Abarco Caoba Cedro Palorosa y Canelo de los Andaquíes

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Planes de Manejo para la conservación de Abarco, Caoba, Cedro, Palorosa y Canelo de los Andaquíes ▶ Viene de la página anterior Nombre Secuencia 5’-3’ Marcaje 5’ Cedro Ced44 Ced54 Ced61a Ced65 Ced95 Ced131 F: ACTCCATTAACTGCCATGAA R: GTTTCTTATTTTCATTCCCTTTTAGCC F: GATCTCACCCACTTGAAAAA R: GTTTCTTGCTCATATTTGAGAGGCATT F: CAATCAAACCAAAAATGGAT R: GTTTCTTGCAAATTAACCAGAAAAACG F: GAGTGAGAAGAAGAATCGTGATAGC R: GTTTCTTGAGGTTCGATCAGGTCTTGG F: ATTTTCATTCCCTTTTAGCC R: GTTTCTTTTATCATCTCCCTCACTCCA F: CTCGTAATAATCCCATTCCA R: GTTTCTTGGAGATATTTTTGGGGTTTT Canelo de los Andaquíes VIC NED PET NED 6-FAM Ood 05 F: GACACAGTAATGCTGGGGAAA R: GTTTCTTACCCTCAACCTCATCATTGC VIC Ood 07 F: TAATGGGTCCCCTGTTTTGA R: GTTTCTTCCCCTTTCTTTCCCTCTCAC NED Ood 09 F: ATATGCTACTCTTTGGAAGC R: GTTTCTTCTAGTAAAATTGTCCAACGA 6-FAM Ood 14 F: CCTTAAACTTCACCCTCTCC R: GTTTCTTCCAAGTTCAAAAGAGGAAAA PET Ood 15 F: AACAGAGTGGACTCGAAGAA R: GTTTCTTTATGGAAGTGCCTCTTTCTC 6-FAM Ood 16 F: TCCATTCGGAGAGAAAAATA R: GTTTCTTCTCTAGTGACGGAATGGAAG NED Ood 17 F: AGTAGCTTCACCAACCAAGA R: GTTTCTTTGGCTTGTTTTACTCCCTTA VIC Ood 20 F: TTAGTCTCACCTTCCATTCC R: GTTTCTTTGGACACGAGGTTAGTTTCT PET *Al extremo 5’ de los cebadores reverse se adicionó una secuencia GTTTCTT para mejorar la calidad de la amplificación. PET Separación de Fragmentos de Microsatélites Los fragmentos amplificados mediante PCR fueron diluidos para su lectura en el analizador genético. Para calcular el tamaño de los alelos resultantes fueron mezclados con un marcador de peso molecular GeneScan 600 LIZ size standard o GeneScan 1200 LIZ (Applied Biosystems). La separación de fragmentos se realizó mediante un analizador genético Applied Biosystems 3500 (en el Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia) o 3730xl DNA Analyzer (en Macrogen Inc). Los electroferogramas fueron analizados mediante la aplicación adicional Microsatellite del software Geneious v5.6 (Drummond et al. 2012). Análisis de los Resultados Huella Genética Con la lectura de los microsatélites obtenidos se construyó una matriz de los alelos encontrados en cada uno de los loci evaluados, a partir de la cual se realizó una matriz binaria y se calcula- 38
MARCO CONCEPTUAL ron distancias genéticas entre los individuos analizados. Las distancias estuvieron definidas de acuerdo a Huff et al. (1993), en las cual una comparación del mismo estado tiene un valor de 0 (comparaciones tanto 0 vs 0 y 1 vs 1), mientras que cualquier comparación de estados diferentes (0 vs 1 o 1 vs 0) tiene un valor de 1. Con el propósito de observar las relaciones genéticas entre los individuos evaluados se realizó un análisis de coordenadas principales a partir de la matriz de distancias genéticas. Igualmente se calculó, la heterocigocidad (media sobre loci) observada y esperada insesgada, el contenido de información polimórfica mediante el paquete estadístico GenAlEx (Peakall & Smouse 2006, 2012). Extracción de ADN para Códigos de Barra Para la generación de códigos de barra de ADN se colectaron como mínimo cinco a siete individuos de cada especie. El material colectado se almacenó en bolsas de papel rotuladas e introducidas en bolsas plásticas de selle hermético las cuales contenían abundante sílica gel en una proporción de peso 5-10:1 (peso sílica: peso material vegetal) (Powell et al. 2011). Cada especie o individuo del cual se obtuvieron las secuencias, tuvo un ejemplar botánico que reposa en el Herbario Amazónico Colombiano (COAH). Los protocolos de extracción de ADN fueron aquellos empleados para los procedimientos de marcadores moleculares microsatélite anteriormente mencionados. Aplicación de Códigos de barra de ADN Las regiones código de barras de ADN fueron aquellas propuestas por el CBOL: matk y rbcl, y cuando fue necesario se empleó un tercer marcador ITS. La amplificación y condiciones se realizaron de acuerdo a los protocolos propuestos por el CBOL PlantWorkingGroup. La secuenciación de las regiones amplificadas se realizó a través del servicio de secuenciación del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia. Análisis de los Resultados Códigos de Barra Las secuencias obtenidas fueron editadas mediante el software Geneious v 5.6 (Drummond et al. 2012) y comparadas con la base de datos Genbank 8 (Benson et al. 2005) mediante el programa BLAST. De cada especie se realizaron alineamientos múltiples de las secuencias obtenidas por medio del algoritmo MUSCLE, dado que se trata de identificar estándares globales para estas especies se siguió la metodología propuesta por el CBOL y a partir del alineamiento se calcularon distancias Kimura 2-Parametros (K2P) de cuya matriz se construyó un árbol filogenético mediante el método neighbor-joining. Los análisis filogenéticos fueron realizados utilizando MEGA ver- 8 El Genbank es una base de datos electrónica mantenida por el National Center for Biotechnology Information de los Estados Unidos de América. Contiene más de un billón de secuencias anotadas y con referencia cruzada con otras bases de datos. Los científicos puedes enviar sus secuencias de ADN al Genbank gratuitamente en la web. El éxito e importancia del Genbank ha llevado a muchas revistas científicas a requerir la sumisión al Genbank como prerrequisito para la publicación de un artículo, lo cual asegura el acceso de los datos a la comunidad científica. La intención del Genbank no es competir con las revistas académicas, más bien es la mejorar la habilidad de la comunidad científica en el acopio de información (Hars 2003). 39
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