (Cat. No. 7025) dará una banda monoclonal única, dentro de un fondo policlonal.LIMITACIONES1. Exceso de antígeno.Habrá un exceso de antígeno si no hay un ligero exceso de anticuerpos o una equivalenciaantígeno/anticuerpo en el lugar de la precipitación. Un exceso de antígeno en la inmunofijación sedebe normalmente a un exceso de inmunoglubina en la muestra del paciente. El exceso deantígeno se caracteriza por las prozonas (áreas no coloreadas en el centro de la banda de laproteína inmunofijada con coloración en los bordes). En estas situaciones, debería recurrirse a unamayor dilución de la muestra para mejorar la concentración de inmunoglobulina..CARACTERÍSTICAS FUNCIONALESa) SensibilidadUsando el método de la orina (10 aplicaciones), se determinó que 10 mg/l era la concentraciónmás baja de proteínas que se hizo evidente en forma de una banda discreta sobre el gelcompletado.b) LinealidadLa linealidad es una función de las especificaciones del densitómetro, así como delcomportamiento del gel. Es aconsejable que cada cliente determine la linealidad del métodobasándose en el densitómetro utilizado en el laboratorio.29Español

BIBLIOGRAFÍA1. Fauchier, P. y Catalan, F. 'Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis' Alfred Fournier Institute,París, Francia, 1988.2. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. y Tyllia, M.M. 'Finding Clues to Disease in Urine' DiagnosticMedicine, 1980 ; mayo/junio : 69-75.3. Umbreit, A. y Wiedemann, G. 'Determination of Urinary Protein Fractions. A Comparison WithDifferent Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations' Clin.Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172.4. Wiedemann, G. y Umbreit, A. 'Determination of Urinary Protein Fractions by DifferentElectrophoretic Methods', Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262.5. Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. y Lockhart, S. 'AComparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria' Ann. Clin.Biochem., 1997, 34 : 371-374.6. Alfonso, E., 'Quantitation Immunoelectrophoresis of Serum Proteins', Clin. Chim. Acta., 1964; 10: 114-122.7. Alper, C.A y Johnson, A.M., 'Immunofixation Electrophoresis: A Technique for the Study of ProteinPolymorphism', Vox. Sang., 1969; 17 : 445-452.8. Alper, C.A.,'Genetic Polymorphism of Complement Components as a Probe of Structure andFunction', Progress in Immunology. First International Congress of Immunology 1971 : 609-624,Academic Press, Nueva York.9. Johnson, A.M., 'Genetic Typing of Alpha(1)-Antitrypsin in Immunofixation Electrophoresis.Identification of Subtypes of P.M.', J. Lab. Clin. Med., 1976 ; 87 (1) : 152-163.10. Cawley, L.P., Minard, B.J., Tourtellotte,w.w., Ma, B.I. and Chelle,C. 'ImmunofixationElectrophoretic Technique Applied to Identification of Proteins in Serum and Cerebrospinal Fluid',Clin. Sang., 1976; 22 : 1262-1268.11. Ritchie, R.F and Smith, R. 'Immunofixation III, Application to the Study of Monoclonal Proteins',Clin. Sang., 1976; 22 : 1982-1985.30

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