caracterización de lacasas producidas por un hongo termofílico ...

El cromatograma de actividad permitió determinar el volumen de separación (Ve)
con lo que se pudo estimar en condiciones nativas, el peso molecular aparente de la
lacasa 2 al interpolar en la curva estándar de pesos moleculares. El peso molecular
estimado, fue aparente porque la preparación, denominada lacasa 2 estaba
parcialmente pura.
5.9. Isoelectroenfoque
Las fracciones de la 13 a la 19 correspondientes al pico de actividad en la
cromatografía de filtración en gel, se juntaron (35 mL) y dializaron con membranas de
12–14,000 Da durante 12 horas con 3 cambios de agua destilada. Los 35 mL de
muestra dializada se colocaron en una probeta de 100 mL, se les adicionó 2 mL de
anfolitos con un rango de separación de pH de 3 a 10 y se llevaron a 60 mL con agua
destilada. Esta solución, se inyectó en un Rotofor Cell Bio-Rad, previamente
ensamblado y enfriado a 4°C. Se corrió a 15 W constantes durante 3 horas, hasta
que los volts y amperes se hicieron constantes. Se colectaron 20 fracciones, a las
cuales, se les determinó el pH y la actividad de lacasa con ABTS 0.5 mM, en
amortiguador de acetatos pH 5, 0.1 M, a 40ºC. Las fracciones que dieron mayor
actividad de lacasa se juntaron y dializaron con membranas de 12,000-14,000 Da
contra un amortiguador de acetatos 50 mM a pH 5, para hacer la caracterización
enzimática de las actividades de lacasa.
5.10. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
El método usado para separar proteínas dependiendo de su peso molecular con
geles de poliacrilamida, fue el descrito por Laemmli (1970). En todos los
experimentos se utilizaron minigeles con 12% de acrilamida. En algunos casos, se
probaron geles con 10% de acrilamida, los cuales se motaron y corrieron en una
cámara mini-protean Bio-Rad. A cada pozo, se le adicionaron 12 µL con diferentes
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