enzimas: qué son y para que sirven - Real Academia de Ciencias ...

414Luis Franco VeraRev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. (Esp), 2007; 101las enzimas que, como se ha visto, se basa en unaexquisita organización del centro activo. Esta especificidades un atractivo desde el punto de vista analítico,ya que permite determinar cualitativa y cuantitativamenteun analito en mezclas complejas, sin necesidadde separación previa. Hay que tener en cuenta que paraseguir fácilmente el curso de la reacción, es convenienteque en la misma se produzca un cambio en laspropiedades físicas —ordinariamente absorbancia ofluorescencia—de los sustratos o productos quepermita la determinación cuantitativa del progreso dela reacción. Cuando esto no ocurre, de ordinario serecurre a una reacción enzimática acoplada. En estecontexto, una reacción acoplada es la que utiliza comosustrato uno de los productos de la primera y que, a suvez, conduce a un producto de fácil detección. Sonmuy numerosas las posibilidades de empleo de reaccionesacopladas, por lo que actualmente es posible lautilización de ensayos enzimáticos para la determinaciónde una amplísima variedad de analitos deinterés químico, clínico o industrial.Cuando se trata de llevar a cabo determinacionescuantitativas —la situación más frecuente—, sepueden utilizar dos tipos de métodos: el del punto finaly los cinéticos. El primero, posible si la reacción principaly, en su caso, las acopladas, pueden transcurrir demodo prácticamente irreversible, consiste en dejar progresarlas reacciones hasta su finalización. La determinacióncuantitativa del producto valorable permite —através del conocimiento de la estequiometría de todaslas reacciones— evaluar la concentración del analitoproblema. El fundamento del los métodos cinéticosrequiere una explicación previa. En la ecuación deMichaelis-Menten [1], si se multiplica numerador ydenominador por [S]/K m , se llega a:[4]Cuando la concentración de sustrato es muy pequeñacomparada con la constante de Michaelis, el término[S]/K m es despreciable frente a la unidad en el denominadory la ecuación [4] queda entonces como:[5]que corresponde a una ecuación de primer orden. Lavelocidad en esas condiciones es directamente proporcionala la concentración de sustrato, lo que permite,tras la calibración correspondiente con concentracionesconocidas de sustrato, la determinación cuantitativade ese sustrato en muestras problema. Hay queinsistir en que este método implica la validez de laecuación [5], que sólo ocurre cuando [S]/K m