Etude de Pax 3 dans la différenciation des cellules souches - M2 ...

Mémoire bibliographique
Master II : Expression Génique et Protéines Recombinantes
Année universitaire : 2007-2008
Semestre 1
Etude de Pax 3 dans la différenciation
des cellules souches
Frédéric SAMAZAN
Hélène TEXIER
Tuteurs : NIETO Laurence & DEMANGE Pascal

Résumé
Les mélanocytes sont des cellules différenciées pourvues de la machinerie enzymatique
permettant la synthèse de mélanine, responsable de la pigmentation de la peau. Lors de
l’embryogenèse, le tube neural génère les cellules de la crête neurale. Ces cellules migrant
dans la voie dorsolatérale, c'est-à-dire entre les somites et l’ectoderme, se différencieront
ultérieurement en mélanocytes. Le développement des cellules du lignage mélanocytaire est
un processus pendant lequel il y a prolifération et différenciation cellulaire. Les facteurs de
transcription Mitf, Sox 10 et Pax 3 semblent jouer des rôles essentiels lors de ces évènements.
Mitf est un facteur de transcription intervenant dans le développement des mélanocytes. Il
régule les gènes de la différenciation des cellules souches ainsi que ceux de leur progression
dans le cycle cellulaire. Son expression est activée par les facteurs de transcription Sox 10
et/ou de Pax 3. Sox 10 a un rôle important dans le développement du lignage mélanocytaire.
Une mutation du gène Sox 10 a pour conséquence, soit une absence complète de la protéine
Sox 10 et donc un défaut de crêtes neurales, soit un syndrome de Waardenburg de type 4. Pax
3 est un facteur de transcription uniquement présent dans les cellules non différentiées en
mélanocyte. C’est un compétiteur de Mitf pour l’activation du gène Dct mais peut également
activer la transcription du facteur de transcription Mitf. Si le gène Pax 3 est muté, il y a
apparition du syndrome de Waardenburg de type 1 dont le phénotype correspond à des
anomalies de pigmentation de l'iris (hétérochromie), des cheveux et de la peau, à une
dysmorphie faciale modérée et à une surdité. Pax 3 joue un rôle central dans la
différenciation des cellules souches. En effet, il initie la cascade mélanogénique tout en
inhibant la différenciation terminale des cellules souches en mélanocytes adultes, en aval.
Etant donné le rôle de Pax 3 dans la différenciation des cellules souches en mélanocytes ainsi
que sa présence dans les cellules pro génitrices des cellules musculaires, nous allons nous
intéresser au mécanisme moléculaire permettant de conserver des cellules à l’état de
progéniteur de cellules musculaires. En effet, dans les cellules de muscles striés, la protéine
Pax 3 ainsi que les protéines régulatrices de la transcription Six 1 et Six 4 ont un effet sur
Myf 5 et Myo D, deux gènes impliqués dans la détermination des cellules musculaires. Par
conséquent, en comparaison au mécanisme moléculaire de régulation de Pax 3 dans le
développement du lignage mélanocytaires, ce rapport décrit l’étude de l’implication de la β
caténine dans la voie de différentiation des cellules musculaires. Par conséquent, ce projet de
recherche pourrait s’inscrire dans le cadre d’études de maladies musculaires telles que la
myopathie de Duchenne.
2

Sommaire
Page
1. Introduction…………………………………………………….. 4
a) Mélanocytes…………………………………………………………..………... 4
b) Développement des cellules du lignage mélanocytaire….................................. 4
c) Mitf…………………………………………………………………………….. 6
d) Sox 10………………………………………………………………………… ..7
e) Pax 3…………………………………………………………………………… 8
f) Les cellules souches et Pax 3…………………………………………………... 9
2. Résultats………………………………………………………... 9
a) Localisation de l’expression de Pax 3…………………………………………. 9
b) Effet inhibiteur de Pax 3……………………………………………………….. 11
i - Etude de la séquence promotrice de Dct……………………………………… 11
ii - Séquence de la boîte 2 du promoteur Dct……………………………………. 12
iii - Identification de la séquence de fixation de Pax 3 sur le promoteur Dct…… 12
iiii - Effet de la mutation de la séquence de fixation de la protéine Lef sur
le promoteur Dct…………………………………………………………………. 13
c) Inhibition de l’activité de Pax 3 par la β caténine……………………………... 15
i -Activité de la β caténine……………………………………………………….. 15
ii - Mécanisme d’action de la β caténine………………………………………… 16
d) Bilan du mode d’action et de la régulation de Pax 3 dans le bloquage de la
différentiation des cellules souches en mélanocytes………………................. 17
3. Projet de recherche……………………………………….. ……19
a) Choix du modèle cellulaire…………………………………………………….. 20
b) Localisation de la β caténine…………………………………………………... 20
c) Effet de la β caténine sur l’expression des gènes Myf 5 et Myo D……………. 21
d) Détermination de l’interaction de la β caténine avec les promoteurs Myf 5
et Myo D………………………………………………………………………….. 22
e) Détermination des partenaires de la β caténine par Co immunoprécipitation…. 23
4. Conclusion et Perspectives………………………………...…… 24
Bibliographie……………………………………………………… 25
3

1. Introduction
a) Mélanocytes
Les mélanocytes sont des cellules présentes au niveau de la peau, des cheveux et des
yeux, chez l’Homme. Ce type cellulaire contient des mélanosomes, vésicules lysosomales qui
ont pour fonction la synthèse de la mélanine responsable de la pigmentation.
Les mélanocytes sont des cellules différenciées pourvues de la machinerie
enzymatique permettant la synthèse de mélanine dont les trois enzymes clefs sont : la
tyrosinase, Tyrp 1 et Dct.
Effectivement, Dct a été identifié comme un gène impliqué dans la synthèse de la
mélanine puisqu’il code la Dopachrome Tautomérase (Dct). Cette enzyme catalyse une des
réactions de transformation de tyrosine en mélanine. De plus, Guyonneau et son équipe ont
montré que des mutations au niveau de ce gène entraînent une diminution de la production de
mélanine et affectent la croissance des mélanocytes ( 1 ).
Via la mélanine, les mélanocytes ont également pour fonction de protéger contre les
dommages éventuellement causés par les radiations UV du soleil.
Les cellules mélanocytaires sont de type dendritique, ce qui leur permet le transfert
des mélanosomes contenant la mélanine, aux kératinocytes environnants. Effectivement, les
mélanocytes et les kératinocytes sont situés à la surface de la peau : dans l’épiderme ( 2 ). Les
mélanocytes sont également localisés dans le bulbe de cheveux et dans la rétine de l’œil.
Les mélanocytes sont des cellules dérivées de la crête neurale.
b) Développement des cellules du lignage mélanocytaire
Lors de l’embryogenèse, le tube neural génère les cellules de la crête neurale. Les
précurseurs de ces cellules sont localisés au bord de l’ectoderme dans une région constituant
l’apex du pli neural.
Les cellules de la crête neurale sont pluripotentes. Elles prolifèrent puis migrent
selon deux voies distinctes : dorsoventrale et dorsolatérale. Ce sont les cellules migrant dans
la voie dorsolatérale, c'est-à-dire entre les somites et l’ectoderme, qui se différencieront
ultérieurement en mélanocytes. Les cellules de la crête neurale se différencient en
mélanoblastes fondateurs, ce qui est appelé détermination. Ensuite, les mélanoblastes
fondateurs commencent à proliférer pour former les mélanoblastes précurseurs (mélanoblastes
4

secondaires). Ces précurseurs évoluent en mélanoblastes migrants qui prolifèrent et/ou
subissent l’apoptose. La dernière étape de la mélanogenèse consiste en la migration des
mélanoblastes vers leur destination finale, pendant laquelle ils prolifèrent puis se différencient
en mélanocytes ( 3 ) (Figure 1).
Le développement des cellules du lignage mélanocytaire est un processus pendant
lequel il y a prolifération et différenciation cellulaire. Les facteurs de transcription Mitf, Sox
10 et Pax 3 semblent jouer des rôles essentiels lors de ces évènements ( 4 ). En effet,
Bondurand et ses collègues ont mis en évidence la collaboration directe entre les protéines
Mitf, Pax 3 et Sox 10 à travers l’étude du syndrome de Waardenburg ( 5 ). Ils ont tout d’abord
évalué les effets de Sox 10 et Pax 3 sur le promoteur Mitf, puis déterminé la région de fixation
de la protéine Sox 10 sur le promoteur Mitf. Ils ont également établi que Sox 10 et Pax 3
agissaient ensemble sur le promoteur Mitf. Ensuite, ils ont observé les conséquences de
mutations de Sox 10 et Pax 3 sur l’induction du promoteur d’intérêt. Enfin, ils ont fait des
analyses in vivo pour déterminer l’effet de Sox 10 sur l’expression de Mitf. Leur conclusion
est qu’il y a interaction entre les 3 partenaires étudiés, dans le cas du syndrome de
Waardenburg.
5

C’est pourquoi, ce rapport décrit notamment ces trois facteurs de transcription clefs,
impliqués dans la prolifération et la différentiation cellulaire du lignage mélanocytaire.
c) Mitf
Mitf (Microphthalmia-associated transcription factor) est un facteur de transcription
intervenant dans le développement des mélanocytes. Il régule les gènes de la différenciation
ainsi que ceux de la progression du cycle cellulaire. Il a également été démontré que ce
facteur de transcription a un rôle oncogénique ( 6 ).
L’importance de Mitf dans le développement des mélanocytes a été décrite via des
modèles animaux, notamment par Odecamp et ses collaborateurs ( 7 ). Ainsi, par la
construction de souris transgéniques Mitf mi-ew (mi : Mitf - ew : eyes less white) homozygotes,
ces auteurs ont montré que des mutations au niveau de l’allèle Mitf entraînaient une forte
diminution de l’expression de la Dct dans les cellules exprimant Pax 3. Leurs résultats
indiquent un problème dans le développement de la lignée mélanocytaire ainsi que dans la
pigmentation. Cela montre que Mitf est central dans la différenciation des cellules précurseurs
en mélanocytes matures.
Chez l’Homme, le facteur de transcription Mitf est présent sous neuf isoformes qui
différent par leur exon 1. Elles ont en commun un domaine de transactivation localisé au
niveau de l’exon 4 et de l’exon 9. Elles possèdent également au niveau des exons 6,7 et 8, un
domaine Hélice-boucle-hélice de type leucine Zipper, permettant leur dimérisation ainsi que
leur fixation à l’ADN (Figure 2). L’isoforme M est la forme présente au niveau des
mélanocytes.
6

Ce facteur de transcription se fixe sur la séquence E-box (CACGTG) de ses cibles lorsqu’il
s’est dimérisé. Des expériences de Microarray ont permis de démontrer que Mitf a de
nombreux gènes cibles parmi lesquels : les gènes impliqués dans la synthèse de mélanine
(TYR, TYRP 1 et DCT), le gène de la mobilité (c-MET), le gène antiapoptotique (Bcl 2) ainsi
que les gènes impliqués dans le cycle cellulaire (CDK2, p21, TBX 2) ( 8 ).
Son expression est activée par la fixation de Sox 10 et/ou de Pax 3 sur son
promoteur ( 6 ) (Figure 3).
d) Sox 10
Sox 10 est un facteur de transcription qui est impliqué avec Pax 3 dans l’activation de Mitf.
Cette protéine a un rôle important dans le développement du lignage mélanocytaire.
En effet, Southard-Smith et son équipe a mis en évidence les conséquences de la mutation
du gène Sox 10 dans des souris modèles : les souris Sox 10 Dom ( 9 ). Ces souris, lorsqu’elles
sont hétérozygotes Dom/+, présentent une perte des cellules dérivées de la crête neurale due à
l’apoptose. De plus, ce type de souris présente un défaut de pigmentation visible par une tâche
blanche au niveau du ventre et des pattes ( 10 ). Lorsque ces souris sont homozygotes
Dom/Dom : elles meurent au stade d’embryon ( 9 ). Cette étude suggère également que Sox 10
est une protéine essentielle pour le développement du système nerveux périphérique ainsi que
pour la pigmentation des poils.
Une mutation du gène Sox 10 a pour conséquence, soit une absence complète de la
protéine Sox 10 et donc un défaut de crêtes neurales, soit un syndrome de Waardenburg de
type 4, c'est-à-dire des anomalies de pigmentation (taches blanches cutanées, mèche de
cheveux blancs ou blanchiment précoce de cheveux, iris hétérochromiques ou très bleus) et
dans la moitié des cas une surdité neurosensorielle bilatérale ou unilatérale ( 5 ).
7

Ce facteur de transcription est constitué d’un domaine HMG (High Mobility Group),
permettant l’interaction avec Pax 3, d’une séquence signal d’export nucléaire et d’un domaine
de transactivation en C terminal (Figure 4).
Sox 10 active la transcription de Mitf, seul ou en interaction avec
Pax 3 ( 5 ). Dans le cas d’une interaction avec Pax 3, le taux de transcription de Mitf est
augmenté. Si Sox 10 interagit directement avec Mitf alors le promoteur Dct est activé.
e) Pax 3
Pax 3 est un facteur de transcription uniquement présent dans les cellules non
différentiées en mélanocyte. Il est donc exprimé dans les cellules souches, le tube neural, le
cerveau en développement, les cellules de crêtes neurales et leurs dérivés ( 11 ).
Il a un faible effet voire aucun sur la migration des mélanoblastes. C’est un
compétiteur de Mitf pour l’activation du gène Dct mais peut également activer la transcription
du facteur de transcription Mitf.
Si le gène Pax 3 est muté, il y a apparition du syndrome de Waardenburg de type 1
dont le phénotype correspond à des anomalies de pigmentation de l'iris (hétérochromie), des
cheveux et de la peau, à une dysmorphie faciale modérée et à une surdité. Il peut également y
avoir apparition du syndrome de Waardenburg de type 3 ( 6 ) dont le phénotype correspond à
celui du syndrome de type 1 additionné d’un albinisme partiel et une sévère anomalie des
membres supérieurs.
8

Ce facteur de transcription est composé d’un domaine de transactivation en C
terminal, riche en Proline, Sérine et Arginine, d’un homéodomaine hélice boucle hélice
interagissant avec l’ADN, d’un octapeptide [ HSIDGIL(G/S) ] interagissant avec GRG4 afin
d’inhiber la transcription du gène Mitf et un paire domaine qui interagit avec la protéine
Sox 10 pour l’activation de Mitf (Figure 4).
f) Les cellules souches et Pax 3
Les cellules souches sont des cellules progénitrices qui sont en cours de
différentiation. A partir de stimuli externes, ces cellules se différencieront en divers types
cellulaires matures comme par exemple les mélanocytes.
Il parait donc très important de s’intéresser au processus moléculaire de la
différenciation des cellules souches en mélanocytes dans lequel Pax 3 a été identifié comme
facteur critique ( 4 ).
2. Résultats
a) Localisation de l’expression de Pax 3
A partir de souris Dct-LacZ, l’expression de Pax 3 est analysée sur des follicules
pileux ( 3 ).
L’expression de la protéine Pax 3 est visualisée à l’aide d’un anticorps anti Pax 3
(vert) alors que l’activation du promoteur Dct est visualisée par ajout de X-Gal (rouge)
(Figure 5).
9

On observe que Pax 3 est co exprimé avec Dct dans les mélanocytes matures mais est
exprimé seul dans la zone bombée du follicule où se situent les cellules souches. De plus,
dans ce type cellulaire, Pax 3 peut être exprimé indépendamment de Dct. On en déduit que
Pax 3 s’exprime dans des cellules indifférenciées ainsi que dans des cellules différenciées
exprimant Dct.
Lang et son équipe ont également réalisé des expériences d’immunohistochimie afin
de localiser l’expression des protéines Pax 3, Mitf et Sox 10. Leurs travaux ont montré que la
co expression de Mitf et Pax 3 ainsi que celle de Sox 10 et Pax 3 dans les cellules de follicules
en phase anagène. Cette phase est une des trois phases du cycle du cheveux : la phase de
croissance. La colocalisation de ces trois protéines dans un même compartiment cellulaire
amène à supposer que celles-ci interagissent entre elles.
10

) Effet inhibiteur de Pax 3
i - Etude de la séquence promotrice de Dct :
Etant donné que Dct est co localisé avec Pax 3 et que Pax 3 est colocalisé avec Mitf
et Sox 10, les chercheurs ont déterminé la capacité de ces trois dernières protéines à activer
seule ou en combinaison, l’expression de Dct. Ils ont transfecté des cellules 293T (cellules
embryonnaires de rein humain) avec des constructions reportrices de l’activation du gène Dct
seule, soit avec Mitf et Sox 10, soit avec Mitf, Sox 10 et Pax3. Les constructions reportrices
diffèrent selon les délétions des boites conservées entre l’Homme et la souris, du promoteur
Dct (Figure 6).
Le taux de transcription est observé pour chaque délétion, grâce à la mesure de l’intensité
lumineuse due à la transcription du gène rapporteur de la luciférase. Ce gène est sous la
dépendance du promoteur Dct sauvage ou délété.
On observe que Sox 10 seul active le promoteur Dct ainsi que Mitf seul. Le taux
d’activation de ce promoteur est augmenté significativement lorsque Sox 10 et Mitf sont tous
les deux présents. Dans le cas où la boite 4 est délétée ainsi que dans le cas où les boites 4 et 3
sont délétées, les profils d’expression sont augmentés. Par contre, lorsque les boites 2, 3 et 4
sont délétées, on remarque qu’il n’y a plus d’activation du promoteur Dct. On en déduit donc
que la boite 2 de ce promoteur doit comporter le site de fixation des protéines activant sa
transcription.
11

De plus, les résultats montrent que lors de l’expression de Pax 3 dans les cellules il y
a une diminution du taux d’expression de la luciférase. Ceci démontre la capacité de Pax 3 à
inhiber l’activation du promoteur Dct par Mitf et Sox 10. De plus, il semblerait que le site de
liaison de Pax 3 sur Dct correspond au site de liaison de Mitf sur ce même promoteur.
ii - Séquence de la boîte 2 du promoteur Dct :
Une étude plus précise de la région enhancer (boite 2) du promoteur du gène Dct a
permis d’identifier les sites de liaison pour les protéines : Lef 1 (vert), Mitf (bleu) et Sox 10
(rouge) (Figure 7).
On remarque l’absence de site de fixation de Pax 3. Ce qui conforte notre hypothèse sur la
fixation de Pax 3 au niveau du même site que Mitf sur le promoteur Dct.
iii – Identification de la séquence de fixation de Pax 3 sur le promoteur Dct :
Dans le but de valider cette hypothèse, Lang et son équipe ont procédé à des réactions de
compétition entre les protéines Mitf et Pax 3. Ils ont mis en place des expériences
d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) sur des cellules 293T, étant transfectées par des
quantités différentes de plasmides d’expression Mitf et/ou Pax 3 (Figure 8). Après
immunoprécipitation des complexes ADN-protéine grâce à des anticorps anti-Pax 3 ou anti-
Mitf, la séquence correspondante à la boite 2 du promoteur Dct a été amplifiée par PCR.
12

Pour un ratio 1:1 de Mitf :Pax 3, on observe la fixation de la protéine Pax 3 sur la
séquence promotrice. Il en va de même pour un ratio 4:1. Par contre, lorsque que l’on
introduit le plasmide d’expression Mitf en large excès c'est-à-dire pour un ratio 12 :1, alors
c’est la protéine Mitf qui se fixe sur le promoteur Dct. On en déduit donc que Pax 3 se fixe sur
la même région de l’enhancer Dct que Mitf et que Pax 3 semble être un inhibiteur compétitif
de Mitf.
iiii – Effet de la mutation de la séquence de fixation de la protéine Lef sur le promoteur Dct :
A partir de cellules 293T transfectées par la construction reportrice de l’expression
du gène Dct, les auteurs ont mis en évidence l’importance du site de liaison de la protéine Lef
sur le taux de transcription de Dct. Ils ont cotransfecté ces cellules avec les différents
plasmides d’expression des protéines Pax 3, Sox 10 et Mitf, seul ou combinés. Chaque
expérience est réalisée dans deux conditions : le site de fixation Lef muté ou pas (Figure 9).
13

Les résultats montrent que Sox 10 induit la transcription du rapporteur dans les deux
cas (piste 3). Par contre, dans le cas de cellules uniquement transfectées par Mitf ayant le site
de fixation Lef muté, une perte d’induction est observée (piste 4). Les pistes 5 et 6 indiquent
que Pax 3 inhibe la transcription activée par Sox 10 ou Mitf, dans le cas où la séquence Lef
est native. Cette inhibition est levée si la séquence Lef est mutée. Sur la piste 7, il y a une très
bonne induction par Mitf et Sox 10 quand la séquence de fixation Lef est normale. On
remarque une diminution de cette induction dans le cas où Lef est muté. La piste 8 décrit
l’inhibition de Pax 3 sur l’induction de Dct par Mitf et Sox 10 dans le cas où le promoteur est
natif, en comparaison à la piste 7. Cependant, dans le cas où le promoteur est muté, Pax 3
perd sa capacité de fixation et ne peut donc plus inhiber la transcription du gène Dct. On peut
donc retenir l’importance de la séquence Lef du promoteur Dct sur la fixation des facteurs de
transcription Pax 3 et Mitf ainsi que les rôles de ces deux protéines.
En supplément de ces travaux, des expériences d’immunohistochimie et de ChIP
ont permis de mettre en évidence l’implication de Grg4, un co répresseur de la famille
Groucho. Un co répresseur est défini comme étant une protéine requise pour l’activité
répressive d’un facteur de transcription spécifique mais ne possédant pas la capacité de se lier
seule à l’ADN. Les résultats révèlent que Grg4 est co localisé avec Pax 3 et Dct dans les
follicules de cheveux (immunohistochimie). Ils démontrent également que Grg4 est capable
de se fixer à Pax 3 afin de co réprimer le promoteur Dct (ChIP).
14

c) Inhibition de l’activité de Pax 3 par la β caténine
La β caténine est un composant de la voie de signalisation Wnt impliquée dans la
différenciation des cellules souches en mélanocytes. C’est une phosphoprotéine
nucléocytoplasmique dont la stabilité est régulée par phosphorylation. En absence de signal
Wnt, la β caténine est phosphorylée pour être la cible de la dégradation par le système
Ubiquitine-protéasome. En présence du signal Wnt, la β caténine n’est plus phosphorylée. Il
en résulte une accumulation cytoplasmique puis sa translocation dans le noyau.
i – Activité de la β caténine :
L’effet de la β caténine sur la protéine Pax 3 est étudié par co transfections de
cellules 293T par une construction reportrice du gène luciférase sous le contrôle du promoteur
Dct. Ces cellules sont également transfectées par des plasmides d’expression des protéines
Mitf, Sox 10 et Pax 3, avec (barres noires) ou sans (barres blanches) plasmides exprimant la
β caténine. Le taux de transcription est suivi par mesure de la bioluminescence de la luciférine
à 540 nm (Figure 10), induite par le transcription du gène rapporteur de la luciférase.
L’ajout de β caténine n’a aucun effet sur l’activation du promoteur Dct par Sox 10 et
Mitf (piste 2). En revanche, cet ajout permet de lever l’inhibition par Pax 3 de l’activation de
Dct par Mitf et Sox 10 (piste 3, barre noire). Effectivement, on retrouve le même taux de
15

transcription que pour l’expérience de la piste 2 avec et sans β caténine, où le plasmide Pax 3
est absent.
Il semble donc que la β caténine empêche l’action inhibitrice de Pax 3 au niveau du
promoteur Dct.
ii – Mécanisme d’action de la β caténine :
Après avoir déterminé le rôle de la β caténine par rapport à Pax 3, Lang et ses
collaborateurs ont cherché à identifier son mécanisme d’action. Ils ont alors réalisé des
expériences de co immunoprécipitation à partir de protéines traduites et marquées in vitro :
Grg4, Lef, Pax 3 et β caténine (Figure 11). L’immunoprécipitation est réalisée avec un
anticorps anti Lef et les protéines sont détectées par autoradiographie.
En absence de β caténine, les trois protéines Grg4, Lef et Pax 3 sont
immunoprécipitées (piste 1). En présence de β caténine, il y a immunoprécipitation de Lef et
de β caténine uniquement (piste 2).
Ceci démontre que la β caténine, en se fixant sur Lef, empêche la formation du
complexe entre Lef, Grg4 et Pax 3.
16

d) Bilan du mode d’action et de la régulation de Pax 3 dans le bloquage de la
différentiation des cellules souches en mélanocytes
Précédemment, il a été démontré que Pax 3 et Sox 10 agissent ensemble pour activer
la transcription de Mitf qui est un facteur de transcription indispensable pour la différenciation
des cellules souches en mélanocytes (Figure 12 - a). L’une des cibles de ce facteur de
transcription est le promoteur du gène Dct, impliqué dans la différentiation et marqueur des
mélanocytes matures. Les résultats observés ont révélé la capacité de Pax 3 à bloquer
l’activation de la transcription du gène Dct par Mitf, stoppant alors les cellules souches dans
un état transitoire de différentiation. De plus, les chercheurs ont aussi prouvé que la voie Wnt,
par l’intermédiaire de la β caténine, est capable de lever cette inhibition, permettant ainsi
l’expression du gène Dct et par conséquent la différentiation cellulaire.
Des expériences complémentaires ont mis en évidence que la formation d’un
complexe Pax 3/Groucho/Lef est responsable de l’inhibition de l’activation du promoteur Dct.
Après sa fixation sur le promoteur, ce complexe empêche Sox 10 et Mitf de s’y fixer
(Figure 12 - b). La β caténine, protéine de la voie Wnt, gène la formation ainsi que la fixation
du complexe inhibiteur sur le promoteur Dct, en bloquant la protéine Lef. Ceci permet donc la
transcription de Dct et la différenciation des cellules souches.
Pax 3 joue un rôle central dans la différenciation. En effet, il initie la formation des
mélanocytes tout en inhibant la différenciation terminale des cellules souches en mélanocytes
adultes, en aval.
17

3. Projet de recherche
La myopathie de Duchenne correspond à une dystrophie musculaire due à un
mauvais épissage du pré ARN messager du gène codant pour la protéine dystrophine. Celle-ci
est une protéine membranaire indispensable au maintien de l’architecture des cellules
musculaires. Dans le cadre du traitement de cette maladie, l’une des thérapies envisagées par
les chercheurs est l’injection de myoblastes (cellules musculaires pas totalement
différenciées). Etant donné le rôle de Pax 3 dans la différentiation des cellules souches en
mélanocytes ainsi que sa présence dans les cellules pro génitrices des cellules musculaires, ce
projet de recherche est basé sur l’étude du mécanisme moléculaire permettant de conserver
des cellules à l’état de progéniteur de cellules musculaires.
Buckingham et ses collaborateurs ( 12 ) ont montré que Pax 3 avait un effet sur
Myf 5 et Myo D, deux gènes impliqués dans la détermination des cellules musculaires. De
plus, Giordani et son équipe ( 13 ) ont mis en évidence que l’expression de Myf 5 est activée par
la fixation de Pax 3, Six 1 et Six 4 sur une séquence régulatrice de 145 pb, élément entre
-48 à -58 kb en amont du gène Myf 5. La famille des protéines Six correspond à des
régulateurs de la myogenèse (genèse des cellules musculaires). De plus, ces auteurs ont
démontré que Six 1 et Six 4 régulaient Myo D par l’intermédiaire de Myf 5.
Par conséquent, en comparaison au mécanisme moléculaire de régulation de Pax 3
(Figure 12), nous allons étudier l’implication de la β caténine dans la voie de différentiation
des cellules musculaires (Figure 13).
19

D’une part, la présence de β caténine dans le modèle cellulaire choisi sera vérifiée
via une immunohistochimie. Ensuite, l’effet de la protéine β caténine sur les promoteurs des
gènes Myf 5 et Myo D sera étudié grâce à des constructions reportrices. Puis, des expériences
de ChIP seront réalisées afin de déterminer quelles sont les protéines présentes, avec la β
caténine, sur les promoteurs Myf 5 et Myo D. Finalement, une co immunoprécipitation sera
effectuée dans le but d’identifier toutes les protéines responsables de la régulation des
promoteurs d’intérêt, telles que les protéines de la famille Groucho.
a) Choix du modèle cellulaire
Les cellules murines C2C12 ont été retenues pour cette étude. Il s’agit d’un modèle
cellulaire pour l’étude de la différentiation des cellules non musculaires en cellules
musculaires squelettiques, d’après les travaux de Wu Y ( 14 ). Ces cellules sont cultivées dans
du milieu Dubelcco’s modified Eagle’s medium (DMEM) contenant 10% de sérum bovin
fétal (FBS). Leur différentiation en cellules musculaires est induite en remplaçant le FBS par
2 % de sérum de cheval. Il faut noter que lors de cette étude, les cellules seront induites afin
de pouvoir observer les mécanismes moléculaires impliqués dans la différentiation.
b) Localisation de la β caténine
Dans un premier temps, la présence de β caténine dans les cellules musculaires
progénitrices en différentiation sera vérifiée. Pour cela, une méthode immuno histochimique
sera mise en place. Pour réaliser cette expérience, des anticorps polyclonaux de lapin anti β
caténine (Genscript) et anti Pax 3 (Merck Calbiochem) seront utilisés. L’anticorps primaire
anti Pax 3 sera reconnu par un anticorps secondaire couplé à un fluorophore de couleur verte :
la Cyanine 3 dont la longueur d’onde d’excitation (λ ex) est de 548 nm et dont la longueur
d’onde d’émission (λ em) est de 562 nm. D’autre part, un anticorps secondaire couplé à un
fluorophore rouge (Cyanine 7, λ ex= 710 nm, λ em= 805 nm) sera dirigé vers l’anticorps
primaire anti β caténine. Ces deux systèmes permettent la localisation des protéines d’intérêt
dans les cellules C2C12.
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c) Effet de la β caténine sur l’expression des gènes Myf 5 et Myo D
Si la présence de β caténine est vérifiée, une étude d’analyse du taux transcription
des gènes Myf 5 et Myo D sera réalisée. Comme Lang l’a réalisé pour démontrer le rôle de la
β caténine dans l’activation du promoteur Dct par Pax 3, des cellules 293T (cellules
embryonnaires de rein humain) seront transfectées par des constructions reportrices : un
plasmide où le gène Luciférase est sous le contrôle du promoteur Myf 5 (région de 145 pb
localisée entre -50 et -200 pb) ou un plasmide où le gène Luciférase est sous le contrôle du
promoteur Myo D (région enhancer de 258 pb). De plus, ces cellules seront transfectées par
des plasmides de type pGL2 (Promega) contenant les gènes Pax 3, Six 1, Six 4 et β caténine
sous le contrôle d’un promoteur fort tel que le CMV ; les protéines correspondantes étant
requises pour la transcription des gènes Myf 5 et Myo D.
Afin de tester l’effet de la β caténine sur l’activation des promoteurs d’intérêt,
différentes transfections seront réalisées. Tout d’abord, quatre contrôles seront effectués :
Contrôle 1 : aucune transfection des cellules 293 T.
Contrôle 2 : transfection avec le plasmide Pax 3 seul (cellules Pax 3 + ),
Contrôle 3 : transfection avec les plasmides Six 1 et Six 4 (cellules Six 1 + .Six 4 + ),
Contrôle 4 : transfection avec les plasmides Pax 3, Six 1 et Six 4
(cellules Pax 3 + .Six 1 + .Six 4 + ).
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Ces contrôles permettront de vérifier l’effet d’activation sur les gènes Myf 5 et
Myo D. Pour chaque type cellulaire et pour chaque gène, un plasmide exprimant de façon
constitutive la β caténine sera cotransfecté (Figure 14). Il faudra également créer des
contrôles afin d’évaluer l’efficacité de transfection pour normaliser les résultats obtenus.
Le taux d’activation des promoteurs Myf 5 et Myo D est mesuré via la
bioluminescence de la luciférine. Celle-ci est oxydée en oxyluciférine, en présence d’ATP,
par la luciférase qui est une protéine monomérique de 61 kDa, comme décrit dans la
figure 15.
d) Détermination de l’interaction de la β caténine avec les promoteurs Myf 5 et
Myo D
L’expérience de choix pour déterminer si la β caténine interagit avec les séquences
d’ADN des promoteurs Myf 5 et Myo D est : l’Immuno Précipitation de Chromatine (ChIP).
Ainsi, à partir de cellules modèles C2C12, cette technique sera mise en place afin de
précipiter les complexes, contenant à priori la β caténine, se fixant sur les promoteurs
d’intérêt. Après avoir cross linké les protéines à l’ADN par le formaldéhyde, les noyaux des
cellules seront récupérés puis une sonication permettra de couper la chromatine toutes les
500 pb environ. L’immunoprécipitation sera réalisée à l’aide d’un anticorps anti β caténine
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(Genscript) fixé à des billes de sépharose. Ceci est possible du fait que la β caténine est prêt
de la séquence d’ADN. Il faut noter qu’une étape préalable de Clearing des billes aura lieu,
celle–ci ayant pour but d’enlever toute protéine se liant de façon non spécifique aux billes.
Une fois l’ADN décrosslinké du complexe, les séquences d’ADN piégées (promoteurs de Myf
5 et Myo D) seront amplifiées par PCR. Les amorces utilisées pour amplifier la région
promotrice de Myf 5 encadreront la région de 145 pb et les amorces utilisées pour amplifier le
promoteur de Myo D encadreront la région enhancer de 258 pb. L’expérience contrôle
consistera à amplifier avec les mêmes amorces, de l’ADN prélevé avant
l’immunoprécipitation. Cette étape permet de vérifier l’état de la chromatine et le bon
fonctionnement des amorces.
e) Détermination des partenaires de la β caténine par Co immunoprécipitation
Que les résultats du ChIP soient positifs ou négatifs, les différents partenaires de la β
caténine seront identifiés par une expérience de Co immunoprécipitation (CoIP).
A partir d’un lysat de cellules C2C12 induites, la CoIP est réalisée avec un anticorps
(Genscript) dirigé contre la β caténine. Cet anticorps sera couplé à des billes de sépharose
dans le but de piéger la β caténine avec tous ses partenaires. Comme dans la ChIP, une étape
supplémentaire de clearing sera effectuée sur les billes de sépharose. Après avoir purifié le
complexe β caténine/partenaires et afin d’identifier ces partenaires, un gel SDS PAGE 1D
sera effectué. Chacun des spots révélés au Bleu de Coomassie sera soumis à une digestion
trypsique puis à une analyse en spectrométrie de masse : MALDI TOF MS puis une
vérification sera effectuée en LC-MS/MS.
Dans le cas où la β caténine a un effet inhibiteur sur l’induction de la différentiation,
alors il faudra regarder comment cette protéine agit sur les facteurs de transcription tels que
Pax 3.
Dans le cas où la β caténine n’aurait aucun effet inhibiteur sur la différentiation, les
recherches devront être orientées vers d’autres protéines impliquées dans la voie Wnt ou alors
vers des inhibiteurs transcriptionnels tels que ceux de la famille Groucho.
Cependant, cette technique de CoIP nous indiquera un certain nombre de
partenaires dont certains n’auront aucun intérêt par rapport aux promoteurs. Toutefois, ceci
nous permettra d’avoir une idée générale sur les partenaires de la β caténine.
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4. Conclusion et perspectives
La protéine Pax 3 a un rôle clef dans la différentiation des cellules souches en
mélanocytes. En effet, ce facteur de transcription a la capacité d’activer la cascade
mélanogénique tout en bloquant l’activation de la transcription de gènes de différentiation.
De plus, Pax 3 est présent dans les cellules progénitrices de muscles striés où il est
responsable de l’activation de la différentiation.
Par conséquent, l’étude du blocage de la voie de différentiation induite par Pax 3
dans les muscles striés est apparue indispensable. C’est pourquoi, le projet de recherche
présenté ici a été élaboré afin de tester les effets de la β caténine dans ce mécanisme de
différentiation.
Ainsi, après avoir complètement défini les mécanismes moléculaires mis en jeu dans
le blocage des cellules musculaires progénitrices, des protocoles pourront être développés afin
de conserver les cellules progénitrices à l’état prolifératif. Ceci a pour but de trouver
des traitements aux maladies musculaires nécessitant l’apport de cellules musculaires saines
progénitrices, telles que la myopathie de Duchenne.
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are affected in dopachrome tautomerase knockout mice.
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