caracterización de lacasas producidas por un hongo termofílico ...

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Contenido Resumen…………………………………………………………………………..….. Contenido…………………………………………………………………………..…. Lista de Tablas…………………………………………………………………..….... Lista de figuras…………………………………………………………………..….... 1. Introducción………………………………………………………………….……. 2. Marco teórico.………………………………………………………………….….. 2.1. Lacasas...…..……………………………………………………………….. 2.2. Estructura de lacasas…..…………..……………………………….……... 2.3. Mecanismo de reacción de lacasas……………………………….……... 2.4. Sustratos de lacasas…………………………………............................... 2.5. Aplicaciones de lacasas en la industria…............................................. 2.6. Microorganismos termofìlicos y su importancia………………….......…. 2.7. Enzimas termoestables……………………..………................................ 2.8. Efecto de la temperatura sobre las velocidades de reacción.…............ 2.9. Biocatálisis en medios no acuosos........................................................ 2.10. Purificación……………………………................................................... 2.11. Importancia de la caracterización cinética de las enzimas……….….. 2.12. Expresión de diferentes genes de lacasas………………...…………... 3. Antecedentes………………………………………………………….…...……... 4. Justificación, hipótesis y objetivos…………………………………................... 4.1. Justificación…..………………………….................................................. 4.2. Hipótesis…………..………………..………………………………….……. 4.3. Objetivo general…..…………………………………………………….….. 4.3.1. Objetivos particulares………………………………………..…….. 5. Materiales y métodos………………………………………………………….…. 5.1. Aislamiento..……………………………………………………………….... 5.2. Inóculo para el medio de producción de lacasas…………………...…... 5.3. Producción y obtención del extracto crudo de lacasas………….…..…. 5.4. Actividad de lacasa…..……………………………………………….……. 5.5. Determinación de proteína por el método de Bradford …………..…..... 5.6. Precipitación con sulfato de amonio……...……………………….……… 5.7. Cromatografía de intercambio aniónico………...…………………….….. 5.8. Cromatografía de filtración en gel………………...………………………. 5.8.1. Curva estándar de peso molecular en condiciones nativas....... 5.8.2. Determinación del peso molecular aparente de la lacasa 2…... 5.9. Isoelectroenfoque……………..……………………………………………. 5.10. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS……..……………….. 5.10.1. Soluciones para preparar los geles……..………………………. 5.10.2. Preparación del gel y de las muestras………………………….. 5.10.3. Condiciones de corrida………………………….……………….. 5.10.4. Revelado de las bandas de proteína en el gel……..……..…... 5.11. Zimogramas……………………………..……………………………........ 5.12. Caracterización de la enzima lacasa 2……………………..…………... 5.13. Efecto del pH sobre la actividad de lacasa………………..………....... Página i iii v vi 1 3 3 3 4 4 5 6 8 8 9 9 13 14 15 17 17 17 17 18 19 19 19 20 20 21 21 22 23 23 24 25 25 26 28 29 30 31 32 32 iii
5.14. Estabilidad del pH…………………….………………………………..…. 5.15. Efecto de la temperatura sobre la actividad de lacasa……………….. 5.16. Estabilidad a la temperatura……………………………………………... 5.17. Efecto de disolventes sobre la actividad de lacasa…………………… 5.18. Estabilidad a los disolventes…………………………………………….. 5.19. Parámetros cinéticos……………………………………………………… 6. Resultados………………………………………………………………….……... 6.1. Aislamiento y selección de macromicetos productores de lacasas…… 6.2. Producción de lacasas………………………………………………...…… 6.3. Precipitación con sulfato de amonio……………………………………… 6.4. Cromatografía de intercambio aniónico………………………………….. 6.5. Cromatografía por filtración en gel……………………………………….. 6.6. Isoelectroenfoque…………………………………………………………... 6.7. Resumen de la purificación parcial de la lacasa 2 producida por el hongo silvestre EUM1………….……………………………………......… 6.8. Determinación de pH óptimo y estabilidad de la actividad de lacasa al pH………………………………...………………………………………….. 6.9. Determinación de la temperatura óptima y estabilidad de la actividad de lacasa a la temperatura…………………...………..…………………. 6.10. Cálculo de la Energía de activación………………………..…………… 6.11. Determinación de los parámetros cinéticos…………………...……….. 6.12. Efecto de disolventes sobre la actividad de la lacasa………...………. 7. Discusión………………………………..…………………………………………. 8. Resumen de resultados……..…………………………………….……………... 9. Conclusión…………………………………………………………….…………... 10. Referencias………………………………………………………………………. Anexo 1……………………………………………………………………….………. Anexo 2………………………………………………………………………….……. Anexo 3…………………………………………………………………………….…. Página 32 33 33 33 34 34 36 36 37 37 39 41 42 43 44 46 47 49 53 56 60 62 63 69 70 71 iv
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7. Discusión Para realizar este tr
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Ridoporus lignosus (Cambria et al.
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8. Resumen de resultados • El Hon
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9. Conclusión Las lacasas producid
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• Chefetz, B.; Chen, Y. y Hadar,
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• Mansur, M.; Suárez, T. y Gonz
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• Yaver, D. S. y Golightly, E. J.
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Anexo 2 Curva estándar de pesos mo
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