TFM_Juan Llivi
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DIAGNÓSTICO DE PROCESOS DIARREICOS EN EL GANADO PORCINO
JUAN LLIVI MARCATOMA
Directores:
Jéssica Molín Molina
Gustavo A. Ramírez Rivero
2020
ÍNDICE
RESUMEN ................................................................................................................................... i
SUMMARY .................................................................................................................................. ii
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................ iii
1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
2 ENFERMEDADES ENTÉRICAS EN LA ETAPA DE LACTACIÓN ....................................... 2
2.1 Colibacilosis ............................................................................................................... 4
2.1.1 Etiología ............................................................................................................. 4
2.1.2 Epidemiología ..................................................................................................... 5
2.1.3 Patogenia ........................................................................................................... 6
2.1.4 Signos clínicos .................................................................................................... 8
2.1.5 Lesiones macroscópicas y microscópica ............................................................ 8
2.1.6 Diagnóstico e identificación. ............................................................................... 9
2.2 Clostridiosis. ............................................................................................................ 10
2.2.1 Clostridium Perfringens .................................................................................... 11
2.2.2 Clostridium perfringens tipo A (CpA)................................................................. 11
2.2.3 Clostridium perfringens tipo C (CpC) ................................................................ 14
2.2.4 Clostridium difficile (CDI) .................................................................................. 18
2.3 Rotavirus (RV) ......................................................................................................... 21
2.3.1 Etiología ........................................................................................................... 21
2.3.2 Epidemiología ................................................................................................... 22
2.3.3 Patogenia ......................................................................................................... 22
2.3.4 Signos clínicos .................................................................................................. 23
2.3.5 Lesiones macroscópicas y microscópicas ........................................................ 24
2.3.6 Diagnóstico e identificación .............................................................................. 25
2.4 Diarreas por coronavirus de porcinos (PCoV).......................................................... 26
2.4.1 Virus de la Diarrea epidémica porcina (PEDV) ................................................. 27
2.4.2 Virus de la Gastroenteritis trasmisible (TGEV).................................................. 31
3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 35
4 MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 36
4.1 Selección de casos y recopilación de datos ............................................................. 36
4.2 Métodos de diagnóstico ........................................................................................... 37
4.2.1 Histopatología ................................................................................................... 37
4.2.2 Bacteriología..................................................................................................... 37
4.2.3 Virología ........................................................................................................... 38
4.3 Análisis de datos...................................................................................................... 38
5 RESULTADOS .................................................................................................................. 39
5.1 Comparación de métodos diagnósticos ................................................................... 39
5.2 Lesiones histopatológicas ........................................................................................ 42
5.3 Prevalencia de patógenos entéricos asociados a diarreas neonatales .................... 45
6 DISCUSIÓN....................................................................................................................... 47
6.1 Comparación de métodos diagnósticos ................................................................... 47
6.1.1 Escherichia coli ................................................................................................. 47
6.1.2 Clostridium perfringens ..................................................................................... 48
6.1.3 Rotavirus, Coronavirus de porcinos .................................................................. 49
6.2 Lesiones histopatológicas ........................................................................................ 50
6.2.1 Lesiones asociadas a colibacilosis ................................................................... 50
6.2.2 Lesiones asociadas a clostridios ....................................................................... 50
6.2.3 Lesiones asociadas a Rotavirus/Coronavirus ................................................... 51
6.3 Prevalencia de enfermedades entéricas .................................................................. 51
6.3.1 Escherichia coli ................................................................................................. 51
6.3.2 Clostridium perfringens ..................................................................................... 52
6.3.3 Rotavirus, Coronavirus de porcinos .................................................................. 53
7 CONCLUSIONES .............................................................................................................. 55
8 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 56
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Principales Agentes patógenos asociados a enfermedades en cerdos en etapa de
lactación ...................................................................................................................................... 3
Tabla 2. Clasificación de E. coli de acuerdo a la producción de toxinas y factores de virulencia . 5
Tabla 3 Clasificación de C. perfringens por tipos y toxinas ........................................................ 11
Tabla 4. Muestras totales del diagnóstico etiológico de Histopatología (H), bacteriología (B) y
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en cerdos de lactación. ........................................ 39
Tabla 5. Resumen de los resultados extraídos de las tablas cruzadas para agentes patógenos
bacterianos analizados por histopatología (H) y bacteriología (B). ............................................ 39
Tabla 6. Resumen de los resultados extraídos de las tablas cruzadas para agentes patógenos
virales analizados por histopatología (H) y técnicas moleculares (PCR).................................... 40
Tabla 7. Grado de concordancia con un intervalo de confianza al 95% de las diferentes pruebas
evaluadas en los laboratorios del SIDAVE Y GSP. .................................................................... 40
Tabla 8 Frecuencia de presentación de los distintos patrones de lesiones compatibles con
infección de agentes bacterianos y víricos en relación con el resultado de Bacteriología y PCR
.................................................................................................................................................. 43
Tabla 9. Frecuencia de lesiones de acuerdo al grado de cronicidad identificados por
histopatología. ........................................................................................................................... 43
Tabla 10. Frecuencia de lesiones de acuerdo al grado de severidad identificados por
histopatología ............................................................................................................................ 44
Tabla 11. Prevalencia de patógenos entéricos .......................................................................... 45
INDICE DE FIGURA
Figura 1. Representación esquemática de una bacteria de E. coli .............................................. 5
Figura 2. Mecanismo de acción de Escherichia coli enterotoxigénica .......................................... 7
Figura 3. Lesiones macroscópicas asociadas a colibacilosis. Asas intestinales distendidas con
contenido color amarillento de aspecto espumoso ...................................................................... 8
Figura 4. Lesiones microscópicas asociado a colibacilosis. Adherencia bacteriana en enterocitos
.................................................................................................................................................... 9
Figura 5. Lesiones macroscópicas asociadas a C. perfringens tipo A. Intestino delgado con
enteritis fibrinonecrótica. ............................................................................................................ 13
Figura 6. Lesiones asociadas a Clostridium perfringens tipo C. ................................................. 16
Figura 7. Lesiones de tipo crónico causado por Clostridium perfringens tipo C. ........................ 16
Figura 8. Necrosis coagulativa de la mucosa intestinal (A) con elevado número de bacilos Gram
+ adheridos a la superficie (B)................................................................................................... 17
Figura 9. Edema de mesocolon y dilatación de ciego ................................................................ 19
Figura 10. Lesiones microscópicas asociadas a C. difficile. Exudado pseudomembranoso
compuesto por restos celulares. Lesiones tipo volcán ............................................................... 20
Figura 11. Mecanismos potenciales de patogénesis de rotavirus (RV)...................................... 23
Figura 12. Lesiones macroscópicas para RV. Intestino delgado distendido y con paredes flácidas
.................................................................................................................................................. 24
Figura 13. Lesiones microscópicas para RV. Vellosidades intestinales acortadas por la acción
citolítica de RV .......................................................................................................................... 25
Figura 14 Lesiones Macroscópicas asociadas a diarrea epidémica porcina .............................. 29
Figura 15. Lesiones microscópicas asociadas a coronavirus porcinos ...................................... 29
Figura 16. Atrofia de la vellosidad intestinal ............................................................................... 30
Figura 17. Lesiones macroscópicas asociadas a gastroenteritis trasmisible porcina. ................ 33
Figura 18. Frecuencia de agentes bacterianos asociados a diarreas neonatales ...................... 41
Figura 19. Frecuencia de agentes virales asociados a diarreas neonatales .............................. 42
Figura 20. Prevalencia de agentes bacterianos y virales ........................................................... 46
ABREVIATURAS
B: Bacteriología
C. perfringens: Clostridium perfringens
Cpa: Clostridium perfringens tipo A
Cpc: Clostridium perfringens tipo C
CPA: Toxina α
CPB: Toxina β
CDI: Clostridium difficile
Cv: Coronavirus
E. coli: Escherichia coli
EC: Enteritis Catarral
ECA: Enteritis Catarral con atrofia de las vellosidades
EHN: Enteritis Hemorrágica Necrotizante
ECEA: Escherichia coli enteroagregativa
ECET: Escherichia coli enterotoxigénica
ECEH: Escherichia coli enterohemorrágica
ECEI: Escherichia coli enteroinvasiva
ECEP: Escherichia coli enteropatogénica
Elisa: Ensayo Inmuno absorbente ligado a enzimas
GDH: Glutamato deshidrogenasa
H: Histopatología
IFA: Inmuno fluorescencia directa
FISH: Hibridación in situ
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
PCoV: Coronavirus porcino
RV: Rotavirus
RVA: Rotavirus tipo A
RVB: Rotavirus tipo B
RVC: Rotavirus tipo C
TGEV: Virus de la gastroenteritis porcina
DEPV: Virus de la diarrea epidémica porcina
RESUMEN
En las primeras semanas de vida, muchos lechones experimentan diarreas neonatales y es
un reto permanente diagnosticar la causa específica. El principal problema para el fracaso en el
diagnóstico definitivo es la escasa ausencia de lesiones patognomónicas y un fallo en el
aislamiento e identificación de algunos agentes infecciosos o no infecciosos. El objetivo de este
estudio fue definir la aproximación diagnóstica a los procesos diarreicos en esta especie y evaluar
la utilidad del uso combinado de varias herramientas diagnósticas para establecer un diagnóstico
etiológico correcto. Se realizó una búsqueda de los reportes anuales de los diagnósticos de
enteritis evaluados por histopatología (H) para comparar con los resultados obtenidos por
bacteriología (B) y biología molecular (PCR). Se analizaron 77 casos de enteritis en lechones.
Mediante el coeficiente de kappa con un intervalo de confianza del 95% se evaluó el grado de
concordancia entre las pruebas. Se obtuvo una concordancia entre H/B de k= 0.116 y k= 0,258
para E. coli y C. perfringens y la concordancia entre H/PCR fue k= 0,712 y k= 0,837 para rotavirus
y coronavirus porcinos. La frecuencia de lesiones analizadas por histopatología fue 45,9%
enteritis catarral, 33,3% enteritis hemorrágica necrótica y 48,2% enteritis catarral con atrofia de
las vellosidades. La prevalencia de patógenos entéricos fue E. coli 33,1%; C. perfringens 14,4%;
E. coli β-hemolítica 9,6%; Rotavirus A 17,4; diarrea epidémica porcina 4,2% y Rotavirus C 2,4%.
Los resultados de este estudio concluyeron que existe una discordancia entre pruebas
diagnósticas para la identificación de colibacilosis, probablemente el diagnostico se vio afectado
porque las enfermedades asociadas a colibacilosis no producen lesiones especificas en la
mucosa que permitan su valoración, por lo tanto, la sensibilidad se ve afectada.
Palabras claves: Diagnóstico; Diarreas neonatales; Índice de Kappa; Histopatología;
Bacteriología; PCR.
SUMMARY
In the first weeks of life, many piglets experience neonatal diarrhea and it is a continuous
challenge to diagnose the specific cause. The main problem for failure in the definitive diagnosis
is the limited absence of pathognomonic lesions and also an error in isolation and identification of
some infectious or non-infectious agents. The objective of this study is to define the diagnostic
approach to diarrheal processes in these species and to evaluate the usefulness of a combined
use of multiple diagnostic tools to establish a correct etiological diagnosis. A search of the annual
reports of enteritis diagnoses, evaluated by histopathology (H) to compare with the results
obtained by bacteriology (B) and molecular biology (PCR), was made. Seventy-seven cases of
enteritis in piglets were analyzed by using the Kappa Coefficient with a confidence interval of 95%,
the degree of agreement between the tests was evaluated. A concordance between H / B of k =
0.116 and k = 0.258 was obtained for E. coli and C. perfringens, and the agreement between H /
PCR was k = 0.712 and k = 0.837 for swine rotavirus and coronavirus. The lesions frequency
analyzed by histopathology was 45.9% catarrhal enteritis, 33.3% necrotic hemorrhagic enteritis
and 48.2% catarrhal enteritis with atrophy of the villi. The prevalence of enteric pathogens was E.
coli 33.1%, C. perfringens 14.4%, E. coli β- hemolytic 9.6%, Rotavirus A 17.4, swine epidemic
diarrhea 4.2% and Rotavirus C 2.4%.The results of this study concluded that there is a
disagreement between diagnostic tests for the identification of colibacillosis, the diagnosis was
probably affected since the diseases associated with colibacillosis do not produce specific lesions
in the mucous membrane that allows their assessing, therefore, the sensitivity seems to be
affected.
Keywords: Diagnosis, Neonatal diarrhea, Kappa index, Histopathology, bacteriology, PCR.
AGRADECIMIENTOS
En este aparatado quiero expresar mi inmensa gratitud a los laboratorios SIDAVE de la UDL
y al Centro de Saneamiento porcino (GSP) de Lleida, por permitirme realizar esta investigación
en especial a todo su personal, quienes me brindaron todas las facilidades para la investigación.
De la misma manera, agradezco a los doctores Jéssica Molín y Gustavo Ramírez quienes
asumieron esta responsabilidad como directores del presente trabajo de investigación. Gracias
por sus recomendaciones y explicaciones que me han permitido culminar con éxito la presente
investigación.
También quiero expresar mi gratitud a Anna Vilaró responsable del área de microbiología del
GSP, quien me brindó su apoyo permanente durante la investigación.
Y a todas las personas que de una u otra manera, me ayudaron con palabras de ánimo y
motivación.
Finalmente, mi eterna gratitud a la UDL, UNIZAR y UCM, quienes me aportaron con los
conocimientos necesarios, durante mi período de formación académica.
1 INTRODUCCIÓN
A nivel mundial los cerdos son la fuente más importante de proteína para el abastecimiento de
alimentos. Para satisfacer esta demanda, en la mayoría de países, especialmente en Europa,
ciertas enfermedades transfronterizas contagiosas han sido controladas e incluso erradicadas
(Weiguang et al., 2016). No obstante, en la actualidad existen enfermedades endémicas como la
diarrea neonatal, afección multifactorial que causa problemas en las explotaciones pecuarias al
generar pérdidas económicas por el incremento en la mortalidad, retraso en el crecimiento o por
retraso para alcanzar el peso ideal de sacrificio (Chan et al., 2013; Cruz et al., 2013; Jonach et
al., 2014; Weiguang et al., 2016).
Al nacimiento, el sistema inmunológico es inmaduro y la microbiota intestinal no se encuentra
bien desarrollada, por lo que se puede contraer una enfermedad entérica (Jonach et al., 2014).
En cerdos neonatos, las diarreas se producen antes del destete y son ocasionadas por factores
no infecciosos e infecciosos. Por ejemplo, el estrés, una nutrición inadecuada y un mal manejo
favorecen la aparición de un proceso patológico (Vidal et al., 2019). Además, patógenos como
virus, bacterias y parásitos ocasionan enteritis multifactoriales asociadas a Escherichia coli
enterotoxigénica (ECET), Clostridium perfringens tipo A (CpA), C (CpC) y Clostridium difficile
(CDI), rotavirus, coronavirus e Isospora Suis, los cuales pueden actuar de manera independiente
o combinada. (Cruz et al., 2013; Vidal et al., 2019).
Teniendo en cuenta lo anterior, es necesario la aplicación de métodos diagnósticos
diferenciales, que no solo permitan la identificación de un patógeno predominante, sino que
también identifiquen varios agentes causantes de diarreas (Mesonero-Escuredo et al., 2018; Vidal
et al., 2019).
El principal problema para el fracaso en el diagnóstico definitivo es la escasa ausencia de
lesiones patognomónicas y un fallo en el aislamiento e identificación de algunos agentes
infecciosos o no infecciosos (Torres-Leòn y Ramírez-Porras, 1999). Por esta razón, el diagnóstico
definitivo generalmente requiere el uso de varias técnicas diagnósticas como histopatología,
bacteriología y biología molecular.
La histopatología es una técnica que ayuda a diferenciar la interacción de uno o más
microorganismos patógenos, proporcionando una estimación relativa de cada uno de ellos. De
1
igual manera, permite evaluar la gravedad de las lesiones intestinales causadas por agentes
como coronavirus, rotavirus y otros, que producen cambios morfológicos en los tejidos, pese a
que las lesiones no son patognomónicas (Bergeland y Steven, 1982).
El cultivo bacteriológico permite el aislamiento y la identificación de las bacterias según su
capacidad de crecimiento en medios selectivos o diferenciales. Por consiguiente, el uso eficaz y
la interpretación correcta de los resultados obtenidos, hacen que la bacteriología sea una
herramienta útil para la detección de patógenos entéricos (Segalés et al., 2013).
Por su parte, las técnicas de biología molecular permiten detectar o cuantificar un patógeno
en una muestra determinada. Un agente infeccioso, es identificado basándose en la
secuenciación de un segmento específico de ácido nucleico de ADN o ARN. Las principales
técnicas utilizadas son: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR anidada (nPCR), PCR
con transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR múltiplex, PCR en tiempo real o cuantitativa (qPCR) e
hibridación in situ (HIS) (Segalés et al., 2013).
Existen muy pocos estudios relacionados con la evaluación del uso combinado de múltiples
herramientas diagnósticas para obtener un diagnóstico definitivo en caso de diarreas neonatales.
Este proyecto de investigación se centra en el diagnóstico de los procesos diarreicos en el ganado
porcino, con especial énfasis en el diagnóstico de las diarreas neonatales. El principal objetivo
del estudio es definir la aproximación diagnóstica a los procesos diarreicos en esta especie y
evaluar la utilidad del uso combinado de varias herramientas diagnósticas para establecer un
diagnóstico etiológico correcto.
2 ENFERMEDADES ENTÉRICAS EN LA ETAPA DE LACTACIÓN
Las patologías entéricas son un problema complejo para la producción porcina. Las diarreas
se producen cuando uno o más patógenos afectan el tracto gastrointestinal (TGI) produciendo
lesiones en el mismo, especialmente en el intestino delgado. La mucosa intestinal está formada
por dos estructuras conocidas como criptas y vellosidades intestinales, estas últimas favorecen
al proceso de digestión y la absorción del líquido de la luz intestinal; mientras que las criptas
cumplen con la función de secretar líquido hacia la luz del intestino y ayudan al recambio de las
células de las vellosidades que se desprenden normalmente o como consecuencia de una
2
enfermedad. En lechones recién nacidos cualquier alteración de la mucosa intestinal causa un
problema digestivo (Bergeland y Steven, 1982).
Tabla 1. Principales Agentes patógenos asociados a enfermedades en cerdos en etapa de lactación
Enfermedad Agente Cuadro clínico Muestra Diagnóstico
Colibacilosis E. coli Deshidratación,
estomago e
intestino distendido
con mucus y gas
Intestino
delgado y
grueso
Cultivo y PCR para
identificación de genes y
toxinas.
Histopatología
Clostridiosis C. perfringens
tipo A
Intestino flácido,
pared engrosada
con contenido
pastoso
Intestino
delgado
Raspado y tinción gran
Cultivo y PCR
identificación de toxinas
Histopatología
Clostridiosis C. perfringens
tipo C
Intestino
engrosado, de
color rojo parduzco
con contenido
Intestino
delgado
Raspado y tinción gran
Cultivo y PCR
identificación de toxinas
Histopatología
hemorrágico
Clostridiosis C. difficile Intestino con
contenido acuoso
a pastoso
amarillento y
Intestino
grueso
Raspado y tinción gran
Cultivo y PCR
identificación de toxinas
Histopatología
edema del
mesocolon
Coccidiosis C. suis Intestino con
membranas
Heces y/o
intestino
Flotación y/o frotis
Histopatología
fibronecróticas con
contenido líquido a
cremosos
delgado
Enteritis Virales Rotavirus
Coronavirus
Intestino flácido
con pared delgada
y contenido
Intestino
delgado
Histopatología
Elisa de captura
PCR
acuoso. Flóculos
de leche
Fuente: (Perfumo, Quiroga y Machuca, 2019)
Muchos lechones experimentan diarreas neonatales en las primeras semanas de vida y es un
reto permanente diagnosticar la causa de la mortalidad (Kongsted et al., 2018). Generalmente,
las diarreas se presentan de manera endémica, aunque también se pueden presentar como
brotes de alta morbilidad y mortalidad. El principal problema son los agentes infecciosos como
3
bacterias, parásitos y virus, que pueden actuar de manera independiente o combinada
produciendo diarreas neonatales (Tabla 1). En granjas afectadas se ha estimado que las pérdidas
económicas por diarreas neonatales son aproximadamente de 134 euros por cerda/año
(Mesonero-Escuredo et al., 2018).
2.1 Colibacilosis
2.1.1 Etiología
El principal microorganismo causante de diarreas colibacilares es Escherichia coli
enterotoxigénica (ECET). Esta bacteria coloniza el intestino pocas horas después del nacimiento
y es considerado como un microrganismo normal de la microbiota intestinal. Las cepas patógenas
son las principales responsables de causar daños en el tracto gastrointestinal, provocando un sin
número de enfermedades en los seres vivos, especialmente animales como los cerdos
(Mesonero-Escuredo et al., 2018; Rodríguez-Angeles, 2002) de la etapa de lactación y
posdestete (Dubreuil, Isaacson, & Schifferli, 2016; Rhouma et al. 2017; VinodhKumar et al. 2019).
Escherichia coli (E. coli) es un bacilo Gram negativo flagelado (Perfumo et al., 2019), anaerobio
facultativo, perteneciente a la familia Enterobacteriácea. La bacteria de E. coli tiene 176 antígenos
somáticos (O), 112 flagelares (H) y 60 capsulares (K) (Figura1). El serotipo está dado por el
antígeno somático y flagelar (O:H), mientras que el serogrupo por el antígeno (O). La
serotipificación de la bacteria determina el grupo patógeno al cual pertenece (Rodríguez-Angeles,
2002).
Se han identificado diversos patotipos de E. coli en función de la producción de toxinas,
factores de virulencia, interacción con la mucosa intestinal, cuadro clínico, epidemiología y
serotipos (O:H). Con base en el mecanismo de patogenicidad y cuadro clínico, se distinguen
varios grupos: E. coli enterotoxigénica (ECET), E. coli enteropatogénica (ECEP), E. coli
enterohemorrágica (ECEH), E. coli enteroinvasiva (ECEI), E. coli enteroagregativa (ECEA) ( Borie
et al. 1997; Vidal et al., 2019 ) y E. coli Verotoxigénica (ECVT) (García-Meniño et al., 2018)
4
Figura 1. Representación esquemática de una bacteria de E. coli
Fuente: (Fairbrother, 2015)
2.1.2 Epidemiología
Las cepas de Escherichia coli son las encargadas de provocar varios trastornos intestinales,
principalmente en cerdos neonatos, aunque ocasionalmente puede presentarse en la fase de
cebo o engorde (Sun & Kim, 2017; Toledo et al., 2012).
Existen diferentes patotipos de Escherichia coli, las cuales se han clasificado de acuerdo a la
producción de toxinas y factores de virulencia (Vidal et al., 2019).
Tabla 2. Clasificación de E. coli de acuerdo a la producción de toxinas y factores de virulencia
Nomenclatura Enfermedad Fimbria Toxina
E. coli enterotoxigénica
(ECET)
Diarrea Neonatal F5-F6-F41-F4 STa, STb- LT
E. coli enteropatogénica
ECEP
E. coli Verotoxigénica
ECTV
Fuente: (Hipra, 2019)
Diarrea Posdestete F4-F18 Sta – STb – LT - VT
Enfermedades Edemas F18 VT (Vt2e)
5
Las cepas de Escherichia coli enterotoxigénicas (ECET) causan diarrea acuosa en lechones
recién nacidos y destetados. Los aislados de ECET codifican las enterotoxinas estables al calor
(Sta o Stb) y termolábiles (LT) responsables de producir lo cuadros diarreicos en animales
infectados (García-Meniño et al., 2018; Vidal et al., 2020).
Este tipo de bacterias posee fimbrias (proteínas de superficie) que permiten la unión a los
receptores específicos de las células epiteliales de los enterocitos. En lechones destetados
actúan la fimbrias F4 (K88) y F18 (F107, 2134P, '8813'), mientras que en lechones neonatos
actúan los tipos fimbriales F5 (K99), F6 (987P) y F41 (Frydendahl, 2002).
Las cepas de E. coli enteropatógena (ECEP) en cerdos neonatos actúan con menor frecuencia
y en ocasiones producen diarreas neonatales (Sanmartín et al., 2017). Los aislados de ECEP
llevan una proteína de membrana externa conocida como intimina (Eae), la cual es la responsable
de la unión de la bacteria al epitelio intestinal del huésped provocando lesiones conocidas como
de “unión y borrado” estas lesiones se caracteriza por la pérdida de microvellosidades de la
mucosa intestinal (Frankel and Phillips 2008; García-Meniño et al. 2018).
La prevalencia encontrada varía dependiendo del lugar o zona en donde se aisló. Estudios
actuales revelan que la prevalencia de colibacilosis se ha incrementado en algunas regiones. Por
ejemplo, en Corea y República Checa se ha estimado que la prevalencias para ECET es del
61,3% (Do, Byun, & Lee, 2019) y 36,5% (Zajacova, Konstantinova, & Pavel, 2012). En España,
el patotipo más frecuente es ECEP 60,3% y con menor frecuencia ECET 38,8%. (García-Meniño
et al., 2018). La mortalidad oscila entre un 20% y la morbilidad varía entre un 20 a 40% (Perfumo
et al., 2019).
2.1.3 Patogenia
Escherichia coli enterotoxigénica se trasmite por contacto directo a través de las cerdas,
cerdos neonatos asintomáticos y lechones con diarrea (Dubreuil et al., 2016), pero la fuente más
común de infección parece ser la materia fecal de las salas de parición (Perfumo et al., 2019).
6
Figura 2. Mecanismo de acción de Escherichia coli enterotoxigénica
Fuente: (Fairbrother, 2015)
Al nacimiento, el estómago de los lechones posee un pH alcalino y la producción de enzimas
digestivas es deficiente, lo que favorece la infección por este tipo de bacterias. La diarrea en
lechones recién nacidos se presentan entre los 3 a 5 días (Dubreuil et al., 2016).
Las cepas patogénicas ingresan al animal por ingestión e inicia la replicación bacteriana,
seguidamente estas se adhieren al intestino delgado por medio de fimbrias de adhesión F4, F5,
F6 y F41 que producen varias enterotoxinas como STa, STb y/o LT y, finalmente, dichas cepas
inducen la enfermedad (Frydendahl, 2002).
Las fimbrias cumplen con la función de permitir la adhesión de los microorganismos a los
receptores específicos que se encuentran en los bordes de los enterocitos del intestino delgado.
Que la infección se produzca depende del grado de colonización y proliferación bacteriana. La
diarrea se produce cuando estas enterotoxinas cambian el equilibrio del agua y de los electrolitos
del intestino delgado. (Frydendahl, 2002). La secreción excesiva producida por este desequilibrio
lleva a la deshidratación, lo que provoca la muerte del animal (Luppi, 2017).
7
2.1.4 Signos clínicos
Los principales signos clínicos son diarrea acuosa de color blanco o amarillento,
deshidratación, disminución en el crecimiento, alta mortalidad y morbilidad (Hayakawa et al.,
2016; Sun & Kim, 2017).
2.1.5 Lesiones macroscópicas y microscópica
Macroscópicamente, se puede observar distensión del estómago con contenido lácteo
coagulado; el intestino delgado esta dilatado y la serosa congestionada; además, el contenido
intestinal tiene un pH alcalino y presenta una coloración amarillenta (Perfumo et al., 2019).
Figura 3. Lesiones macroscópicas asociadas a colibacilosis.
contenido color amarillento de aspecto espumoso
Fuente: (Ramis, 2011a)
Asas intestinales distendidas con
Microscópicamente, las cepas de E. coli enterotoxigénicas no producen lesiones
microscópicas. Sin embargo, la observación de las bacterias adheridas a la superficie del epitelio
es de valor diagnóstico (Perfumo et al., 2019).
8
Figura 4. Lesiones microscópicas asociado a colibacilosis. Adherencia bacteriana en enterocitos
Fuente: (Ramírez, 2018)
2.1.6 Diagnóstico e identificación.
Se basa en los signos clínicos, lesiones encontradas durante la necropsia y edad de los
animales afectados (Perfumo et al., 2019).
El cultivo bacteriológico es el método más utilizado para la identificación de patógenos
bacterianos responsables de colibacilosis (Canal, Cubillos, et al., 1999; Segalés et al., 2013). Este
requiere de cierto periodo en su realización y el crecimiento bacteriano depende de las
características de los medios de cultivos utilizados (Canal, Cubillos, et al., 1999).
Para el cultivo microbiológico, dependiendo de la sospecha clínica, se pueden utilizar muestras
provenientes de hisopos rectales o contenido intestinal. El aislamiento de E. coli se puede realizar
en medios selectivos de Agar sangre y McConkey, que favorecen el crecimiento bacteriano de
cepas de E. coli fermentadoras de lactosa y permite la diferenciación entre ellas de colonias
positivas y negativas (Luppi, 2017). La biotipificación se realiza por medio de pruebas bioquímicas
como la del indol (+), rojo de metilo (+), Voges Proskauer (-), citrato (-), SH2 (-) y ureasa (-) (Lazo
Pérez, 2010).
9
Los aislados de ECET tiene la capacidad de producir hemolisis. Por lo tanto, en cerdos
lactantes se pueden aislar cepas hemolíticas y no hemolíticas y en destetados solamente se
aíslan cepas no hemolíticas (Francis, 2002).
Para la confirmación de cepas patógenas se debe realizar un análisis fenotípico o genotípico.
La fenotipificación se hace a través del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o
por Inmunofluorescencia indirecta (IFA). El principal problema que presentan estas dos técnicas
es que los organismos cultivados no siempre pueden expresar fimbrias de adhesión, motivo por
el cual la sensibilidad se ve afectada (Francis, 2002).
El análisis genotípico se realiza a través de la reacción en cadena de la polimerasa múltiple
en tiempo real (RT-PCR). Este método diagnostico permite identificar genes de los factores de
virulencia, fimbrias (K88, K99, 987P, F18 y F41) y toxinas (LT, STa, STb y Stx2e) (Francis, 2002).
Parece ser la prueba más sensible y rápida para la detección y genotipificación de agentes
bacterianos (Béla & Péter, 2005). Si embargo, una desventaja que presenta esta herramienta
diagnóstica es que requiere de un personal capacitado con experiencia en la manipulación y
lectura de resultados (Francis, 2002).
Otra técnica utilizada es la hibridación in situ por fluorescencia (FISH). Es un método rápido y
fiable que permite la observación directa de las bacterias dentro de las muestras de tejidos fijados
(Amann, Fuchs & Behrens, 2001; Jonach et al. 2014).
La histopatología es una técnica que permite la observación directa de las bacterias adheridas
a las microvellosidades del epitelio, estas invaden la superficie de la membrana de las células
epiteliales y ocasionan un daño a la estructura de la mucosa (Canal, Cubilllos, et al., 1999;
Francis, 2002; Lazo Pérez, 2010; Perfumo et al., 2019).
2.2 Clostridiosis.
Los principales patógenos clostridiales entéricos son Clostridium perfringens tipo A y C y
Clostridium difficile (Songer & Uzal, 2005).
10
2.2.1 Clostridium Perfringens
Clostridium perfringens afecta al sistema digestivo de neonatos. Es un bacilo Gram positivo
anaerobio y tiene la capacidad de formar esporas, se encuentra presente en el suelo y contenido
intestinal de humanos y porcinos. En personas, ocasiona gangrena y enfermedades
gastrointestinales; mientras que en cerdos induce patologías digestivas, como diarrea y enteritis
hemorrágica y necrótica. De acuerdo con la tipificación (Tabla 3), las cepas de Clostridium
perfringens se han clasificado en cinco tipos (A, B, C, D y E) según la producción de distintas
toxinas: alfa, beta, épsilon y iota (α, β, ϵ y ι) (Ki et al., 2014; Morris & Fernández, 2009).
Tabla 3 Clasificación de C. perfringens por tipos y toxinas
Toxinas
Tipo de C.
Alfa Beta Epsilon Iota Enterotoxina Beta-2 Net B (net)
perfringens
(plc) (cpb) (etx) (iap) (cpe) (cpb2)
A + - - - +/- +/- +/-
B + + + - +/- +/- -
C + + - +/- +/- -
D + - + - +/- +/- -
E + - - + +/- +/- -
Fuente: (Otávio et al., 2015)
2.2.2 Clostridium perfringens tipo A (CpA)
2.2.2.1 Etiología.
Clostridium perfringens tipo A es un microorganismo normal del intestino de los porcinos, pero
cuando encuentra condiciones favorables para su replicación causa una enterocolitis necrótica y
produce daños en el duodeno y yeyuno (Otávio et al., 2015). Los cerdos afectados son aquellos
que se encuentran entre la primera semana de vida (Otávio et al. 2015; Chan et al. 2012). Esta
bacteria produce dos toxinas α y β2 (Perfumo et al., 2019; Ramis et al., 2011).
2.2.2.2 Epidemiología.
11
La enfermedad ha sido reportada a nivel mundial (Songer & Uzal, 2005) y produce una alta
morbilidad, pero una baja mortalidad de los cerdos lactantes (Jackson & Cockcroft, 2007). Las
cerdas son consideradas como la principal fuente de infección (Songer & Uzal, 2005), sin
embargo, durante los últimos años el diagnóstico por esta patología se ha incrementado (Chan
et al., 2012). Además, parece ser que la patogénesis no está del todo definida, lo que dificulta
estimar la verdadera prevalencia de este patógeno (Otávio et al. 2015; Salvarani et al. 2012 ).
Aunque, estudios realizados en Estados Unidos y España estimaron que el 48% y 89,9% de
diarreas fueron originadas por C. perfringens tipo A (Mesonero-Escuredo et al., 2018; Salvarani
et al., 2012).
2.2.2.3 Patogenia.
La patogenia de la diarrea no está definida porque los métodos de diagnóstico actuales no son
específicos y no han permitido discriminar de clostridios que se encuentran interactuando como
parte de la microbiota intestinal de animales sanos (Chan et al. 2012; Salvarani et al. 2012 ). No
obstante, es probable que la enfermedad tenga un origen multifactorial (Songer & Uzal, 2005).
2.2.2.4 Signos clínicos.
El principal signo clínico presente es la diarrea mucosa no hemorrágica en las primeras 48
horas de vida (Chan et al., 2012). En cerdos afectados por esta bacteria se produce una
disminución del peso, deshidratación y muerte de los animales, ocasionando pérdidas
económicas en la industria porcina (Songer & Uzal, 2005).
2.2.2.5 Lesiones macroscópicas y microscópicas.
Las lesiones más graves se presentan en el intestino delgado, yeyuno e íleon parcialmente.
Macroscópicamente se observa flacidez del intestino delgado, paredes delgadas con contenido
acuoso o gaseoso. Microscópicamente, las secciones intestinales exhiben necrosis de la mucosa
y atrofia de las vellosidades. En casos no agudos se puede observar pseudomembranas
fibrinosas (Songer & Uzal, 2005).
12
Figura 5. Lesiones macroscópicas asociadas a C. perfringens tipo A. Intestino delgado con enteritis
fibrinonecrótica.
Fuente: (Perfumo et al., 2019)
2.2.2.6 Diagnóstico e identificación.
Muchos signos clínicos son similares a otros patógenos entéricos, lo cual dificulta el
diagnóstico clínico. El resultado presuntivo saldrá de la combinación de varias pruebas
diagnósticas que permitan el aislamiento de Clostridium perfringens. Además, la ausencia de
lesiones histológicas ayuda a diferenciar de otras enfermedades entéricas que afectan el
intestino. (Otávio et al., 2015).
El aislamiento y la identificación se puede realizar a través de técnicas de cultivo
bacteriológico, PCR, espectrometría de masas y métodos de detección de toxinas, entre los
cuales están: la genotipificación por PCR, ensayos de citotoxicidad e inmunoensayos como
inmunodifusión y ELISA, sin embargo, todas estas pruebas diagnósticas presentan limitaciones
(Deprez, 2015).
El cultivo bacteriológico es considerado como una técnica de baja especificidad, dado que la
multiplicación bacteriana se ve afectada cuando el periodo desde la muerte del animal hasta la
toma de la muestra se retrasa, convirtiéndose en un sesgo de diagnóstico, motivo por el cual se
proporcionará un resultado dudoso. Además, el recuento bacteriano en el intestino determinará
la presencia o ausencia del mismo. Por lo tanto, el punto de corte sugerido esta entre 10 6 y 10 7
13
unidades formadoras de colonias por milímetro de contenido intestinal (Deprez, 2015; Valgaeren
et al., 2013).
Por otra parte, la identificación de la toxina carece de solidez diagnóstica porque la presencia
de bajas cantidades de la misma no garantiza que pueda inducir enfermedad. Por ejemplo, en
aves, se ha encontrado la toxina tanto en animales sanos como enfermos (Deprez, 2015).
La presencia de una lesión necrotizante y/o hemorrágica por histopatología no es una lesión
patognomónica, aunque en casos de lechones es altamente sugestiva de C. perfringens. El
diagnóstico definitivo requiere, por tanto, estudio microbiológico e identificación de toxinas por
PCR (Deprez, 2015).
2.2.3 Clostridium perfringens tipo C (CpC)
2.2.3.1 Etiología.
Clostridium perfringens tipo C, es una bacteria que produce dos toxinas α (CPA) y β (CPB)
que contienen en su interior dos genes denominados cpa y cpb, mismos que son utilizados para
la tipificación. También algunas cepas pueden portar el gen cpe, que codifica la enterotoxina
(CPE). La toxina β es la más letal, responsable de producir los efectos sistémicos y la enteritis
necrótica profunda en animales y humanos (Posthaus et al., 2020). Además, este microorganismo
puede colonizar después de procesos infecciosos ocasionados por los virus de la gastroenteritis
trasmisible porcina, diarrea epidémica y rotavirus (Songer & Uzal, 2005)
2.2.3.2 Epidemiología
Las diarreas producidas por este agente bacteriano se han reportado a nivel mundial,
ocasionando pérdidas económicas en la industria porcina. Es un patógeno que causa enteritis
necrótica principalmente en terneros, ovejas, cabras y porcinos neonatos (Posthaus et al. 2020;
Miclard et al. 2009).La tasa de morbilidad es del 100 % (Posthaus et al., 2020; P. Wang et al.,
2019) y su mortalidad es de un 50 a 60 % en granjas vacunadas (Perfumo et al., 2019; Ramis,
2017), pero en granjas no vacunadas la mortalidad puede llegar al 100%. Los lechones jóvenes
desde los primeros días de vida hasta las tres semanas de edad son los más vulnerables a esta
bacteria (Posthaus et al., 2020).
14
2.2.3.3 Patogenia.
La toxina β es considera como el principal factor de virulencia de la cepa de Clostridium
perfringens tipo C (Posthaus et al., 2020; P. Wang et al., 2019) y es la encargada de producir
necrosis vascular, hemorragia y posterior necrosis de los tejidos (P. Wang et al., 2019).
Lo cerdos neonatos debido a su falta de desarrollo de la flora intestinal son las más
susceptibles a la colonización bacteriana. La infección se inicia con la proliferación y colonización
excesiva del tracto gastrointestinal (TGI) por Clostridium perfringens tipo C. Una vez que las
toxinas bacterianas ingresan al TGI, pasan al sistema circulatorio y por el efecto letal que tienen
provocan la destrucción de la pared intestinal (Posthaus et al., 2020; Yan et al., 2019).
Posteriormente, llegan a los tejidos y al endotelio vascular por difusión, provocando la
retracción de los bordes celulares y finalmente la muerte celular. La rotura de la barrera endotelial
de la lámina propia y del yeyuno provoca el aumento de la permeabilidad vascular, edema y
hemorragia. La muerte de los animales probablemente se origina como una causa de la
destrucción masiva de la mucosa intestinal, por consiguiente, cualquier toxina presente en lumen
del intestino puede absorberse y actuar a nivel sistémico (Posthaus et al., 2020).
2.2.3.4 Signos clínicos
La aparición de los signos clínicos depende del estado inmune y edad de los animales y se
manifiesta a partir de los 2 a 3 días de edad. Se presentan cuadros clínicos hiperagudos, agudos,
subagudos y crónicos (Perfumo et al., 2019; Ramis, 2017).
En la forma hiperaguda, los lechones mueren a las 12 y 36 horas después del nacimiento,
presentan diarrea hemorrágica, debilidad y la temperatura rectal puede llegar a los 35 ºC
(Perfumo et al., 2019; Ramis, 2017).
En la forma aguda, los lechones sobreviven hasta después de haber manifestado los signos
clínicos. Presentan diarreas de coloración rojiza, perdida de condición corporal y debilidad
(Perfumo et al., 2019) .
15
En la forma subaguda, hay presencia de diarreas no hemorrágicas, la muerte se produce entre
los 5 a 7 días. Las heces presentan un aspecto líquido de color amarillo, aunque en ocasiones
puede presentarse decoloradas (Perfumo et al., 2019).
En la forma crónica, los lechones afectados presentan diarreas intermitentes de color amarillogrisáceo
con presencia de moco. Cabe indicar que estos lechones pueden morir después de
varias semanas y en el caso de que no se produzca la muerte, estos animales disminuyen su
tasa de crecimiento (Perfumo et al., 2019)
2.2.3.5 Lesiones macroscópicas y microscópicas
Macroscópicamente en la forma hiperaguda se caracteriza por presencia de un líquido
sanguinolento y hemorragias con burbujas de gas en la pared del intestino delgado. La forma
aguda se caracteriza por una severa enteritis necrohemorrágica, el intestino delgado se
encuentra engrosado e hiperémico, además, la superficie de la mucosa muestra una coloración
grisáceo-amarillento con contenido sanguíneo y restos de la mucosa necrótica. En la forma
subaguda, la pared intestinal presenta un engrosamiento y la mucosa se encuentra cubierta de
una membrana necrótica con una coloración grisáceo-amarillenta en la serosa. En la forma
crónica, la pared del intestino se halla engrosada en recorridos localizados y la mucosa presenta
material necrótico de color blanco-grisáceo (Perfumo et al., 2019; Ramis, 2011a).
Figura 6. Lesiones asociadas a Clostridium Figura 7. Lesiones de tipo crónico causado por
perfringens tipo C.
Clostridium perfringens tipo C.
Fuente:(Perfumo et al., 2019) Fuente:(Uzal & Songer 2019)
16
Microscópicamente se observa necrosis coagulativa de la mucosa con numerosos bacilos
Gram positivos (+) sobre la superficie de la misma. En función de la severidad las lesiones en la
mucosa se acompaña de necrosis y hemorragias transmurales de profundidad (Perfumo et al.,
2019; Ramis, 2011a).
A
B
Figura 8. Necrosis coagulativa de la mucosa intestinal (A) con elevado número de bacilos Gram +
adheridos a la superficie (B).
Fuente: (Ramírez, 2018)
2.2.3.6 Diagnóstico e identificación
El diagnóstico se basa en los signos clínicos y el historial anterior presentado en la granja
(Jackson & Cockcroft, 2007).
El cultivo bacteriológico identifica el patógeno mediante el aislamiento bacteriano y
genotipado, sin embargo, se debe tener en cuenta que en los casos crónicos el cultivo puede
resultar negativo (Ramis et al., 2011).
Otras técnicas utilizadas son: la PCR simple o multiplex para varias toxinas y Elisa de muestras
del contenido intestinal hemorrágico y fluido peritoneal, las cuales identifican la toxina β (Ramis
et al., 2011). No obstante, la PCR de toxina simple requiere de mucho tiempo y trabajo a diferencia
del PCR multiplex que es más rápida, pero puede tener perdida de sensibilidad en los resultados
finales (Albini et al., 2008).
Además, se puede utilizar la histopatología, la cual permite visualizar la presencia de bacilos
Gram positivos en cortes histológicos (Ramis et al., 2011). Histológicamente, en cuadros clínicos
hiperagudos a agudos las vellosidades del intestino se manifiestan con necrosis y una hemorragia
17
aguda extensa en la lámina propia subyacente, submucosa y muscular. En las vellosidades
necróticas se suelen observar un sin número de bacilos Gram positivos que cubren los contornos
(Posthaus et al., 2020).
2.2.4 Clostridium difficile (CDI)
2.2.4.1 Etiología.
Es un microorganismo anaerobio Gram (+) formador de esporas, está presente en humanos y
animales como el cerdo. Se dice que el cerdo es el reservorio natural de esta bacteria en el medio
ambiente (Alvarez-perez et al., 2009; Grzeskowiak et al., 2019) que afecta al tracto
gastrointestinal causando diarreas, lesiones necrotizantes, edema mesocolónico y colitis en
cerdos, terneros, perros, corderos y humanos, por lo tanto representa una zoonosis ( Grzéskowiak
et al., 2016; Baker et al., 2010; Yaeger et al., 2007).
2.2.4.2 Epidemiología.
Clostridium difficile afecta a cerdos de 1 a 7 días de edad. Las toxinas producidas por esta
bacteria no solo han sido identificadas en lechones lactantes, sino que también en cerdas
gestantes, lo que indica que estas probablemente son consideradas como la primera fuente de
infección hacia sus descendientes. (Grzeskowiak et al., 2019). La mortalidad puede llegar hasta
un 50% y su letalidad es del 100% de la población animal afectada (Perfumo et al., 2019).
La prevalencia de este patógeno todavía no está clara, ya que no se cuenta con datos precisos
que indique su presencia con relación a la edad de los animales que presentan cuadros clínicos
con o sin diarrea (Alvarez-perez et al., 2009). Sin embargo, algunos estudios realizados indican
que la prevalencia va desde el 51% (Pirs, Ocepek & Rupnik 2006), 52% (Yaeger, Kinyon &
Songer, 2007), y 77% en lechones y 21 % en cerdas adultas (Kyne et al., 2017).
2.2.4.3 Patogenia.
En humanos y animales la enfermedad se asocia a procedimientos que alteran la flora
bacteriana normal, especialmente con el uso indiscriminado de antibióticos. En cerdos esta
patología no ha sido descrito por el uso de este tipo de medicamentos (Yaeger et al., 2007).
18
En cerdos neonatos, la trasmisión sucede cuando la microflora intestinal no se ha establecido
en el tracto gastrointestinal durante los primeros cinco días posteriores al nacimiento. La falta de
colonización hace que los lechones sean susceptibles a la infección por C. difficile después del
parto. Probablemente, el contagio ocurre por la ingestión de esporas que se encuentran en el
ambiente de una sala de nacimiento contaminada (Knight, Squire & Riley, 2014).
La acción patógena está determinada por la producción de dos exotoxinas: la toxina A (TcdA)
enterotoxina y B (TcdB) citotoxina, las cuales son las responsables de producir un aumento de la
permeabilidad intestinal. La toxina A tiene un papel más notable que la B, debido a que esta causa
daño tisular y acumulación de líquidos (Poxton, Mccoubrey & Blair, 2001; Yaeger et al. 2007).
Además, produce un deterioro de las vellosidades y las membranas causando una erosión de la
mucosa (Poxton et al., 2001).
2.2.4.4 Signos clínicos.
Se observa diarrea profusa no hemorrágica pastosa amarillenta, muerte sin signos digestivos
(Knight et al., 2014; Perfumo et al., 2019). Cuando no presentan diarreas se puede observar
lechones constipados y en la necropsia exhiben colitis, tiflitis o edema mesocolónico (Knight et
al., 2014; Yaeger et al., 2007).
2.2.4.5 Lesiones macroscópicas y microscópicas.
Macroscópicamente se observa edema del mesocolon, presencia de fluido líquido de color
amarillo en el intestino grueso e hidrotórax (Serafín Gómez & Seva, 2011).
Figura 9. Edema de mesocolon y dilatación de ciego
19
Fuente: (Serafín Gómez & Seva, 2011)
Microscópicamente exhibe edema en la pared intestinal con presencia de células
mononucleares y neutrófilos. En el epitelio de la mucosa colónica se puede encontrar pequeños
segmentos de erosión y exudación de neutrófilos y fibrina, las cuales forman una lesión
característica conocida como “erupción de volcán” (Chan et al., 2013; Perfumo et al., 2019).
Figura 10. Lesiones microscópicas asociadas a C. difficile. Exudado pseudomembranoso compuesto
por restos celulares. Lesiones tipo volcán
Fuente: (Arruda, 2016; Serafín Gómez & Seva, 2011)
2.2.4.6 Diagnóstico e identificación.
Además, de los signos clínicos y lesiones presentes en la necropsia, el diagnóstico se realiza
a través del aislamiento bacteriano y la identificación de la toxina A y B por PCR-multiplex, ELISA
o inmunocromatográfica (Segalés et al., 2013).
Sin embargo, en la actualidad no se cuenta con técnicas claras y bien definidas de aislamiento
e identificación bacteriana. El método estándar utilizado en humanos y animales, es el aislamiento
de C. difficile seguido de la detección de genes que codifican las toxinas A y B. Aunque esta
técnica es muy laboriosa y requiere de mucho tiempo (Crobach et al., 2016; Ramos et al., 2020).
Otras técnicas utilizadas son los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) y dispositivos de
flujo lateral o directo, las cuales son pruebas basadas en la detección de anticuerpos de C.
20
difficile. Son rápidas, fáciles de realizar y económicas, a diferencia del cultivo bacteriológico que
requiere de más tiempo para su identificación (Ramos et al., 2020; Wilkins & Lyerly, 2003).
En el mercado existen varias pruebas dirigidas a la tipificación de la toxina A, combinación de
las dos toxinas y del antígeno común llamado glutamato deshidrogenasa (GDH). Este fue descrito
en 1980 y se encontró tanto en cepas toxigénicas y no toxigénicas. A partir de esta identificación,
se han elaborado kits comerciales para GDH, entre los cuales están los dispositivos de flujo lateral
incrustado de GDH y continuo con conjugados de enzimas (Ramos et al., 2020).
Por otro lado, los kits y el cultivo bacteriológico no distinguen entre estirpes patógenos y no
patógenos (Wilkins & Lyerly, 2003), aunque estudios recientes han mostrado que la prueba de
flujo lateral de GDH, muestra una especificidad del 100%, mientras que presenta una baja
sensibilidad para identificar la mezcla de toxinas A y B (Ramos et al., 2020).
La histopatología es una técnica que permite diferenciar entre agentes septicémicos y
entéricos que producen lesiones similares. Por lo tanto, lesiones clasificadas como colitis graves
son asociadas a Actinobacillus suis y C. perfringens tipo C; colitis moderadas a graves y colitis
con infiltrados de neutrófilos en lámina propia y lesiones erosivas se asocian con C. difficile. No
obstante, la identificación de una colitis supurativa y erosiva en lechones neonatales establece
una fuerte evidencia de la presencia de C. difficile (Yaeger et al., 2007).
2.3 Rotavirus (RV)
2.3.1 Etiología
El rotavirus es un patógeno viral perteneciente a la familia Reoviridae. Son virus tipo ARN sin
envoltura y posee un genoma segmentado, el mismo que está formado por once segmentos de
ARN bicatenario, codifica 6 proteínas estructurales (VP1 a VP4, VP6 y VP7) y no estructurales
(NSP1-NSP6). Las proteínas VP4 y VP7 de la cápside externa son las más importantes, pues
cumplen con la función de inducción de anticuerpos neutralizantes (Chandler-Bostock et al., 2014;
Theuns et al., 2016).
Existen varios grupos de rotavirus porcinos entre los cuales se encuentran: el A, B, C, E y H,
siendo el más habitual, el Rotavirus A (RVA) (Theuns et al., 2016; Vidal et al., 2019). El Rotavirus
21
B (RVB) y C (RVC) ha sido identificado con menor frecuencia (Marthaler et al., 2014; Theuns et
al., 2016).
2.3.2 Epidemiología
Los rotavirus en los porcinos han generado un impacto económico, ya que originan pérdidas
en la producción porcina. Mundialmente es el principal causante de infecciones entéricas, pues
afecta a cerdos y humanos, principalmente a niños, produciendo cuadros infecciosos de
gastroenteritis viral (Amimo et al., 2013; Vlasova et al., 2017).
Se ha estimado que la prevalencia mundial de diarreas ocasionadas por rotavirus es del 15%
(Muirhead & Aleexander, 1997) pero se ha encontrado diferencias considerables según la
ubicación geográfica y los métodos de diagnóstico utilizados (Cañon et al., 2017). Por ejemplo,
en estudios realizados en Nueva Zelanda, Canadá y Reino Unido se observaron prevalencias
que van desde 9% (Fu, 1988), 34% (Lachapelle et al., 2014) y 63% de infecciones por RVA
(Chandler-Bostock et al., 2014).
De la misma forma, la prevalencia para RVC ha sido descrita en Estados Unidos y Canadá en
un 78% en cerdos menores a tres días y 65% en cerdos de 4 a 20 días de edad (Marthaler et al.,
2013). Además, por RT-qPCR para rotavirus se encontró que el 33% y 53% de las muestras
analizadas correspondían para RVB y RVC respectivamente (Marthaler et al., 2014). Pese a que
la morbilidad es alta, la mortalidad es baja y se incrementa cuando las infecciones de rotavirus
se asocien con otras enfermedades entéricas (Ramis et al., 2011)
2.3.3 Patogenia
Los cerdos recién nacidos son los más susceptibles a la infección dado que la tasa de
renovación de enterocitos es lenta (Almeida et al., 2018). Una vez que el virus ingresa por la vía
oral inicia la replicación viral en los enterocitos del colon, ciego y en el citoplasma de las células
epiteliales de la vellosidad intestinal, especialmente, en yeyuno e íleon ocasionando lisis celular.
Como consecuencia de ese fenómeno se produce el acortamiento y atrofia de las vellosidades
que es un lesión histológica característica de rotavirus (Ramis, 2019).
22
El acortamiento y atrofia de las vellosidades produce una disminución en la actividad de la
enzima disacaridasa, esta deficiencia ocasiona la retención de disacáridos en la luz intestinal con
hiperosmolaridad, también induce una alteración de la actividad Na + k + ATPsa y una mala
absorción de la glucosa, lo que provoca una diarrea osmótica (Perfumo et al., 2019; Ramis, 2019).
Figura 11. Mecanismos potenciales de patogénesis de rotavirus (RV)
Fuente: (Vlasova et al., 2017)
2.3.4 Signos clínicos
Los cerdos lactantes son susceptibles a la infección viral antes del destete. Los signos clínicos
aparecen entre las 19 a 24 horas postinfección ( Almeida et al., 2018; Chandler-Bostock et al.
2014). Producen diarreas severas con posterior deshidratación en la etapas de lactación y
posdestete ( Wenske et al., 2018; Ramis, 2019).
23
2.3.5 Lesiones macroscópicas y microscópicas
Macroscópicamente el intestino se presenta dilatado y repleto de contenido líquido de color
amarillo a gris. La paredes intestinales están delgadas y en el interior del estómago contiene
leche sin digerir (Ramis, 2019).
Figura 12. Lesiones macroscópicas para RV. Intestino delgado distendido y con paredes flácidas
Fuente: (Ramis, 2019)
Microscópicamente se observa citólisis celular con presencia de células epiteliales cuboides a
planas en la vellosidad, acortamiento de las vellosidades, vacuolación epitelial y descamación del
intestino delgado (Almeida et al., 2018). Se dice que la relación de la vellosidad/profundidad de
la cripta permitirá diferenciar de otros organismos como virus de la diarrea epidémica y
gastroenteritis trasmisible porcina o de bacterias como E. coli y C. perfringens (Ramis, 2019).
24
Figura 13. Lesiones microscópicas para RV. Vellosidades intestinales acortadas por la acción citolítica
de RV
Fuente: (Ramis, 2019)
2.3.6 Diagnóstico e identificación
El diagnóstico clínico es muy difícil de proporcionar porque los cuadros clínicos son
indiferenciables con otros virus y bacterias (Ramis, 2019). El diagnóstico definitivo se debe
realizar a través de los síntomas, historia clínica de la granja y uso de distintas técnicas de
laboratorio.
Existen varias pruebas diagnósticas para la identificación de los rotavirus entre las cuales se
puede mencionar: aglutinación de látex, microarrays, microscopía electrónica, secuenciación del
genoma, amplificación por PCR, inmunoensayo enzimático (EIA) y aislamiento de virus en cultivo
celular (Almeida et al., 2018; Otto et al., 2015).
El inmunoensayo enzimático es el método más simple y económico para la identificación de
rotavirus, sin embargo, hoy en día los métodos moleculares han ganado importancia, debido a
que estas pruebas son rápidas, específicas y sensibles, proporcionando la base para el
genotipado de cepas de RVA y también facilitando la detección de cepas de RV de tipos B y C
(Otto et al., 2015).
Otra técnica utilizada es la microscopía electrónica, la cual revela la presencia de Rotavirus
(RV). Una desventaja que exhibe esta prueba diagnóstica es que no distingue entre las cepas de
RV, además presenta una baja sensibilidad y especificidad. En el mercado se puede encontrar
kits comerciales los cuales solo detectan RVA (Marthaler et al. 2014).
25
Igualmente, se puede utilizar la RT-PCR convencional, es una excelente prueba para el
diagnóstico, pero requieren de mucho tiempo para su identificación y son poco sensibles. Por tal
motivo, en la actualidad se ha desarrollado una PCR de transcripción inversa en tiempo real
multiplex (RT-qPCR). La RT- qPCR es el método más sensible y permite la diferenciación entre
los distintos tipos de rotavirus (Marthaler et al., 2014).
De la misma manera, se puede utilizar la inmunohistoquímica (IHC), la cual permite asociar la
lesión histológica con el agente, esto la hace muy específica para la identificación. La ICH
identifica la presencia del virus por medio de la tinción en el citoplasma de los enterocitos. La
tinción es más penetrante en la porción media y distal del intestino delgado, aunque se puede
hallar enterocitos positivos a RV en el colon y ciego. La desventaja de esta prueba es que requiere
de anticuerpos específicos, por la diversidad de rotavirus que causan problemas diarreicos
(Almeida et al., 2018).
La histopatología identifica las lesiones histológicas en el intestino. En el examen
histopatológico se observa una reducción entre la relación de la longitud de la vellosidad con la
cripta, pérdida y fusión de vellosidades, células en forma de cubo o planas en las puntas de las
vellosidades, vacuolización epitelial y descamación (Almeida et al., 2018; Ramis, 2019). Mientras
que en infecciones provocadas por Rotavirus tipo C se observan lesiones de enteritis hemorrágica
y necrotizante (Theuns et al., 2016).
Sin embargo, se debe tener en cuenta que los signos clínicos y las lesiones histopatológicas
son casi similares para TGEV y DEPV, por lo tanto se requiere la combinación de otras pruebas
complementarias que ayuden a la identificación y diagnóstico definitivo de RV (Cooper, 2000;
Ramis, 2019).
2.4 Diarreas por coronavirus de porcinos (PCoV)
Los coronavirus, causa un sin número de enfermedades (respiratorias, entéricas y
generalizadas), principalmente en los porcinos y la especie humana, afectando a varios órganos,
fundamentalmente los aparatos digestivo y respiratorio (Antas & Woźniakowski, 2019; Lin et al.,
2015). Son los principales causantes de las diarreas virales en lechones. Ocasionan grandes
pérdidas económicas en las industrias porcinas. Los agentes que provocan esta patología son:
el virus de la gastroenteritis trasmisible (TGEV) y el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV).
Además, presentan síntomas clínicos y cuadros patológicos similares, lo cual dificulta su
26
diagnóstico (Le lou et al., 2020; Zhao et al., 2019).También se ha demostrado que la TGEV está
presente en infecciones combinadas con la PEDV (Guo et al., 2020).
2.4.1 Virus de la Diarrea epidémica porcina (PEDV)
2.4.1.1 Etiología.
Pertenece a la familia Coronaviridae y posee un genoma viral de tipo ARN monocatenario. El
ARN genómico del virus de la PEDV contiene siete marcos de lectura abierta (ORF), cuya función
es la codificación de proteínas virales. ORF 1a y ORF 1b codifica la polimerasa viral, mientras
que ORF 3 codifica una proteína estructural de función desconocida, por lo tanto, esta proteína
está relacionada con la patogenicidad viral. Así mismo, existen otros ORF con nombres
específicos que actúan de acuerdo con las proteínas que se encuentran en determinada región,
como en las proteínas de espiga (S), matriz (M) y nucleocápside (N) (Antas & Woźniakowski
2019; Song, Moon, & Kang 2015).
De todas las proteínas virales, la proteína S es considerada como la más antigénica y
sustancial, porque es la responsable de la interacción con las moléculas del receptor celular del
huésped. Esta interacción es transcendental para la entrada del virus y está relacionada con la
inducción de anticuerpos neutralizantes frente a la diarrea epidémica porcina (Song, Moon, &
Kang 2015). Además, la proteína S es utilizada para la identificación del virus por biología
molecular. La proteína M interviene en el proceso de ensamblaje e induce la producción de
anticuerpos neutralizantes contra el virus. La proteína N cumple con la función de interactuar con
el ARN y se une con otras proteínas para proteger el genoma viral. Finalmente, la proteína E tiene
un papel vital durante la gemación del coronavirus (Antas & Woźniakowski, 2019; Song & Park,
2012).
2.4.1.2 Epidemiología.
La diarrea epidémica porcina es una enfermedad infecciosa, afecta a porcinos de todas las
edades. El PEDV infecta las células epiteliales, especialmente del intestino e induce diarrea
aguda, vómitos y deshidratación, por lo tanto, provoca una alta mortalidad y morbilidad de
lechones lactantes. La gravedad de los síntomas clínicos está relacionado con la edad de los
animales, siendo los más afectados los cerdos jóvenes (Luo et al., 2020).
27
Varios países de Europa, Asia y América han informado la presencia del PEDV (Zhang et al.,
2019). Durante los años 2013 y 2015 en los Estados Unidos, la epidemia del PEDV provoco la
pérdida de casi 7 millones de cerdos ( Antas & Woźniakowski, 2019; Jung & Saif, 2015).
La trasmisión del virus se produce a través de varias fuentes de infección y una deficiente
bioseguridad. Por ejemplo, camiones contaminados, botas sucias, ingreso de reproductores
enfermos y otro tipo de fómites son factores de riesgo que pueden desencadenar la enfermedad
(Perfumo et al. 2019; Antas & Woźniakowski, 2019; Ramírez, 2014).
2.4.1.3 Patogenia.
Una vez que el virus ingresa a través de la ingestión de heces o alimentos contaminados por
la vía oral se produce la replicación viral en el citoplasma de las células epiteliales de las
vellosidades del intestino delgado y, en menor proporción, en el colón, produciendo una
degeneración de los enterocitos con el acortamiento de las vellosidades del intestino, lo que da
lugar a la atrofia y fusión de las vellosidades, provocando la reducción de la absorción de la
superficie intestinal. Como consecuencia de esta disminución, se produce la perdida de líquido,
deshidratación y muerte de los cerdos afectados (Antas & Woźniakowski, 2019; Perfumo et al.,
2019 ).
2.4.1.4 Signos clínicos.
Los signos clínicos se manifiestan entre 1 a 3 días postinfección (Perfumo et al., 2019). Los
principales signos son diarrea acuosa, deshidratación, anorexia y vómitos. El grado de severidad
de la enfermedad depende de la edad de los animales y el estado inmunológico (Antas &
Woźniakowski, 2019; Piñeros & Mogollón, 2015).
2.4.1.5 Lesiones macroscópicas y microscópicas.
Macroscópicamente se puede apreciar el estómago distendido con fragmentos de leche no
digerida, las paredes del intestino se muestran delgadas y transparentes (Antas & Woźniakowski,
2019; Song & Park, 2012).
28
Figura 14 Lesiones Macroscópicas asociadas a diarrea epidémica porcina
Fuente: (Ramis, 2011b)
Microscópicamente se puede apreciar vacuolización de las células epiteliales, descamación
celular, fusión y reducción de las vellosidades intestinales (Piñeros & Mogollón, 2015; Stevenson
et al., 2013).
Figura 15. Lesiones microscópicas asociadas a coronavirus porcinos
Fuente: (Stevenson et al., 2013)
29
Figura 16. Atrofia de la vellosidad intestinal
Fuente: (Stevenson et al., 2013)
2.4.1.6 Diagnóstico e identificación
La identificación etiológica del PEDV se debe realizar por medio de pruebas de laboratorio, ya
que las manifestaciones clínicas no son signos patognomónicos de esta patología. Para un
diagnóstico definitivo se debe utilizar diagnósticos complementarios que permitan diferenciar de
otros agentes patógenos (Antas & Woźniakowski, 2019; Pospischil, Stuedli, & Kiupel, 2002).
Se puede utilizar las pruebas de anticuerpos fluorescentes e inmunohistoquímica para detectar
antígenos de PEDV de muestras de intestino delgado de cerdos con cuadros diarreicos agudos.
Parecen ser los métodos más rápidos y sensibles (Ishikawa et al. 1997; Pospischil, Stuedli, &
Kiupel, 2002), sin embargo, existen estudios que mencionan que estas técnicas y otras pruebas
complementarias como microscopia electrónica directa, ensayos inmunoabsorbentes ligados a
enzimas (ELISA) no son rápidos y además presentan baja especificidad y sensibilidad (Song &
Park 2012b). El ELISA es una prueba directa que permite determinar la presencia de anticuerpos
o antígenos en suero o en heces (Antas & Woźniakowski, 2019; Pospischil et al., 2002).
Otra técnica utilizada es la reacción de la cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-
PCR). Es un método altamente específico para el PEDV e identifica el gen directamente de las
30
muestras. Esta prueba es muy sensible, porque a partir de un fluido de cultivo celular, infectado
con una baja carga viral, el fragmento de ARN se amplifica (Ishikawa et al., 1997; D. Song & Park,
2012b). Además, existen otras variantes de la PCR como RT-PCR dúplex que diferencia entre
PEDV y TGEV, RT-PCR multiplex que detecta PEDV en presencia de otros virus (Kim, Song &
Park, 2001; Dae S Song et al. 2006; Song & Park, 2012a).
La histopatología es una técnica utilizada para la identificación de este tipo de patógenos, la
cual determina la presencia del PEDV, a través de los cambios vacuolares hidrópicos presentes
en las vellosidades intestinales en su tercio superior (Piñeros & Galvis 2015). Su principal
inconveniente es que no permite diferenciar del TGEV, ya que en ambos casos las lesiones son
similares.
2.4.2 Virus de la Gastroenteritis trasmisible (TGEV)
2.4.2.1 Etiología.
El TGEV es un coronavirus representativo del género Alphacoronavirus perteneciente a la
familia Coroniviridae y se caracteriza porque su genoma viral está formado por ARN (G. Wang et
al., 2019; Lin et al., 2015), tiene una envoltura lipídica, mide aproximadamente 160 nm y sus
espículas le dan la característica forma de corona (Rodríguez Batista, Barrera Valle, & Betancourt
Martell, 2005).
2.4.2.2 Epidemiología.
Se encuentra distribuido a nivel mundial, generando pérdidas económicas en la industria
porcina. Los porcinos de todas las edades son susceptibles de contraer esta patología. Presenta
una tasa de mortalidad del 100% en lechones neonatos menores de 2 semanas de vida ( G.
Wang et al. 2019; Xia et al. 2018), pero algunos cerdos mayores a 5 semanas sobreviven a la
infección y los cerdos adultos presentan una enfermedad leve (Xia et al., 2018). El TGEV se
trasmite a través de la ruta oral-fecal (Lin et al., 2015).
El virus puede sobrevivir a bajas temperaturas, por lo cual se presenta durante el invierno. Se
reconoce dos formas de presentación: endémica y epidémica. La forma endémica se presenta
en granjas seropositivas, como derivación de un cuadro epidemiológico y la forma epidémica
31
afecta, generalmente, a granjas seronegativas (Perfumo et al., 2019; Rodríguez Batista et al.,
2005).
2.4.2.3 Patogenia.
El virus ingresa por la vía oral y afecta al epitelio del intestino delgado, multiplicándose
rápidamente en lechones neonatos. Una vez terminada la replicación viral, se destruye el epitelio
de las vellosidades intestinales con degeneración y aparición de células epiteliales inmaduras.
Como consecuencia, resulta la atrofia de las vellosidades en el yeyuno y en menor proporción en
el íleon, con consiguiente mala absorción y una alteración de los procesos digestivos. Cuando le
leche es ingerida por los cerdos esta no se hidroliza ni se absorbe y se origina el incremento de
la presión osmótica que retiene líquido en la luz intestinal produciendo diarrea, deshidratación y
desequilibrio electrolítico (Perfumo et al. 2019; Rodríguez, Barrera & Betancourt, 2005).
2.4.2.4 Signos clínicos.
Los signos clínicos son similares al PEDV, cuyo diagnóstico se hace indistinguible (Lin et al.,
2015). Causa diarrea severa, vomito, deshidratación y pérdida de peso (Perfumo et al., 2019; Xia
et al., 2018; Lin et al., 2015).
2.4.2.5 Lesiones macroscópicas y microscópicas.
Macroscópicamente, se puede observar presencia de leche sin digerir, intestino dilatado con
contenido lácteo de aspecto cremoso amarillento. Microscópicamente, se observa atrofia de las
vellosidades con vacuolización del epitelio y descamación (Perfumo et al. 2019; Rodríguez,
Barrera, & Betancourt 2005).
32
Figura 17. Lesiones macroscópicas asociadas a gastroenteritis trasmisible porcina.
Fuente: (Perfumo et al., 2019; Ramis, 2011c)
2.4.2.6 Diagnóstico e identificación.
El diagnóstico se realiza a través de la sintomatología clínica (Perfumo et al., 2019), sin
embargo, las manifestaciones clínicas, epidemiológicas y patológicas similares con el delta
coronavirus porcino (PDCoV) y PEDV han dificultado su diagnóstico (Jung, Hu & Saif, 2016).
Además, se debe tener en cuenta que algunos cerdos infectados por otros coronavirus
respiratorios eliminan el virus a través de las heces, pudiendo confundir el resultado (Vemulapalli,
Gulani & Santrich, 2009). Por tal motivo, se requiere del uso de varias pruebas combinadas para
un diagnóstico definitivo (Vemulapalli et al., 2009).
Para la identificación del TGEV existen varios métodos diagnósticos, como la microscopia
electrónica (ME), prueba de anticuerpos fluorescentes (FAT) e inmunohistoquímica (Kim & Chae,
2001).
En la actualidad para la detección de TGEV y otros virus entéricos como PEDV y Rotavirus se
utiliza la PCR inversa de transcripción múltiplex. Es una prueba rápida, sensible y de menor costo,
a diferencia de otras pruebas diagnósticas (Salem et al., 2010; D. S. Song et al., 2006b). La
principal ventaja es que permite, en simultaneo, identificar y diferenciar entre TGEV, PED y RVA
(D. S. Song et al., 2006b).
Así mismo, se puede utilizar a la histopatología como una prueba complementaria. Esta técnica
muestra las lesiones provocadas por TGEV en el intestino delgado y se observa la vacuolización
de las células epiteliales con descamación celular y en ocasiones con formación de sincitios.
33
Además, se aprecia la reducción y fusión de las vellosidades. Los cambios descritos en TGEV
son similares en PEDV, pero son menos severos (Piñeros & Mogollón Galvis, 2015).
La principal desventaja que presenta esta técnica es que no permite la diferenciación entre
TGEV y PED porque las lesiones causadas no son específicas y el diagnóstico se vuelve
dificultoso, por lo tanto, para su identificación requerirá de otras pruebas diagnósticas
complementarias. Como alternativas a la histopatología se puede utilizar la hibridación in situ o
la inmunohistoquímica, que permiten identificar el tipo de células infectadas con una alta
especificidad y sensibilidad (Kim & Chae, 2001).
34
3 OBJETIVOS
Este Trabajo Final de Master se centra en el diagnóstico de los procesos diarreicos en el
ganado porcino, con especial énfasis en las diarreas neonatales. El objetivo principal del estudio
es definir la aproximación diagnóstica a los procesos diarreicos en esta especie.
Para alcanzar este objetivo se ha planteado los siguientes objetivos específicos:
1) Evaluar la utilidad del uso combinado de varias herramientas diagnósticas para establecer
un diagnóstico etiológico correcto.
2) Analizar las lesiones histopatológicas más frecuentes que acompañan a las diferentes
enteritis bacterianas y víricas en esta especie.
3) Examinar la prevalencia observada para cada uno de los agentes etiológicos implicados
en los casos recibidos de la zona.
35
4 MATERIALES Y MÉTODOS
El estudio se llevó a cabo en colaboración con el SCT de Investigación y Diagnóstico
Anatomopatológico Veterinaria (SIDAVE) de la UdL y el Centro de Saneamiento Porcino (GSP)
de Lleida.
Para realizar el estudio se recopilo de forma retrospectiva y prospectiva todos los casos de
diarrea porcina recibidos en ambos servicios, desde el año 2018 hasta el 2020. De cada caso se
compararon los resultados obtenidos entre la histopatología y bacteriología (H/B) e histopatología
y PCR (H/PCR).
4.1 Selección de casos y recopilación de datos
Los reportes anuales encontrados se establecieron de acuerdo al diagnósticos por casos;
definiendo como “casos” a un problema de salud intestinal de cerdos pertenecientes a la etapa
de lactancia, sea de manera individual o de población. De 110 casos estudiados, 77 casos fueron
examinados como sospechosos de diarreas neonatales.
Para el diagnóstico histopatológico se utilizó el término “compatible” cuando las lesiones
microscópicas son características en el tejido intestinal, donde muchos de los rasgos son
relacionados con uno o varios agentes patógenos.
Para el aislamiento bacteriológico se utilizó el término “crecimiento” cuando se identificó la
presencia de la bacteria en el cultivo microbiológico utilizado.
Para el diagnóstico de biología molecular se utilizó el término “positivo” o “negativo” cuando
las muestras analizadas detectaron un segmento específico de ácido nucleico (ADN o ARN) de
un determinado patógeno infeccioso.
Se recolectaron los datos en función de los resultados obtenidos por la historia clínica,
diagnóstico anatomopatológico, aislamiento bacteriano de E. coli y C. perfringens e identificación
molecular de Rotavirus tipo A, C, PEDV y TGEV.
36
4.2 Métodos de diagnóstico
4.2.1 Histopatología
Se utilizaron muestras de duodeno, yeyuno, íleon y colon. Estas muestras fueron fijadas en
formalina tamponada neutra al 10% por 48 horas. Después, las muestras fueron incrustadas en
cera de parafina, se cortaron 3 µm para teñirse con hematoxilina-eosina, para, finalmente,
observar en el microscopio óptico y evaluar las lesiones histopatológicas en mucosa intestinal.
En lesiones de tipo catarral, la atrofia de las vellosidades se registró cuando se observó un
acortamiento de las mismas, con disminución en la altura de los enterocitos y un incremento en
la celularidad de la lámina propia. La hiperplasia de las criptas fue registrada cuando estas
sobrellevaron un alargamiento. En casos relacionados con enteritis necrótica hemorrágica se
reconoció por los cambios necróticos en el epitelio y lamina propia de la mucosa del tracto
digestivo analizado.
La interpretación de resultados asociados a colibacilosis, se basó en la observación de enteritis
catarral (EC), más la adherencia de bacterias en las vellosidades del epitelio del intestino. Los
diagnósticos para clostridiosis se obtuvieron por la observación de enteritis hemorrágica necrótica
(EHN) de la mucosa intestinal junto a la presencia de bacilos largos. La confirmación de rotavirus
y coronavirus se estableció en la identificación de enteritis catarral con atrofia de las vellosidades
(ECA).
4.2.2 Bacteriología
Para el cultivo bacteriológico se utilizaron muestras de intestino, contenido intestinal o hisopo
de contenido intestinal. Para el crecimiento de Escherichia coli se emplearon el Agar Sangre,
MacConkey o XLD, mientras que para Clostridium perfringens se aplicó un medio selectivo
diferencial, Agar TSC. Todas las placas fueron incubadas a 37ºC en condiciones de aerobiosis
con un 5% de CO2, durante 48h.
La primera lectura de placas se realizó a las 24h y la segunda lectura a las 48h. Las placas de
TSC se incubaron a 40-42ºC durante 48h. Cabe señalar que la identificación bacteriana, se
realizó con el sistema de espectrometría de masas MALDI-TOF Biotyper (Bruker Daltonics).
37
4.2.3 Virología
Para la amplificación y extracción utilizaron muestras de contenido intestinal, hisopo del
contenido o directamente del intestino. Para la extracción emplearon el Kit comercial: MagMAX
CORE Nucleic Acid Purification Kit (Thermofisher científic) y utilizaron el extractor KingFisher flex
96. La amplificación, la realizaron con el kit comercial: Thermo Fisher scientific: para DEPV, TGE,
RVA y Salmonella y Exopol para RVC. En todos ellos, los resultados obtenidos son cualitativos
(positivo o negativo).
4.3 Análisis de datos
Para el análisis, los datos fueron procesados y tabulados en una hoja de cálculo Microsoft
Excel y se utilizó el estadístico de Kappa con un intervalo de confianza (IC) del 95%. El Kappa,
determina el grado de concordancia entre las pruebas utilizadas de histopatología con
bacteriología y PCR. Los resultados obtenidos se analizaron en el software libre WinEpi de la
Universidad de Zaragoza (De Blas, 2006). Además, se analizaron las lesiones más frecuentes
que acompañan a las diferentes enteritis y se calculó la prevalencia de los agentes patógenos de
los casos estudiados.
La interpretación del estadístico de kappa se realizó de acuerdo a la siguiente escala: valores
≤ 0,20 (concordancia leve), 0,21 - 0,40 (concordancia regular), 0,41 – 0,60 (concordancia
moderada), 0,61 – 0,80 (concordancia adecuada) y ≥ 0,80 (concordancia excelente) (Díaz et al.,
2017; Gilchrist, 2009; Landis & Koch, 1977)
38
5 RESULTADOS
5.1 Comparación de métodos diagnósticos
En la Tabla 4 se muestra el total de diagnósticos analizados durante los años 2018 a 2020 en
los laboratorios SIDAVE y GSP, observándose que la mayor cantidad de casos examinados
corresponden a E. coli, seguido de Rotavirus, DEPV, TGE y C. perfringens respectivamente.
Tabla 4. Muestras totales del diagnóstico etiológico de Histopatología (H), bacteriología (B) y reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) en cerdos de lactación.
Diagnostico
solicitado
2018 2019 2020 Total
H+B (E. coli) 31 30 13 74
H+B C. perfringens 13 18 5 36
H+PCR
DEPV, TGE
Rotavirus,
18 28 10 56
Total 62 76 28 166
En la Tabla 5 y 6 se observan los resultados compatibles y/o positivos obtenidos entre los análisis
de histopatología (H) frente a bacteriología (B) y PCR respectivamente.
Tabla 5. Resumen de los resultados extraídos de las tablas cruzadas para agentes patógenos
bacterianos analizados por histopatología (H) y bacteriología (B).
Agente etiológico
H/B
-/-
Resultados
Escherichia coli 5 35 0 34
H/B
-/+
H/B
+/-
H/B
+/+
Clostridium perfringens 9 14 1 12
Nota: Resultado de la prueba: (-) negativo, (+) positivo, en la columna cinco se observa el número de casos
coincidentes para las dos pruebas analizadas.
39
Tabla 6. Resumen de los resultados extraídos de las tablas cruzadas para agentes patógenos virales
analizados por histopatología (H) y técnicas moleculares (PCR).
Agente etiológico
H/PCR
-/-
H/PCR
-/+
Resultados
H/PCR
Rotavirus 21 6 2 27
Coronavirus porcino 48 1 1 6
+/-
H/PCR
Nota: Resultado de la prueba: (-) negativo, (+) positivo, en la columna cinco se observa el número de
casos coincidentes para las dos pruebas analizadas.
+/+
En la Tabla 7 el estadístico de Kappa (k) indica la concordancia entre H/B e H/PCR de las
lesiones que sugieren diagnósticos compatibles con agentes patógenos bacterianos y virales. Los
análisis realizados entre H/PCR presentan los mejores resultados. En los exámenes
diagnosticados para patógenos asociados a coronavirus porcinos (PCoV), el índice de kappa fue
k= 0,837 (concordancia excelente), mientras que en casos relacionados a rotavirus (RV), fue k =
0,712 (concordancia adecuada).
Si embargo, el estadístico de kappa varía en los casos diagnosticados entre H/B para
clostridiosis y colibacilosis. En cuanto a los resultados obtenidos para clostridiosis, el índice de
kappa fue k = 0,258 (concordancia regular), a diferencia de los resultados obtenidos para
colibacilosis, los cuales obtuvieron el coeficiente más bajo k = 0,116 (concordancia leve) entre
las dos pruebas.
Tabla 7. Grado de concordancia con un intervalo de confianza al 95% de las diferentes pruebas
evaluadas en los laboratorios del SIDAVE Y GSP.
Resultados Valores de Kappa Significancia
H/B Escherichia coli 0,116 concordancia leve o insuficiente
H/B Clostridium perfringens 0,258 concordancia regular
H/PCR Rotavirus 0,712 concordancia adecuada
H/PCR PCoV 0,837 concordancia excelente
Nota: Histopatología (H), Bacteriología (B) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
40
La Figura 18 y Figura 19 contienen los resultados de las pruebas diagnósticas por los
laboratorios SIDAVE y GSP durante los años 2018 hasta 2020. De un total de 77 casos, 74 fueron
asociados a Escherichia coli, 34 de ellos en el examen histopatológico estuvieron relacionados a
Colibacilosis 45,9%, por otro lado, en cultivo bacteriano hubo crecimiento de E. coli en 69 casos
correspondiente al 93,2%. Por otra parte, en 36 casos analizados para patógenos clostridiales,
12 por histopatología eran compatibles con clostridiosis 33,3%, mientras que por bacteriología en
25 casos se aisló C. perfringens 69,4%.
100
93,2
Frecuencia(%)
80
60
40
20
45,9
33,3
69,4
0
E. coli C. perfringens
Casos (+) (B) Casos (+) (H)
Agentes etiológicos
Figura 18. Frecuencia de agentes bacterianos asociados a diarreas neonatales
En lo que se refiere a la presentación de Rotavirus (RV) y coronavirus en porcinos (PCoV) en
la Figura 19 se indica la frecuencia de participación de los mismos. Por histopatología, de un total
de 56 casos examinados para RV y PCoV se identificaron 27 casos 48,2% compatibles con RV,
mientras que por PCR 33 casos 58,9% eran positivos. Además, en el examen histopatológico 6
casos 10,7% estaban asociados a PCoV, en cambio 7 casos 12,5% en PCR fueron positivos.
41
80
Frecuencia(%)
60
40
20
48.2
58.9
10.7
12.5
0
RV PCoV
Casos (+) (PCR) Casos (+) (H)
Agentes etiológicos
Figura 19. Frecuencia de agentes virales asociados a diarreas neonatales
5.2 Lesiones histopatológicas
La Tabla 8 muestra las lesiones microscópicas encontradas y asociadas con las diferentes
patologías, tanto víricas como bacteriológicas. El examen histológico del intestino delgado reveló
que el patrón de enteritis catarral con atrofia de las vellosidades (ECA) es más predominante para
Rotavirus 48,2%. En los casos relacionadas con enfermedades compatibles con coronavirus
porcino el 10,7% fueron lesiones de tipo catarral con atrofia de las vellosidades.
El 45,9% de lesiones de enteritis catarral (EC) en las cuales se observa la presencia de la
bacteria adherida a los enterocitos correspondieron a colibacilosis, seguido del 33,3% de enteritis
hemorrágico necrotizantes (EHN) asociadas a Clostridios.
42
Tabla 8 Frecuencia de presentación de los distintos patrones de lesiones compatibles con infección de
agentes bacterianos y víricos en relación con el resultado de Bacteriología y PCR
Enfermedad
Patrón de lesión
Positivos
totales
Porcentaje
Colibacilosis Enteritis Catarral (EC) 34 / 74 45,9
Clostridiosis
Diarrea por Rotavirus
Diarrea epidémica vírica
Enteritis hemorrágico necrotizante
(EHN)
Enteritis Catarral (con/sin atrofia de las
vellosidades) (ECA)
Enteritis Catarral (con atrofia de las
vellosidades)
%
12 / 36 33,3
27/56 48,2
6/56 10,7
En relación con el grado de cronicidad y severidad asociado al patrón de lesiones (Tabla 9),
se pudo observar que las lesiones de tipo catarral presentaron un grado de cronicidad subagudo
47,1%, agudo 17,7%, crónico 5,8% y solo el 2,9% se encontraban entre agudo-subagudo.
En lesiones de tipo hemorrágico-necrotizante, el 41,6% presentaron un grado de cronicidad
subagudo, seguido del 25% entre agudo-subagudo y 16,6% agudos asociados a enfermedades
compatibles con C. perfringens.
Además, en lesiones de tipo catarral con atrofia de las vellosidades, el 51,6% fue subagudo
seguido del 9,7% entre agudo-subagudo y 3,2% respectivamente para el crónico.
Tabla 9. Frecuencia de lesiones de acuerdo al grado de cronicidad identificados por histopatología.
Cronicidad
Lesión
G0
G1
G2
G3
G4
Enfermedad
% (n) % (n) % (n) % (n) %(n)
EC (34) 26,5 (9) 17,7 (6) 2,9 (1) 47,1 (16) 5,9 (2) Colibacilosis
EHN (12) 16,7 (2) 16,7 (2) 25 (3) 41,6 (5) - Clostridiosis
ECA (31) 35,4 (11) - 9,7 (3) 51,6 (16) 3,2 (1) Rotavirus/Coronavirus
Nota: Grado 0 (G0) = Ausencia, Grado 1 (G1) = Agudo, Grado 2 (G2) = Agudo-Subagudo, Grado 3 (G3) =
Subagudo, Grado 4 (G4) = Crónico
43
Con respecto al grado de severidad Tabla 10 se observa que las lesiones de tipo catarral
asociados a colibacilosis predominan los grados de severidad moderado 29,4%, leve 26,4% y
leve-moderado 20,5%. Los valores más bajos se presentaron en los grados severo e intenso con
un 5,8% y 2,9% respectivamente para cada uno de ellos.
En enteritis con patrones hemorrágico necrotizantes, los grados de severidad que más
prevalecieron corresponde a moderado, moderado-intenso con valores similares para ambos
25%. Además, se encontró valores semejantes para el grado intenso y severo de los casos
analizados 16,7%.
Por otra parte, en lesiones catarrales con atrofia de las vellosidades predominaron los grados
leves 22,7%, moderado 25,8%, leve-moderado 16,1%, seguido con el 9,7% para el grado severo
y 6,5% para el intenso.
Tabla 10. Frecuencia de lesiones de acuerdo al grado de severidad identificados por histopatología
Severidad
Lesiones
G0
G1
G2
G3
G4
G5
G6
Enfermedad
% (n) % (n) % (n) % (n) % (n) % (n) % (n)
EC (34) 2,9 (1) 26,4 (9) 20,5 (7) 29,4 (10) 11,7 (4) 2,9 (1) 5,8(2) Colibacilosis
EHN (12) 8,3 (1) - 8,3 (1) 25 (3) 25 (3) 16,7 (2) 16,7 (2) Clostridiosis
ECA (31) 16,1 (5) 22,7 (7) 16,1 (5) 25,8 (8) 3,2 (1) 6,5 (2) 9,7 (3) Rotavirus/
Coronavirus
Nota: Grado 0 = Ausencia, Grado 1 (G1) = Leve, Grado 2 (G2) = Leve-Moderado, Grado 3 (G3) = Moderado, Grado
4 (G4) = Moderado-intenso, Grado 5 (G5) = Intenso, Grado 6 (G6) = Severo
44
5.3 Prevalencia de patógenos entéricos asociados a diarreas neonatales
Tabla 11. Prevalencia de patógenos entéricos
Agentes Muestras (+)
% (n)
Agentes bacterianos
Escherichia coli 33,1 (55)
Clostridium perfringens 14,5 (24)
Escherichia coli β-hemolítica 9,6 (16)
Agentes virales
Rotavirus tipo A 17,5 (29)
DEPV 4,2 (7)
Rotavirus tipo C 2,4 (4)
Nota: Prevalencia de patógenos entéricos diagnosticados en muestras de lechones diarreicos (n=166)
de 77 casos analizados
La prevalencia de patógenos entéricos asociados a diarreas neonatales del presente estudio
demostraron que existe una proporción muy variada en cada uno de los casos evaluados. Los
patógenos bacterianos más frecuentes encontrados fueron: Escherichia coli, Clostridium
perfringens, E coli β-hemolítica. En referencia a los agentes virales el más frecuente fue Rotavirus
tipo A y los menos frecuentes fueron diarrea epidémica porcina y Rotavirus C (Tabla 11).
En la Figura 20 se presenta la prevalencia de los casos analizados por cultivo bacteriológico
y PCR de agentes bacterianos y virales. Dentro de los agentes bacterianos identificados
Escherichia coli presento la prevalencia más alta 33,1%, seguido de Clostridium perfringens
14,5% y Escherichia coli β-hemolítica 9,6%.
Entre los agentes virales analizados por PCR, RVA 17,5% fue el patógeno predominante, le
sigue PEDV con 4,21% y finalmente RVC con una proporción menor de 2,4%.
45
40
33.1
Frecuencia(%)
30
20
10
14.5
9.6
17.5
4.2
2.4
0
Ec Cp Ech RVA DEPV RVC
Agentes Bacterianos Agentes Virales
Prevalencia
Figura 20. Prevalencia de agentes bacterianos y virales
Nota: Ec= E. coli, Cp= C. perfringens, Ech= E. coli β-hemolítica, Rotavirus A= RVA, DEV= Virus de la
diarrea epidémica porcina, Rotavirus C= RVC
46
6 DISCUSIÓN
6.1 Comparación de métodos diagnósticos
El uso combinado de varias técnicas diagnósticas como histopatología, bacteriología y PCR
es necesario para obtener diagnósticos etiológicos definitivos de forma fiable más confiables y
evaluar la gravedad de lo distintos procesos.
El estadístico de kappa permite evaluar el grado de concordancia entre las pruebas utilizadas.
Valores altos de (k) indican que existe una precisión entre las pruebas utilizadas, sin embargo,
cuando se obtiene valor bajos de (k) indican una disconformidad entre pruebas, debido a que
algunos resultados podrían ser falsos positivos o falsos negativos (Carrisoza Urbina, 2015)
La sensibilidad y especificidad pueden verse afectados por diversos factores que disminuyen
la precisión del diagnóstico. Por ejemplo, factores como una mala toma de muestras, un medio
de transporte inadecuado, retraso en el procesamiento de muestras conllevan a dar un
diagnostico erróneo (Carrisoza Urbina, 2015).
Torres-Leòn & Ramírez-Porras (1999) menciona que el principal problema para el fracaso en
los diagnósticos es la escasa ausencia de lesiones patognomónicas y un fallo del aislamiento e
identificación de algunos agentes infecciosos o no infecciosos.
En este estudio, los análisis realizados entre H/PCR presentan los mejores resultados. Sin
embargo, el estadístico de kappa varia en los casos diagnosticados entre H/B para clostridios y
colibacilosis.
6.1.1 Escherichia coli
El principal hallazgo es que la concordancia entre H/B fue insuficiente k= 0,118 para E. coli,
de los 74 casos analizados solo 45,9% de casos coinciden entre histopatología y bacteriología.
Probablemente la baja prevalencia observada en el estudio histopatológico pudo verse
afectado, porque las cepas de Escherichia coli no producen lesiones microscópicas
características que permiten identificar la bacteria.
47
Esta afirmación se puede ver reflejada en un estudio experimental realizado por Canal et al.
(1999), cuando utilizaron cerdos infectados con cepas de E. coli y posteriormente realizaron el
examen histopatológico evidenciando que los segmentos intestinales analizados no presentaban
lesiones patognomónicas. Sin embargo, se pudo observar la presencia de bacterias adheridas a
las vellosidades intestinales, principalmente en el íleon. Esto permitió concluir que la
histopatología es un buen método diagnóstico pese a la dificultad que presenta, sin embargo esta
técnica puede mejorar al combinarse con otras pruebas diagnósticas (Canal et al. 1999). Otro
estudio realizado en Brasil utilizo la histopatología y bacteriología como criterios diagnósticos para
E. coli e indicó que los resultados obtenidos son de poca relevancia si no se utiliza la
genotipificación y serotipificación, que determinen si las cepas que intervienen en los procesos
diarreicos son de tipo patogénica o no patogénica (Almeida et al., 2018).
Luppi (2017) sostiene que las cepas patógenas no justifican la enfermedad en todos los casos
porque los patotipos de E. coli también pueden ser aislados de la microflora intestinal de animales
sanos. Por tal motivo, la alta concentración de E. coli patógena en cultivo puro o casi aislado del
yeyuno e íleon, es un indicativo de colibacilosis. Por lo tanto, la evaluación de los diagnósticos
debe basarse sobre las observaciones clínicas y patológicas más la cuantificación de E. coli
patogénica aislada.
6.1.2 Clostridium perfringens
En cuanto a los resultados obtenidos para clostridios el índice de kappa fue k= 0,258 lo que
indica que la concordancia entre pruebas diagnósticas es regular. Por lo tanto, existe una
variación entre los resultados obtenidos.
Posiblemente este efecto es el resultado del crecimiento bacteriano, no solo de clostridios
patógenos, sino que también de comensales como el C. perfringens tipo A y otros, los cuales
forman parte de la flora intestinal. La bacteriología no permite distinguir entre ellos (Cruz et al.,
2013; Kongsted et al., 2018; Vidal et al., 2019), lo que conllevaría al incremento de la prevalencia
en el cultivo bacteriológico.
Por este motivo, el hallazgo de C. perfringens por sí solo no es suficiente para proporcionar un
diagnóstico definitivo de clostridiosis (Posthaus et al., 2020). Además, algunos estudios en donde
se ha encontrado Clostridium perfringens tipo A, este no parece estar asociado a diarreas
48
neonatales, ya que es un microorganismo que se encuentra en la microbiota normal de los
animales (Cruz et al., 2013; Kongsted et al., 2018; Larsson et al., 2015) Sin embargo, por varios
años ha sido relacionado como un agente sospechoso de diarreas neonatales, pero hasta la
actualidad no hay un estudio que, de manera concluyente, respalde esta afirmación (Kongsted et
al., 2018)
Del mismo modo, se ha observado que la cuantificación de las unidades formadoras de
colonias de C. perfringens tipo A no guardan una relación directa con la presencia de diarreas
neonatales. Por lo tanto, es fundamental detectar la presencia de otros patógenos que puedan
estar causando coinfecciones (Cruz et al., 2013)
Por otra parte, la valoración de las lesiones macroscópicas y microscópicas por histopatología
permitirán evaluar las lesiones características asociadas a enfermedades clostridiales,
observándose una gran cantidad de bacilos alrededor de las vellosidades necróticas. Además,
en la lámina propia y la submucosa se puede observar trombosis y necrosis de pequeños vasos
de manera constante, que son características propias de este tipo de enteritis (Posthaus et al.,
2020). Por lo tanto, la histopatología en este caso es de un alto valor diagnóstico porque permitirá
diferenciar si un proceso diarreico está asociado a C. perfringens aislado en bacteriología.
6.1.3 Rotavirus, Coronavirus de porcinos
En los casos diagnosticados para agentes infecciosos asociados a coronavirus porcinos
(PCoV), el estadístico de Kappa presento un coeficiente k= 0,837 (concordancia excelente),
mientras que en casos compatibles a rotavirus (RV) el coeficiente fue k= 0,712 (concordancia
adecuada).
Lo resultados encontrados en este estudio se atribuyen a la alta sensibilidad que presenta la
RT-qPCR multiplex, que permite la diferenciación entre rotavirus y coronavirus. (Marthaler et al.,
2014; D. S. Song et al., 2006b).
Además, la histopatología es una herramienta útil para la valoración de lesiones de tipo catarral
con atrofia de las vellosidades. Perfumo et al. (2019), manifiesta que las lesiones características
asociadas a rotavirus es la atrofia de las vellosidades, con hiperplasia celular en las criptas
49
intestinales. Estudios preliminares muestran que el virus ataca a las células epiteliales del
intestino delgado, causando atrofia extensa de las vellosidades (Crouch & Woode, 1978).
Sin embargo, la histopatología no permite la diferenciación entre TGEV y PED porque las
lesiones causadas no son específicas y el diagnóstico se vuelve dificultoso, por lo tanto, para su
identificación requerirá de otras pruebas diagnósticas complementarias. Como alternativas a la
histopatología se puede utilizar la hibridación in situ o la inmunohistoquímica, que permiten
identificar el tipo de células infectadas con una alta especificidad y sensibilidad (Kim & Chae,
2001).
6.2 Lesiones histopatológicas
6.2.1 Lesiones asociadas a colibacilosis
El examen histológico indica en general lesiones catarrales, principalmente subagudas de
severidad variable, principalmente leve a moderado. Estos resultados se ajustan con otro estudio
previo, en el cual encontraron principalmente lesiones de enteritis catarral de carácter leve y
moderado en vellosidades, lamina propia y submucosa. Además, las lesiones encontradas en
ese estudio variaron de acuerdo a la cepa de E. coli y al sitio afectado durante la infección,
observándose lesiones más severas para E. coli con fimbrias de adhesión F4 y F6 y leves por F5
y F41. Igualmente, la identificación de fimbrias F4, F5, F6 y F41 constituyen un hallazgo
importante, ya que estas fimbrias permite la adhesión y colonización de la bacteria que
posteriormente inducen las diarreas (Canal, Cubilllos, et al., 1999).
6.2.2 Lesiones asociadas a clostridios
Clostridium perfringens en cerdos provoca enfermedades digestivas, como diarrea y enteritis
hemorrágica y necrótica (Ki et al., 2014; Morris & Fernández, 2009).
Los resultados de este estudio indican principalmente lesiones hemorrágicas necrotizantes
subagudas de carácter moderado a intenso, lo que concuerda con algunos autores que describen
a las enteritis necrotizantes como agudas, subagudas y crónicas, especialmente lesiones
asociadas a C. perfringens tipo C (Ki et al., 2014; Posthaus et al., 2020; Springer & Selbitz,
1999).Sin embargo, en lesiones producidas por C. perfringens tipo A se observa una enteritis
catarral serosa (Songer & Uzal, 2005; Springer & Selbitz, 1999). Además, lesiones de colitis
clasificadas como moderadas a graves, son asociadas a Clostridium difficile (Yaeger et al., 2007).
50
Posthaus et al. (2020) indicaron que microscópicamente las vellosidades del intestino delgado
presentan necrosis y una hemorragia aguda de la lámina propia, submucosa y muscular.
Alrededor de las vellosidades necróticas se localizan grandes cantidades de bacilos gram
positivos característicos de lesiones asociadas a clostridiosis.
6.2.3 Lesiones asociadas a Rotavirus/Coronavirus
En relación a las lesiones provocadas por rotavirus y coronavirus, el presente estudio encontró
lesiones de enteritis catarral subaguda de carácter principalmente leve o moderado, o más
raramente severo, con atrofia de las vellosidades.
Estudios anteriores demuestran que en enfermedades compatibles con RV se observa
lesiones de tipo catarral con atrofia y fusión severa de las vellosidades, presencia de restos
celulares en lámina propia, vacuolización epitelial y descamación del epitelio en el intestino
delgado (Almeida et al. 2018; Crouch & Woode, 1978), sin embargo, la atrofia de las vellosidades
y la vacuolización epitelial son lesiones que pueden ser detectadas en otras patologías entéricas
como en el coronavirus de los porcinos (TGEV, DEPV) (Jubb, Kennedy & Palmer’s, 2016).
Además, otros estudios demuestran la participación de estos microorganismos de manera
combinada, por lo cual el diagnóstico se ve afectado (Almeida et al., 2018; Jia et al., 2019), motivo
por el cual, ante una sospecha de rotavirus y coronavirus se debe utilizar diagnósticos
complementarios que permitan una detección diferencial.
6.3 Prevalencia de enfermedades entéricas
6.3.1 Escherichia coli
Existe una gran cantidad de bacterias relacionadas con diarreas en lechones, pero E. coli es
la principal causante de problemas diarreicos tanto en animales y humanos (Kaper, Nataro, &
Mobley, 2004; Mesonero-Escuredo et al., 2018). Sin embargo, las cepas causantes de problemas
diarreicos más frecuente son la cepas de E. Coli enterotoxigénica (Rodríguez-Angeles, 2002).
Las fimbrias más importantes y asociadas a las diarreas son F4, F5, F6 y F41(Canal, Cubilllos, et
al., 1999; Vidal et al., 2019). Las cepas de E. coli enterotoxigénicas tiene la capacidad de producir
51
hemolisis. Por lo tanto, en cerdos lactantes se pueden aislar cepas de E. coli hemolíticas y no
hemolíticas, mientras que en cerdos destetados solo se pueden aislar cepas de E. coli no
hemolítica (Francis, 2002).
El presente estudio muestra que la mayoría de casos analizados son positivos para E. Coli no
hemolítica 33,1% y solo el 9,6% fueron positivos para E. coli β-hemolítica, a diferencia de
Kongsted et al. (2018), en Dinamarca, quienes reportan una prevalencia superior para E. coli no
hemolítica 47% e inferior para E. coli β-hemolítica 6 %. Vidal et al. (2019), en cambio observaron
que las cepas de E. coli enterotoxigénica fueron aisladas con menor frecuencia en lechones con
diarrea o sin diarrea. Las variaciones de la prevalencia en los diferentes estudios probablemente
están relacionados con la implementación en granjas de programas vacunales exitosos, que han
permitido disminuir la prevalencia de E. coli enterotoxigénica (Kongsted et al., 2018; Vidal et al.,
2019). En la actualidad, las vacunas que se encuentran en el mercado contienen fimbrias de
Escherichia coli y toxoides como LT y cuando estas son aplicadas a los animales previene la
infección provocada por cepas patógenas de E. coli (Vidal et al., 2019).
6.3.2 Clostridium perfringens
En relación al Clostridium perfringens, este estudio muestra una prevalencia de 14,5%. Otros
estudios relacionados indican una prevalencia superior. Un estudio realizado en China utilizando
la PCR multiplex evidencio que el 81% de cerdos con diarrea fueron diagnosticados positivos
para Clostridium perfringens tipo A (Ki et al., 2014). Sin embargo, C. perfringens tipo A es un
patógeno ubicuo que también puede causar problemas digestivos y el diagnóstico puede ser
dudoso, dado que no se puede distinguir cepas comensales de patógenas (Vidal et al., 2019). Se
sabe que la toxina alfa y beta producidas por C. perfringens se relacionan con la producción de
enfermedades entéricas como diarreas o enteritis hemorrágicas necrotizantes (Baker et al., 2010;
Ki et al., 2014).
La toxina β2 y la enterotoxina se describen como los principales factores de virulencia de
Clostridium perfringens tipo A, aunque su participación es muy controvertida y algunos autores la
han asociados con problemas digestivos, otros mencionan que la toxina β2 se puede encontrar
no solo en animales enfermos, sino que también en sanos (Vidal et al., 2019).
En cuanto al C. perfringens tipo C, estudios realizados en España han encontrado que la
prevalencia es muy baja, probablemente por la vacunación de las cerdas antes del parto con la
52
vacuna de toxoide beta que previene la infección (Mesonero-Escuredo et al., 2018; Vidal et al.,
2019).
6.3.3 Rotavirus, Coronavirus de porcinos
La diarrea causada por rotavirus, es la infección viral más frecuente en cerdos neonatales y
causa problemas de diarrea. El RVA es el más relacionado con este tipo de problemas, aunque
no se descarta la participación de otros rotavirus como el B y C (Amimo et al., 2013; Marthaler et
al., 2014; Mesonero-Escuredo et al., 2018).
Con respecto a los rotavirus, el RVA presenta una alta prevalencia en diferentes estudios
realizados. Las prevalencias encontradas son: 9% (Vidal et al., 2019), 23,6% (Medici et al., 2011),
43,1% (Mesonero-Escuredo et al., 2018), 62% (Marthaler et al., 2014) y 67,3 % (Katsuda et al.,
2006). El presente estudio indica una baja prevalencia para RVA 17,5% y RVC 2,4% en
comparación a los otros estudios reportados.
En relación al rotavirus C, las prevalencias varían entre estudios realizados. Se ha encontrado
prevalencias desde bajas, del 3,5% y 6,6% (Medici et al., 2011; Tuanthap et al., 2018 ), hasta del
53% (Marthaler et al. 2014). Además, este patógeno epidemiológicamente es importante en la
población porcina en animales de 1 a 20 días de edad (Marthaler et al., 2014). Estudios
preliminares describieron la importancia que tiene los rotavirus tipo B y C y se los relaciona como
los principales causantes de diarreas en lechones lactantes. Sin embargo, pocos estudios
incluyen a estos patógenos (Medici et al., 2011).
Por otro lado, la prevalencia encontrada en el presente estudio para PEDV fue de 4,7%, así
mismo, en un estudio realizado en España se encontró una prevalencia del 3,7% para PEDV
(Mesonero-Escuredo et al., 2018), lo que indica que la prevalencias observadas en estos estudios
son muy similares. Además, en Europa se ha podido observar que luego de los brotes vividos
entre la década de los ochenta y noventa, cuando la situación de PEDV era endémica, esta
disminuyó con el pasar de los años. A partir del año 2000, se cree que la mayoría de poblaciones
porcinas de muchos países se han convertido en seronegativas (Pensaert & Martelli, 2016), sin
embargo, en el 2013 se introdujo en Norte América provocando una alta mortalidad en la
población porcina, generando pérdidas económicas en la industria (Carvajal et al., 2015).
53
En el presente estudio no se detectó TEGV. El TEGV es una enfermedad que causa problemas
en la mayoría de ganaderías productoras de porcinos. Sin embargo, en Europa se han observado
solo brotes esporádicos porque existe la probabilidad de una protección inmunológica cruzada
provocada por los coronavirus respiratorios porcinos (PRCV), que aparentemente son ubicuos en
el continente (Mesonero-Escuredo et al., 2018; Vidal et al., 2019). Por lo tanto, en la actualidad,
las diarreas por este microorganismo viral son poco frecuentes (Vidal et al., 2019).
54
7 CONCLUSIONES
1. Respecto al índice de concordancia:
a. Este estudio demostró que el índice de concordancia entre histopatología y
PCR para el diagnóstico de rotavirus y coronavirus porcinos es adecuado y
excelente para cada uno respectivamente.
b. El índice de concordancia entre histopatología y bacteriología para Escherichia
coli es insuficiente. Probablemente el resultado obtenido es porque Escherichia
coli no produce lesiones especificas en la mucosa que permitan su valoración,
por lo tanto, la sensibilidad se vio afectada.
c. La concordancia entre histopatología y bacteriología para Clostridium
perfringens es regular. Posiblemente los clostridios identificados en
bacteriología no solo son patógenos, sino que también son comensales.
2. La histopatología como herramienta diagnostica permite deducir el grado de cronicidad
y severidad de las lesiones, evaluar las estructuras afectadas y sugerir por el hallazgo
de lesiones patológicas la posible participación de agentes bacterianos o virales.
3. La prevalencia estudiada indica que Escherichia coli no hemolítica y Rotavirus A son
los principales patógenos asociados a diarreas neonatales, seguido de Clostridium
perfringens y Escherichia coli β-hemolítica. Sin embargo, el estudio muestra una baja
prevalencia para diarrea epidémica porcina y ausencia de gastroenteritis trasmisible
porcina.
55
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