enzimas: quÃƒÂ© son y para que sirven - Real Academia de Ciencias ...

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414Luis Franco VeraRev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. (Esp), 2007; 101las enzimas que, como se ha visto, se basa en unaexquisita organización del centro activo. Esta especificidades un atractivo desde el punto de vista analítico,ya que permite determinar cualitativa y cuantitativamenteun analito en mezclas complejas, sin necesidadde separación previa. Hay que tener en cuenta que paraseguir fácilmente el curso de la reacción, es convenienteque en la misma se produzca un cambio en laspropiedades físicas —ordinariamente absorbancia ofluorescencia—de los sustratos o productos quepermita la determinación cuantitativa del progreso dela reacción. Cuando esto no ocurre, de ordinario serecurre a una reacción enzimática acoplada. En estecontexto, una reacción acoplada es la que utiliza comosustrato uno de los productos de la primera y que, a suvez, conduce a un producto de fácil detección. Sonmuy numerosas las posibilidades de empleo de reaccionesacopladas, por lo que actualmente es posible lautilización de ensayos enzimáticos para la determinaciónde una amplísima variedad de analitos deinterés químico, clínico o industrial.Cuando se trata de llevar a cabo determinacionescuantitativas —la situación más frecuente—, sepueden utilizar dos tipos de métodos: el del punto finaly los cinéticos. El primero, posible si la reacción principaly, en su caso, las acopladas, pueden transcurrir demodo prácticamente irreversible, consiste en dejar progresarlas reacciones hasta su finalización. La determinacióncuantitativa del producto valorable permite —através del conocimiento de la estequiometría de todaslas reacciones— evaluar la concentración del analitoproblema. El fundamento del los métodos cinéticosrequiere una explicación previa. En la ecuación deMichaelis-Menten [1], si se multiplica numerador ydenominador por [S]/K m , se llega a:[4]Cuando la concentración de sustrato es muy pequeñacomparada con la constante de Michaelis, el término[S]/K m es despreciable frente a la unidad en el denominadory la ecuación [4] queda entonces como:[5]que corresponde a una ecuación de primer orden. Lavelocidad en esas condiciones es directamente proporcionala la concentración de sustrato, lo que permite,tras la calibración correspondiente con concentracionesconocidas de sustrato, la determinación cuantitativade ese sustrato en muestras problema. Hay queinsistir en que este método implica la validez de laecuación [5], que sólo ocurre cuando [S]/K m
Luis Franco Vera Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. (Esp), 2007; 101 415tados 9 . Se trata que la enzima quede retenida por unamatriz sólida, lo que permite recuperarla al término dela operación. La enzima se puede así reutilizar. Hayvarios tipos de inmovilización: por adsorción sobresoportes adecuados (por ejemplo, perlas de vidrio), porunión covalente a polímeros naturales o artificiales opor encapsulación en una matriz que permita el accesoa sustratos y productos e impida la salida de la enzima.En cualquier caso, hay que evitar que la inmovilizaciónimpida la aproximación de los sustratos alcentro activo. Cuando se emplea la unión covalente,suelen usarse reactivos bifuncionales, que se unen porun extremo a la enzima y por otro al polímero, de longitudde cadena suficientemente larga, para que laenzima quede a distancia del polímero. La inmovilizacióntiene la ventaja adicional de que aumenta laestabilidad de la enzima. El dispositivo esquematizadoen la figura 13 representa un caso particular de inmovilizaciónpor encapsulación, que permite una operacióncontinua. La enzima se sitúa en este caso, en el interiorde fibras, ordinariamente capilares para aumentar susuperficie total, formadas por membranas permeablesa los sustratos y productos pero no a la enzima. Si porel espacio exterior a esos tubos se hace fluir una disoluciónde los sustratos, éstos pueden penetrar al lugarocupado por la enzima y, allí, convertirse en los productos,que difundirán hacia el exterior de los tubos. Sila relación entre la velocidad del flujo y la longitud deldispositivo se ajusta convenientemente, se puede conseguirque los que a la entrada era una disolución desustrato lo sea a la salida de producto. Este es el fundamentode los reactores enzimáticos, que se empleantanto en procesos industriales como para las finalidadesanalíticas a las que se ha aludido antes.La inmovilización de enzimas constituye una metodologíaclásica para su utilización práctica y, como tal,viene utilizándose desde hace bastante tiempo. Otraposibilidad, si bien menos utilizada en general, es eluso de enzimas en disolventes no acuosos (19). Esposible preparar las enzimas para que al exponerlas aesos disolventes mantengan la estructura nativa y, portanto, su actividad. El empleo de disolventes orgánicos,además de la obvia ventaja de que puedenemplearse enzimas como catalizadores de reaccionesque transcurren en medios no acuosos, presenta otraFigura 13. Esquema de un reactor enzimático. Las fibras semipermeablesque contienen la enzima se representan en rojo.Véase el texto para los detalles de funcionamiento.peculiaridad. Hay muchas reacciones, como porejemplo las de hidrólisis a las que se aludía al principio,que en medio acuoso son irreversibles. Realmente,en estas reacciones el agua actúa como reactivonucleófilo y si la reacción transcurre en medio acuoso,la elevada concentración de agua (55,5 M), junto conel valor de ∆Gº
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