La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G (2008) - M2 ...

Mémoire bibliographiqueLa dimérisation desrécepteurs couplés auxprotéines GMarina LavigneClaire PortugalAnnée 2007-2008

RésuméLes GPCRs ou récepteurs couplés aux protéines G permettent lacommunication intercellulaire de par leur diversité. En effet, ils sont capables dereconnaître différentes molécules transportant l’information extracellulaire ainsi quedes stimuli sensoriels. Tous les GPCRs possèdent une structure communeconstituée de 7 hélices transmembranaires, une extrémité N-terminale extracellulaireet une extrémité C-terminale intracellulaire permettant l’interaction avec les protéinesG qui leur sont spécifiques.Malgré leur grande diversité, le mécanisme de transduction du signal estconservé. Le GPCR est activé par fixation de son agoniste, ce qui induit deschangements conformationnels. Il peut alors interagir avec sa protéine G partenaire,qui une fois activée, pourra réguler l’activité de divers effecteurs.Il y a encore une vingtaine d’années, le modèle d’activation des protéines Gdécrivait un récepteur monomérique. Cependant, de nombreuses études ont depuismis en évidence l’homo- et l’hétérodimérisation des GPCRs.En particulier, pour le récepteur au leukotriène B 4 : BLT1, il a été montré qu’ilhomodimérise quand il est solubilisé dans du détergent après expression chez E.coli. En effet, il semblerait que ce récepteur interagisse avec sa protéine G associéesous forme d’un complexe pentamérique impliquant un dimère de BLT1 et uneprotéine G hétérotrimérique. Cependant, le récepteur monomérique est capabled’activer la protéine G, mais l’activation complète de cette dernière nécessite ladimérisation.Les études antérieures ont été menées uniquement in vitro, mais aucunepreuve n’a été apportée sur le fait que BLT1 homodimériserait in vivo. Notre projet derecherche présente différentes expériences dont le but est de démontrer la validitédu modèle de BLT1 dimérique in vitro puis in vivo. Pour cela, nous proposons deréaliser de l’immunoprécipitation sur des membranes de leucocytes humains ainsique des expériences de BRET menées sur des cellules Cos-7 exprimant notrerécepteur recombinant.2

SommaireRésuméSommaireI. INTRODUCTION1. Structure des GPCRs2. Mécanisme général de la transduction du signal3. Dimérisation des GPCRs4. Importance des phénomènes de dimérisationa. Rôle de la dimérisation dans l’adressage à la membrane plasmiqueb. Rôle de la dimérisation dans l’activation du récepteurc. Rôle de la dimérisation dans l’internalisation5. Le récepteur BLT1II. RESULTATS1. Matériels et méthodes2. Activation de la protéine G3. Changements conformationnels de l’hétérodimère R : R 0 induits par l’agonistea. Changements conformationnels du récepteur Rb. Changements conformationnels du récepteur R 04. Caractéristiques conformationnels du dimère BLT1 en présence de concentrationsaturante de LTB 4a. Hétérodimère R L : R 0Lb. Homodimère R L : R L5. ConclusionIII. PROJET DE RECHERCHE1. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vitro2. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vivoa. Immunoprécipitation à partir de membranes de leucocytesb. Expériences de BRETc. Localisation cellulaire de la dimérisation de BLT13. PerspectivesBibliographie3

I. IntroductionLes GPCRs (G-Protein-Coupled Receptors) forment la famille de protéinesmembranaires la plus vaste (30%) et les gènes codant pour ces récepteursreprésentent entre 1 et 5 % du génome selon l’organisme. Les GPCRs se retrouventchez les protozoaires, les métazoaires diploblastiques les plus anciens, les plantes,les levures, le nématode C. elegans, la drosophile et les vertébrés (Bockaert et Pin,1999 ; Bockaert et al., 2002).Le rôle des GPCRs est de permettre une communication intercellulaire carleur diversité confère la reconnaissance de différentes molécules transportantl’information extracellulaire (hormones, neurotransmetteurs, facteurs de croissance etde développement) et des stimuli sensoriels (lumière, molécules olfactives etgustatives). La fixation de l’agoniste entraîne leur activation : ils sont alors capablesd’activer les protéines G spécifiques auxquelles ils sont couplés. Ces dernièrespourront alors stimuler ou inhiber différentes voies de signalisation (Bockaert et Pin,1999 ; Gether, 2000 ; Kobilka, 2002).1. Structure des GPCRsLa caractéristique structurale commune à tous les GPCRs est la présence de7 hélices transmembranaires connectées par trois boucles extracellulaires (E1 à E3)et trois boucles intracellulaires (I1 à I3). L’extrémité N-terminale est positionnée ducôté extracellulaire, tandis que la queue C-terminale est positionnée du côtéintracellulaire et permet, entre autres, l’interaction avec les protéines Gintracellulaires (figure 1) (Bockaert et al., 2002).En fonction de leur topologie, il a été établi un classement des GPCRs : ils sedivisent en trois classes principales qui possèdent toutes un pont disulfure entre lesboucles E1 et E2. La classe A est la famille la plus vaste et la plus étudiée quiregroupe notamment la rhodopsine, les récepteurs olfactifs et les récepteursadrénergiques. Elle est caractérisée par une faible homologie de séquence avecuniquement quelques résidus clés conservés : le domaine DRY localisé au niveau dela boucle I2. Cette région est particulièrement importante lors de la transduction dusignal via la protéine G associée. Pour la majorité de ces récepteurs, le site actif estlocalisé au niveau du domaine transmembranaire. La classe B regroupe quant à elle4

une vingtaine de GPCRs sensibles aux hormones, dont les récepteurs au glucagon,à la calcitonine, et à la GnRH (Gonadrotopin-Releasing Hormone). Elle ne présentepas de caractéristique commune avec la classe A et se distingue par un domaine N-terminal important (environ 100 résidus). C’est d’ailleurs au niveau de ce domaineque se fixent les ligands. Enfin, la classe C regroupe les récepteurs métabotropiquesau glutamate et au GABA B (γ-Amino-Butyric Acid), le récepteur au calcium et lesrécepteurs aux goûts sucré et unami (Kolakowski, 1994 ; Bockaert et al., 2002). Ici,c’est le domaine N-terminal, appelé Venus flytrap, qui est caractéristique de par sonimportance (entre 500 et 600 résidus) et sa structure bilobée au niveau de laquellevient se fixer le ligand.Figure 1 : Topologie des GPCRsL’extrémité N-terminale est extracellulaire, l’extrémité C-terminale intracellulaire. Ils présentent troisboucles extracellulaires (E1 à 3) et trois boucles intracellulaires (I1à 3). Notons la présence d’un pontdisulfure entre les boucles E1 et E2, des sites de N-glycosylation au niveau du domaine N-terminalainsi qu’un site d’acylation par des composés lipidiques au niveau de la pseudo-boucle I4.2. Mécanisme général de la transduction du signalMalgré la grande diversité des GPCRs, le mécanisme fondamental detransduction du signal est conservé (figure 2.A) (Bockaert et Pin, 1999 ; Gether,2000 ; Kobilka, 2002).5

Le GPCR au repos est activé après interaction avec son agoniste au niveaudu domaine extracellulaire ou du domaine transmembranaire. Cette fixation entraînedes changements de conformation du GPCR : on observe une rotation de TM6 dansle sens des aiguilles d’une montre, ainsi qu’un mouvement relatif des TMs 3 et 6 (cequi résulte en leur éloignement) (figure 2.B) (Kobilka, 2002). Le récepteur ainsi activépeut interagir, grâce à sa partie intracellulaire, avec les sous-unités α et βγ de laprotéine G. Au niveau de la sous-unité α de la protéine G ainsi activée, on observeun échange GDP-GTP, et les sous-unités α et βγ sont dissociées. Les 2 sous-unitésvont alors pouvoir réguler l’activité de divers effecteurs membranaires oucytosoliques. Ces effecteurs sont, en général, des canaux ioniques ou des enzymesproductrices d’un second messager assurant une amplification considérable dusignal. Enfin, de par l’activité GTPase intrinsèque de la sous-unité α, la protéine Gest alors réassociée, ce qui stoppe l’interaction avec les effecteurs.Il est à noter que tant que le récepteur est activé par son ligand, le cycled’échange GDP-GTP peut continuer.AFigure 2 : Mécanisme général de la transduction du signal et changements conformationnelsrelatifs du domaine transmembranaireA. Un GPCR au repos (1) est activé par la liaison d'un agoniste spécifique (2). Le changement deconformation du complexe agoniste-récepteur, induit par cette liaison, permet l'activation de l'échangedu GDP par du GTP et donc l'activation de la protéine G hétérotrimérique : les sous-unités Gα et Gβγintracellulaires (3) vont aller réguler l'activité de divers effecteurs membranaires ou cytosoliques (4).Le déclenchement de l'activité phosphatase, intrinsèque à la sous-unité Gα entraîne la réassociationdes sous-untités Gα et Gβγ (5) et le retour à l'état initial (1).B. L’activation du récepteur par la fixation de son agoniste entraîne des changementsconformationnels. On observe la rotation dans le sens des aiguilles d’une montre de TM6 et unéloignement des TMs 3 et 6.6

Il existe trois grands mécanismes permettant de mettre fin au signal induit parle stimulus extracellulaire : c’est la désensibilisation (Perron et al., 2003 ; Perez etKarnik, 2005). Le premier est la régulation de la concentration en agoniste. Lorsquele ligand est relargué dans une fente synaptique, très souvent, deux processusentraînent une diminution de la concentration synaptique en agoniste : il s‘agit de larecapture pré-synaptique et de la dégradation de l’agoniste par des enzymesspécifiques. Le deuxième mécanisme est le découplage fonctionnel parphosphorylation et l’internalisation du complexe ligand-récepteur (figure 3).↓Figure 3 : Internalisation d’un GPCRLe récepteur est découplé de la protéine G par phosphorylation par une GRK (G-protein ReceptorKinase). Le récepteur phosphorylé est reconnu par l’arrestine qui induit son endocytose clathrinedépendante.Il sera alors, soit recyclé à la membrane après déphosphorylation et élimination del’agoniste, soit dégradé après fusion de la vésicule d’endocytose avec le lysosome.Le couplage GPCR-protéine G est peu à peu inhibé grâce à une phosphorylation parles GRK (G-protein Receptor Kinases), la PKA (Protein Kinase A) ou la PKC (ProteinKinase C) de la région intracellulaire du récepteur responsable de l’activation desprotéines G. Le récepteur phosphorylé est alors reconnu par des protéines arrestinesqui se lient au récepteur, et empêchent donc l’échange GDP-GTP au niveau de la7

protéine G. Après liaison des arrestines, le complexe ligand-récepteur est internalisédans des vésicules recouvertes de clathrine. Les récepteurs endocytés peuvent ainsisubir un recyclage à la membrane plasmique (ce qui nécessite unedéphosphorylation du récepteur et une élimination du ligand), ou une dégradationavec la fusion des vésicules d’endocytose avec les lysosomes. Enfin, ladésensibilisation peut faire intervenir la régulation du nombre total de récepteurs à lasurface cellulaire lors d’une exposition longue à l’agoniste. Deux phénomènes sontimpliqués : une diminution de la synthèse des récepteurs et une augmentation deleur dégradation.3. Dimérisation des GPCRsJusqu’à il y a peu de temps, on estimait que les GPCRs existaient etfonctionnaient en tant que monomères. Cependant, de nombreuses étudesbiochimiques et biophysiques ont permis de mettre en évidence des homo- ethétérodimères de GPCRs (Milligan, 2004 ; Bulenger et al., 2005). Il semblerait que,pour la plupart (en particulier ceux de la classe C), la dimérisation soit constitutive etse produise tôt lors de la biosynthèse, à savoir au niveau du réticulumendoplasmique (Terrillon et Bouvier, 2004 ; Bulenger et al., 2005 ; Pin et al., 2005).Dans un dimère, la zone de contact des GPCRs est située au niveau de leurdomaine membranaire, en particulier au niveau de TM6. Un modèle de dimérisationa été proposé, dans lequel les hélices transmembranaires des GPCRs participent àla formation d’un « swapping domain » (figure 4) (Goudson et al., 2000). Ce modèleillustre des résultats expérimentaux obtenus sur des mutants incapables de fixerl’agoniste quand ils sont exprimés seuls et qui recouvrent cette capacité quandd'autres récepteurs fonctionnels sont coexprimés (Monnot et al., 1996). Dans cemodèle proposé, modèle "swapping", la dimérisation des récepteurs fait apparaîtredeux sites actifs similaires à celui du monomère, mais constitué des domainestransmembranaires provenant des deux monomères (Goudson et al., 2000).Cependant, cette hypothèse est largement controversée. Dans le cas des récepteursà la dopamine D2 (D2DR), des expériences réalisées par coexpression d’un mutantponctuel (muté en TM3) avec un mutant tronqué (ne possédant que les TMs 1 à 5)ne permettent pas de restaurer des propriétés de liaison avec leur ligand. Cecidémontre, qu’au moins dans le cas des D2DRs, les TMs 1 à 5 ne peuvent pas8

éaliser de « swapping » avec les TMs 6 et 7 (Lee et al., 2000). Cette étude, ainsique d’autres, remettent en cause ce mécanisme de dimérisation pour tous les autresGPCRs.BFigure 4 : Modèle de dimérisation : le « swapping-domain »A. Les deux protomères sont caractérisés par un site de fixation. Ces deux sites de fixation sontreformés après dimérisation par « swapping ». Le « swapping » consiste en l’interaction entredifférents TMs des deux protomères afin de constituer un dimère fonctionnel.B. Dans le cas de protomères mutés incapables de fixer leur agoniste, on s’attend à ce que ladimérisation par « swapping » restaure la capacité de liaison à l’agoniste.4. Importance des phénomènes de dimérisationa. Rôle de la dimérisation dans l’adressage à la membrane plasmiqueL’export du réticulum endoplasmique est l’étape limitante de la maturation desGPCRs puisque les récepteurs mal "foldés" ou possédant un signal de rétention sontretenus dans le réticulum endoplasmique. La dimérisation intervient alors enpermettant de masquer ces signaux de rétention ou des patchs hydrophobes de cesrécepteurs, ce qui permet le transport du récepteur dimérique au niveau de lamembrane plasmique via la voie de la sécrétion.Supprimé :Supprimé : : le récepteurdimérique pourra ainsi êtretransporté jusqu’à la membraneplasmique9

Dans l’exemple du récepteur GABA B , une hétérodimérisation précoce dans leréticulum endoplasmique est obligatoire. Le récepteur GABA B1 possède un signal derétention au réticulum endoplasmique dans sa partie C-terminale et ne peut êtreexprimé à la membrane plasmique que s'il est associé au récepteur GABA B2 .L’hétérodimérisation de ces récepteurs est assurée par une interaction coiled-coil deleurs extrémités C-terminales, interaction qui masque le signal de rétention durécepteur GABA B1 (Jones et al., 1998 ; Robbins et al., 2001).b. Rôle de la dimérisation dans l’activation du récepteurPour le récepteur GABA B , l’hétérodimérisation de GABA B1 et GABA B2 estnécessaire pour l’obtention d’un récepteur fonctionnel (Galvez et Pin, 2003 ; Pin etal., 2005). Dans le dimère, GABA B1 fixe l’agoniste tandis que GABA B2 en estincapable. En revanche, GABA B1 ne peut pas activer les protéines G. La formationde l’hétérodimère est donc indispensable pour permettre une transactivation oùGABA B1 fixe l’agoniste et GABA B2 active la protéine G (figure 5).Supprimé : eSupprimé : Ainsi, la sous-unitéMis en forme : IndiceSupprimé : peut êtreexprimée à la surface cellulaireMis en forme : IndiceSupprimé : En effet, sonassociation, notamment via uneinteraction de type coiled-coilen C-terminal, masque le signalde rétention et permetl’adressage à la membraneplasmique d’un récepteurfonctionnelFigure 5 : Rôle de la dimérisation dans l’activation des GPCRs : le récepteur au GABA BLe récepteur au GABA B est un hétérodimère constitué de 2 protomères : GABA B1 , seul capable defixer l’agoniste et GABA B2 , seul capable d’activer la protéine G. La dimérisation se fait par interactionde type coiled-coil entre les extrémités C-terminales des 2 protomères. Elle permet de former lerécepteur fonctionnel par transactivation des 2 protomères. Un protomère est constitué de 2 lobes(LB) formant le domaine Venus-flytrap et d’une partie transmembranaire. Les flèches + jaunesreprésentent la transactivation entre les 2 protomères. La flèche + bleue représente l’activation de laprotéine G par le dimère.Supprimé : ed10

c. Rôle de la dimérisation dans l’internalisationPour beaucoup d’hétérodimères, la stimulation d’un seul des protomères estsuffisante pour entraîner la co-internalisation des deux protomères (Perron et al.,2003). Dans d’autres cas, certains récepteurs qui ne subissent pas d'internalisationaprès leur interaction avec leur ligand, empêchent l'internalisation des récepteursauxquels ils sont associés. C’est le cas en particulier du récepteur aux opioïdes κ quiinhibe l’endocytose du récepteur aux opioïdes δ (Terrillon et Bouvier, 2004).5. Le récepteur BLT1Le récepteur BLT1 au LTB 4 (LeukoTriène B 4 ) est un GPCR de classe A, leseul GPCR à avoir été exprimé dans E. coli puis correctement "foldé".D’une part, BLT1 isolé est essentiellement sous forme dimérique (l’interactionentre les deux protomères se fait au niveau de leur TM6), en présence ou enabsence d’agoniste. D’autre part, quand le ligand LTB 4 se fixe sur son récepteur, laforme dimérique de ce récepteur est stabilisée (Banères et Parello, 2003).Le récepteur dimérique interagit avec la protéine G sous forme d’un complexepentamérique (LTB 4 -BLT1) 2 -Gαβγ. Dans le pentamère, il est possible que chaqueprotomère interagisse avec des loci différents de la protéine G.De plus, dans le récepteur BLT1 homodimérique, un phénomène coopératif aété mis en évidence puisque la fixation de l’agoniste sur un seul des protomèresinduit des changements conformationnels du protomère associé libre de tout ligand(Mesnier et Banères, 2004).Enfin, lors de la formation du complexe pentamérique, on observe uneaugmentation de l’affinité du récepteur pour l’agoniste. Ce changement d’affinité estprobablement lié à des changements conformationnels du récepteur quand ilinteragit avec la protéine G (Banères et Parello, 2003).Il apparaît donc que la protéine G contrôlerait les changementsconformationnels du récepteur BLT1 dimérique. Dans la publication « AsymmetricConformational Changes in a GPCR Dimer Controlled by G-Proteins » parue en2006 dans « The EMBO Journal », Damian et al. ont étudié cette hypothèse sur lerécepteur BLT1.Supprimé : ne peuvent passubir d’endocytose induite parle ligand agissent comme desdominants négatifs aprèshétérodimérisation avec unrécepteur capable d’endocyter :Supprimé : cSupprimé :Supprimé : sSupprimé : conformationdimériqueSupprimé : seraitSupprimé : non-chargéSupprimé : enSupprimé : travaillantSupprimé : dimérique11

II. RésultatsDans cette publication, les auteurs ont choisi d’étudier les changementsconformationnels de chaque monomère de récepteur BLT1 lors de la formation dudimère. Les auteurs ont analysé à la fois les changements conformationnels résultantde la fixation de l’agoniste LTB 4 sur un ou deux des protomères, et l’influence ducouplage avec la protéine G sur ces changements conformationnels.Supprimé : OSupprimé : été1. Matériels et méthodesLes auteurs ont travaillé majoritairement sur l’hétérodimère de BLT1 R : R 0(reconstitué dans un environnement de micelles lipidiques) composé du récepteursauvage R et du récepteur mutant R 0 . Ce mutant de BLT1 est caractérisé par unemutation de sa cystéine 97 (localisée au niveau de l’hélice transmembranaire TM3) enalanine. Cette mutation ponctuelle n’affecte pas la structure du récepteur R 0 . Enrevanche, son affinité pour l’agoniste LTB 4 est réduite de 100 fois (la constante dedissociation de BLT1 passe ainsi de 1,8.10 -9 M pour le récepteur sauvage R à2,4.10 -7 M pour le récepteur mutant R 0 ) (Mesnier et Banères, 2004). Du fait de cettedifférence d’affinité pour LTB 4 entre les protomères de l’hétérodimère, il est possiblede charger l’agoniste de façon séquentielle. Ainsi, à faible concentration, LTB 4 se fixesur le site de haute affinité du protomère R, tandis qu’en concentration saturante,LTB 4 sera fixé à la fois sur les sites des récepteurs sauvage et du mutant.Afin de suivre l’activation du dimère de BLT1, et donc ses changementsconformationnels, on fait appel à la fluorescence intrinsèque du tryptophane (Trp).Afin de simplifier l’analyse en faisant abstraction de possibles interférences dans lesspectres d’émission de fluorescence, tous les résidus Trp (excepté le résidu Trp 234du protomère d’intérêt) ont été mutés en leucines dans les protomères du dimèred’étude. Le choix de suivre l’émission de fluorescence du Trp 234 a été fait en prenanten compte les caractéristiques de ce résidu. D’une part, le Trp 234 est localisé dansTM6 qui est connu comme étant le principal domaine impliqué lors de la dimérisation.Supprimé : sur le site de plusfaible affinitéSupprimé : dans la12

D’autre part, le Trp 234 est le seul résidu de BLT1 dont les propriétés de fluorescencesont sensibles à l’activation du récepteur.Supprimé : ieDans le but d’analyser uniquement les changements du protomère d’intérêt (Rou R 0 selon l’expérience), le Trp 234 de ce protomère a été marqué par l’ajout d’ungroupement hydroxy en position 5 (5-OH-Trp 234 ) lors de la biosynthèse dans unesouche d’E. coli auxotrophe pour le Trp. Ainsi, il a été aisé de suivre leschangements de conformation du récepteur en excitant sélectivement le 5-OH-Trp à315 nm et en suivant la fluorescence spécifique à 337 nm.En complément de l’analyse des changements conformationnels du dimère deBLT1 induits par la fixation de l’agoniste, les auteurs ont étudié le couplage durécepteur à la protéine G en observant sa capacité à catalyser l’échange GDP-GTPau niveau de la sous-unité α de la protéine G. Pour cela, ils ont utilisé l’analoguenon-hydrolysable du GTP marqué au soufre 35 ([ 35 S]GTPγS), et ils ont suivi safixation en fonction du temps.Supprimé :En comparant la catalyse de l’échange GDP-GTP par le récepteur BLT1recombinant produit dans E.coli et le récepteur natif dans des fractionsmembranaires de cellules Chem-1 (lignée adhérente de rat, Chemicon) stablementtransfectées avec la séquence du BLT1 humain, il apparaît que le récepteurrecombinant est un bon modèle car il active les protéines G de la même manière quele récepteur in vivo (figure 6).13

Figure 6 : Comparaison de la capacité des récepteurs recombinant et natif à catalyserl’échange GDP-GTP au niveau de la sous-unité αOn observe la fixation de [ 35 S]GTPγS au niveau de la sous-unité α de la protéine G couplée avec lerécepteur BLT1 recombinant exprimé chez E. coli (A), ou le récepteur BLT1 natif exprimé dans desfractions membranaires (B). Les profils de fixation de [ 35 S]GTPγS étant similaires pour les deux typesde récepteurs, on considère que le récepteur exprimé chez E. coli est un bon modèle pour l’étude del’activation de la protéine G.2. Activation de la protéine GL’hétérodimère R : R 0 peut se présenter sous trois formes :‣ L’état R : R 0 dans lequel les deux protomères du dimère sont libres,‣ L’état R L : R 0 dans lequel seul le protomère R possédant le site defixation de haute affinité est chargé par LTB 4 présent en faible concentration,‣ L’état R L : R L 0 dans lequel les deux sites de haute et faible affinitéssont chargés par LTB 4 présent en concentration saturante.Pour les états R L : R 0 et R L : R L 0 , les mêmes profils de fixation du GTP ont étéobservés (figure 7.A), ces profils étant caractérisés par une augmentation de lafixation de [ 35 S]GTPγS en fonction du temps. Ce résultat a permis de conclure que laSupprimé :Supprimé : ’amener à laSupprimé : sion14

fixation de l’agoniste LTB 4 sur un seul des protomères du dimère de BLT1 suffit àl’activation complète de la protéine G associée.Etant donnés ces résultats, les auteurs se sont interrogés sur la nécessité dela dimérisation pour l’activation de la protéine G. Afin de répondre à cette question, lecomplexe pentamérique formé par la protéine G hétérotrimérique et le dimère deBLT1 chargé par deux molécules de LTB 4 a été mis en présence du peptide isoléTM6 (Banères et Parello, 2003). Ce peptide permet de dissocier le dimère, et ainsid’observer la capacité du monomère à catalyser l’échange GDP-GTP au niveau de lasous-unité α de la protéine G, c’est-à-dire à activer la protéine G (figure 7.B). Pour lemonomère sauvage, de même que pour le monomère mutant, sa capacité à activerla protéine G a été mise en évidence. Cependant, l’échange GDP-GTP qui a pu êtreobservé est plus lent que pour la forme dimérique du récepteur. Ceci indique que,bien que la protéine G puisse être activée par la forme monomérique de BLT1, sonactivation complète nécessite la dimérisation du récepteur.Figure 7 : Fixation de [ 35 S]GTPγS à la protéine G, enSupprimé :présence du dimère R : R 0 à demi-chargé ou complètementchargé ou en présence du monomère BLT1 chargé parLTB 4A. Echange GDP-GTP au niveau de la sous-unité αcatalysé par le dimère en absence d’agoniste (cercles),après fixation de l’agoniste sur le site de haute affinitéde R (carrés), et en concentration saturante en LTB 4(triangles).B. Echange GDP-GTP au niveau de la sous-unité αcatalysé par le récepteur BLT1 sauvage en présencede concentration saturante en LTB 4 , et en absence(cercles vides) ou en présence (cercles remplis) dupeptide TM6.15

3. Changements conformationnels de l’hétérodimèreR : R 0 induits par l’agonistea. Changements conformationnels du récepteur RAfin de suivre sélectivement les changements conformationnels du protomèresauvage au niveau de l’hétérodimère R : R 0 , celui-ci a été marqué par le 5-OH-Trpen position 234. Puis, l’hétérodimère a été stimulé avec l’agoniste LTB 4 en présenceou non de protéine G.Supprimé : e RSupprimé :Supprimé : celui-ci a étémarqué avec leIl est apparu qu’en absence ou en présence de protéine G, les changementsconformationnels subits par R après fixation de LTB 4 séquentiellement sur R et R 0sont identiques. A faible concentration d'agoniste, LTB 4 se fixe au niveau du site dehaute affinité de R (état R L : R 0 ), R se retrouve alors dans son état complètementactif. De plus, R ne subit pas de changement conformationnel supplémentaire enconcentration saturante de LTB4. Dans ces conditions, une deuxième molécule deLTB 4 se fixe au niveau du site de faible affinité de R 0 (état R L : R L 0 ) (figure 8).Supprimé : quandSupprimé : laSupprimé : estMis en forme : IndiceSupprimé : Lorsqu’enSupprimé :Supprimé : quand, enconcentrationFigure 8 : Activation du protomère R dansl’hétérodimère R : R 0 en absence et présence deprotéine GA. En absence de protéine G, fixation de LTB 4 sur R :R 0 (ratio de fixation X, carrés vides) etchangements normalisés dans la fluorescence du5-OH-Trp 234 du protomère R (carrés remplis) enfonction du log de la concentration en LTB 4 .B. En présence de protéine G, fixation de LTB 4 sur R :R 0 (ratio de fixation X, carrés vides) etchangements normalisés dans la fluorescence du5-OH-Trp 234 du protomère R (carrés remplis) enfonction du log de la concentration en LTB 4 .Les états R L : R 0 et R L : R L 0 sont indiqués sur lacourbe.16

. Changements conformationnels du récepteur R 0Afin de suivre sélectivement les changements conformationnels du protomèremutant au niveau de l’hétérodimère R : R 0 , celui-ci a été marqué avec le 5-OH-Trp enposition 234. Puis, l’hétérodimère a été stimulé avec l’agoniste LTB 4 en présence ounon de protéine G.Supprimé :Les résultats obtenus se sont avérés différents de ceux obtenus pour leprotomère sauvage (figure 9).En absence de protéine G (figure 9.A), l’activation du récepteur R 0 se fait endeux temps. En faible concentration d'agoniste, LTB 4 se fixe sur le site de hauteaffinité de R (état R L : R 0 ), R 0 passe alors dans un état conformationnel intermédiaireentre les états inactif et actif. En concentration saturante, LTB 4 se fixe au niveau dusite de faible affinité de R 0 (état R L : R L 0 ), le récepteur mutant entre ainsi dans sonétat complètement actif.En présence de protéine G (figure 9.B), tout comme en absence de protéineG, en faible concentration d'agoniste, LTB 4 se fixe sur le site de haute affinité de R(état R L : R 0 ), R 0 passe alors dans un état conformationnel intermédiaire. EnSupprimé : Tout d’abord,lorsqu’eSupprimé : nfin, lorsqu’eSupprimé : , lorsqu’erevanche, en concentration saturante, la deuxième molécule de LTB 4 se fixe sur R 0(état R L : R L 0 ), mais R 0 ne subit alors pas de changement conformationnelsupplémentaire et reste donc dans son état intermédiaire.Figure 9 : Activation du protomère R 0 dans l’hétérodimère R :R 0 en absence et présence de protéine GA. En absence de protéine G, fixation de LTB 4 sur R : R 0(ratio de fixation X, carrés vides) et changementsnormalisés dans la fluorescence du 5-OH-Trp 234 duprotomère R 0 (carrés remplis) en fonction du log de laconcentration en LTB 4 .B. En présence de protéine G, fixation de LTB 4 sur R : R 0(ratio de fixation X, carrés vides) et changementsnormalisés dans la fluorescence du 5-OH-Trp 234 duprotomère R 0 (carrés remplis) en fonction du log de laconcentration en LTB 4 .Les états R L : R 0 et R L : R L 0 sont indiqués sur la courbe.17

Ces résultats ont permis de souligner le fait que le couplage du dimère BLT1 à laprotéine G influence les changements conformationnels du récepteur, notamment enempêchant le protomère R 0 d’atteindre sa conformation pleinement active.4. Caractéristiques conformationnels du dimère BLT1 enprésence d'une concentration saturante de LTB 4a. Hétérodimère R L L: R 0En absence de protéine G et en concentration saturante en LTB 4 , les deuxprotomères de l’hétérodimère présentent les mêmes spectres d’émission deSupprimé : complètementchargéMis en forme : Indicefluorescence, et donc les mêmes caractéristiques conformationnels. En effet, R et R 0se retrouvent tous deux dans leur état complètement actif (figure 10.A).Cependant, en présence de protéine G et en concentration saturante en LTB 4 ,les spectres d’émission de fluorescence de R et R 0 diffèrent. Seul le protomèresauvage atteint l’état complètement actif tandis que le protomère mutant reste bloquédans l’état intermédiaire (figure 10.B).Ces résultats indiquent que la protéine G induit une conformation asymétriquedu dimère BLT1.Figure 10 : Conformations de R et R 0 en absence ou enprésence de protéine GA. Spectre d’émission de fluorescence de R ou R 0marqués au 5-OH-Trp, en absence de protéine G eten absence ou présence de concentration saturanteen LTB 4 .B. Spectre d’émission de fluorescence de R ou R 0marqués au 5-OH-Trp, en présence de protéine G eten absence ou présence de concentration saturanteen LTB 4 .18

. Homodimère R L : R LEn absence de protéine G et en concentration saturante en LTB 4 , lesprotomères sauvages présentent les mêmes spectres d’émission de fluorescenceque les protomères sauvage et mutant dans l’hétérodimère R L : R L 0 . Tous les deuxse retrouvent donc leur état pleinement actif (figure 11).De la même façon que pour l’hétérodimère R L : R L 0 , en présence de protéineG et en concentration saturante en LTB 4 , un seul des deux protomères est présentdans son état actif tandis que l’autre reste bloqué dans l’état intermédiaire (figure 11).Il apparaît donc que, comme pour l’hétérodimère R L : R L 0 , la protéine G induitune conformation asymétrique du dimère BLT1 dans laquelle un seul des protomèresest présent dans son état complètementactif.Figure 11 : Activation du récepteur dans le dimèreBLT1 en absence ou présence de protéine GLa figure représente les changements normalisés de lafluorescence dans l’hétérodimère R : R 0 et dansl’homodimère R : R en absence et en présence de protéineG. Dans tous les cas d’étude, seul un des protomères dudimère est marqué au 5-OH-Trp 234 : R 0 dans l’hétérodimèreet un des protomères R dans l’homodimère.Les barres d’erreur correspondent à la déviation standardde la valeur moyenne calculée sur trois expériencesindépendantes.19

5. ConclusionD’une part, cette étude a permis de mettre en évidence le fait que l’activationd’un seul des protomères d’un récepteur BLT1 dimérique permet de déclencherl’activation complète de la protéine G. De plus, le monomère est lui-même capabled’assurer l’activation de la protéine G. Cependant, l’activation complète nécessitel’étape de dimérisation du récepteur. On peut donc supposer que cette dimérisationaugmente l’efficacité de couplage du fait que les deux protomères interagissent avecdes régions distinctes de la protéine G associée.D’autre part, la preuve a été apportée que la protéine G est responsable dufonctionnement asymétrique du dimère BLT1 : en concentration saturante enagoniste LTB 4 , un seul des protomères est complètement activé, l’autre restantbloqué dans un état intermédiaire entre états inactif et actif.Supprimé :Supprimé : D’une part, cSupprimé : . De plus, lemonomère est lui-mêmecapable d’assurer l’activationde la protéine GSupprimé : laSupprimé :Pour résumer, le fait qu’un seul des protomères soit capable d’activer laprotéine G démontre que ce protomère interagit avec la sous-unité α de la protéineG. Le deuxième protomère, voyant sa conformation limitée par le couplage avec laprotéine G, interagit lui-aussi de façon spécifique avec son partenaire intracellulaire.Cependant, il reste encore à déterminer si cette interaction se fait également auniveau de la sous-unité α sur une région distincte de celle avec laquelle interagit lepremier protomère, ou si elle se fait au niveau de la sous-unité βγ de la protéine G.Supprimé : De plus, lSupprimé : (mais avecSupprimé : )III. Projet de rechercheLes principales études menées sur le récepteur au LTB 4 ont permis de mettreen évidence son homodimérisation in vitro. Le récepteur BLT1 humain a été produitchez E. coli puis correctement foldé (Banères et al., 2003). Ce récepteur recombinantprésente, en présence de protéine G, une affinité pour LTB 4 (la constante dedissociation K d mesurée est de 1,8.10 -9 M) qui est très proche de celle du récepteur20

humain exprimé dans les cellules Cos-7 (K d ≈ 10 -9 M). De plus, le récepteur isolédans du détergent est capable d’activer l’échange GDP-GTP au niveau de la sousunitéα de la protéine G associée, et ce, en présence de concentration saturante deLTB 4 . Enfin, le récepteur interagit de manière spécifique avec la sous-unité Gαitandis qu’il est incapable d’interagir avec la sous-unité Gαq (Banères et Parello,2003). Tous ces éléments prouvent que le récepteur recombinant BLT1 est un bonmodèle pour l’étude du récepteur natif.En 2004, Mesnier et Banères ont montré que, solubilisé dans un détergentadéquat (dans notre cas, l’hexadecyl-β-D-maltoside), le récepteur BLT1 recombinantest présent essentiellement sous forme dimérique, et ce, en présence ou nond’agoniste. En outre, la présence de l’agoniste LTB 4 stabilise ces dimères. De lamême façon, il a été montré que BLT1 recombinant dimérise dans des liposomesreconstitués. Ces différentes observations laisseraient penser que BLT1homodimérise in vivo.De plus, des expériences de cross-link chimique ont permis d’estimer l’étatd’oligomérisation du récepteur BLT1 recombinant solubilisé dans du détergent et enprésence de protéine G purifiée. L’analyse par gel-filtration puis SDS-PAGE descomplexes formés a mis en évidence la formation d’un complexe pentamériqueconstitué d’un dimère de BLT1 et d’une protéine G hétérotrimérique (Banères etParello, 2003).Enfin, plus récemment, Damian et al. (2006) se sont interrogés sur le rôle dela dimérisation dans l’activation de la protéine G. Pour cela, le récepteur BLT1reconstitué dans des liposomes a été mis en présence du peptide TM6 afin dedissocier les dimères. Cette expérience a révélé que les monomères sont capablesd’activer la protéine G, mais de manière moindre que le récepteur sous formedimérique. Le rôle de la dimérisation dans l’activation de la protéine G n’est donc pasclairement défini.En fin de compte, les études précédentes ayant été menées uniquement invitro sur un récepteur recombinant, on peut se demander si la dimérisation observéene résulterait pas d’un artefact expérimental. Il serait donc intéressant de confirmerpar des expériences supplémentaires les résultats obtenus précédemment in vitro,ainsi que de prouver l’existence de l’homodimérisation de BLT1 in vivo.21

1. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vitroComme décrit par Banères et al. (2003), le récepteur BLT1 recombinant estproduit chez E. coli dans un vecteur pET21b (figure 12). Il est exprimé en fusion avecun tag His en C-terminal. Après induction par l’IPTG, le récepteur BLT1 est produiten corps d'inclusion. Après solubilisation dans l'urée 8 M, le récepteur est purifié surcolonne Ni-NTA (Nickel- NitriloTriacetic Acid), puis refoldé. Enfin, le tag C-terminalest clivé par digestion à la thrombine.Supprimé : la fractionmembranaire est récupéréepuis dénaturée dans l’urée. Lerécepteur recombinant est alorspurifiéAmp RHis-tagMCSPromoteur T7pET21b(5442 pb)lac IoripBR322Figure 12 : Vecteur pET21bCe vecteur comprend une origine de réplication bactérienne (ori pBR322), un gène de sélection(Amp R ) permettant la synthèse d’une β-lactamase, un promoteur T7 régulé par un opérateur lac O, legène lac I permettant la régulation de l’opérateur lac O et enfin un tag histidine que l’on retrouvera enC-terminal de notre protéine de fusion. La protéine d'intérêt est clonée en utilisant les sites uniques derestriction du site de clonage multiple (MCS).Le problème majeur rencontré lors de la production du récepteur recombinantest sa surexpression. En effet, celle-ci pourrait être à l’origine d’une dimérisationartefactuelle. Par exemple, il a été montré pour le récepteur à la neurotensine NST1(GPCR de classe A) que, pour une faible concentration en détergent,l’oligomérisation du récepteur est dépendante de sa concentration. En effet, à faible22

concentration, il est présent sous forme monomérique, tandis qu’à forteconcentration, il dimérise (White et al., 2007).Il serait donc utile d’étudier si la concentration du récepteur BLT1 recombinanta un effet sur son état d’oligomérisation.Il a été précédemment montré que le détergent hexadecyl-β-D-maltoside estidéal pour l’étude de la dimérisation de BLT1 (Mesnier et Banères, 2004). C’estpourquoi nous travaillons avec ce dernier à faible concentration. En effet, de fortesconcentrations en détergent pourraient interférer avec la dimérisation du récepteur.Cette étude nécessite une gamme de concentrations de BLT1 purifié etsolubilisé dans le détergent. Puis, une gel-filtration permet de déterminer la massemoléculaire des espèces présentes en solution sachant, qu’en théorie, les massesmoléculaires des monomère et dimère sont respectivement de 37,9 kDa et 75,8 kDa.Enfin, une électrophorèse en conditions non-dénaturantes permet d’estimer laproportion de chaque espèce pour une concentration de BLT1 donnée.Des expériences contrôles peuvent être réalisées en utilisant différentsdétergents tels que le β-D-dodecyl maltoside dans lequel le récepteur est présentdans un équilibre monomère-dimère (Mesnier et Banères, 2004). Ceci nous permetde vérifier que ce n’est pas l’utilisation d’un détergent particulier qui induit ladimérisation. De plus, le Kd du dimère peut être également modifié par laconcentration du détergent (White et al., 2007). Il est donc nécessaire de réaliser uncontrôle supplémentaire où la dimérisation est étudiée pour une concentration élevéeen détergent.En supposant que l’homodimérisation de BLT1 en présence de détergent soitconfirmée in vitro par cette expérience, on pourra alors orienter notre étude surl’existence de cette même homodimérisation in vivo.23

2. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vivoa. Immunoprécipitation à partir de membranes de leucocytesL’anticorps polyclonal de lapin dirigé contre le récepteur BLT1 humain étantdisponible (GeneTex), il est possible de réaliser une immunoprécipitation afin devérifier la dimérisation du récepteur in vivo.Le récepteur BLT1 est majoritairement exprimé chez l’homme dans lesleucocytes, c’est pourquoi nous choisissons de travailler sur des membranes deleucocytes humains.La démarche expérimentale est de purifier les leucocytes à partird’échantillons sanguins. Puis, les cellules sont soumises à un cross-link et une lyse.La fraction membranaire ensuite récupérée est solubilisée dans du détergent. Onpeut alors réaliser l’immunoprécipitation afin de récupérer les complexes stabiliséspar le cross-linker. Ces complexes sont ensuite analysés sur gel natif dans le but devérifier la présence de l’homodimère dont la taille attendue est d’environ 76 kDa. Onpeut également s’attendre à détecter le complexe pentamérique (dimère BLT1-protéine G) qui a une masse théorique de 161,9 kDa (Banères et Parello, 2003).Les bandes correspondant à ces différentes espèces peuvent enfin êtreanalysées par spectrométrie de masse pour déterminer leur masse moléculaireexacte, et par spectrométrie de masse en tandem afin d’identifier les partenaires deBLT1 dans ces complexes.Cependant, le problème majeur de l’immunoprécipitation est la possibilitéd’agrégation artefactuelle des récepteurs suivant les conditions de solubilisation etde précipitation utilisées. En effet, les GPCRs sont de nature hydrophobe et ont donctendance à s’agréger en solution. Il est alors important de réaliser des expériencesde contrôle pour évaluer ce problème. D’une part, il sera pertinent de tester différentsdétergents aux propriétés physico-chimiques variées (par exemple : β-D-dodecylmaltoside et hexadecyl-β-D-maltoside) afin d’être sûr que le détergent n’est pas àl’origine des interactions observées. D’autre part, il faudra également tester différentsagents cross-linkers (tels que : le formaldéhyde, le 2-iminothiolane hydrochloride et ledithiobis [succinimidyl propionate]) pour les mêmes raisons.24

. Expériences de BRETLe FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) et le BRET(Bioluminescence Resonance Energy Transfer) sont des techniques très utiliséespour visualiser directement les dimères de GPCR dans les cellules vivantes. LeBRET mesure le transfert d’énergie provenant de la dégradation catalytique de lacoelenterazine par la Renilla luciférase (Rluc) vers l’accepteur EYFP (EnhancedYellow Fluorescent Protein) qui émet de la fluorescence en retour. L’excitationd’EYFP est directement dépendante de la proximité moléculaire entre le donneur(Rluc) et l’accepteur (EYFP) (figure 13).ABFigure 13 : Le principe du BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)A. La coelenterazine, substrat de la Renilla luciférase (Rluc) est dégradé, ce qui libère une énergielumineuse mesurable à 480 nm. Si EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) est localisée àmoins de 50 Ǻ, il y a transfert d’énergie du donneur (Rluc) vers l’accepteur (EYFP) et émission defluorescence à 530 nm.B. Le BRET a largement été utilisé pour détecter la dimérisation des GPCRs à la membraneplasmique.25

Nous choisirions d’utiliser le BRET plutôt que le FRET car cette techniqueprésente plusieurs avantages :- Par BRET, l’excitation d’EYFP est mesurable quand les deuxprotéines sont localisées à une distance maximale de 50 Ǻ, contre100 Ǻ pour le FRET.- La méthode BRET ne nécessite pas une excitation de fluorescencepar une source lumineuse externe, contrairement au FRET. Cettetechnique n’endommage donc pas les cellules et est insensible auphotoblanchiement.Dans le but de réaliser cette expérience, il est nécessaire d’exprimer lerécepteur BLT1 recombinant dans des cellules mammifères. Pour cela, nouschoisissons des cellules Cos-7 puisque des études antérieures sur BLT1recombinant ont déjà été menées dans cet hôte (Banères et Parello, 2003). Commedécrit par Kroeger et al. (2001), l’ADNc de BLT1 est cloné par PCR dans le vecteurpcDNA3 (Invitrogen) (figure 14), dans lequel on a également inséré en C-terminal larégion codante soit pour Rluc (récepteur donneur), soit pour EYFP (récepteuraccepteur).Figure 14 : Vecteur pcDNA3Ce vecteur eucaryote va être utilisé pourexprimer le récepteur BLT1 en fusion avec soitRluc, soit EYFP en C-terminal. Il estcaractérisé par un gène de résistanceprocaryote à l’ampicilline, un gène derésistance eucaryote à la néomycine, uneorigine de réplication f1, ainsi qu’un promoteurCMV (CytoMegaloVirus).26

Les deux plasmides sont alors transfectés dans les cellules hôtes, puis aprèsajout du substrat de la Renilla luciférase, à savoir, la coelenterazine, on mesure lafluorescence à 480 nm (émission de Rluc) et à 530 nm (émission d’EYFP). Afin devérifier que l’émission de lumière à 530 nm est bien spécifique d’EYFP, on mesure lafluorescence à 530 nm dans une cellule transfectée par la construction BLT1/Rlucseule, aucun signal ne devra alors être détecté. Le signal BRET est quantifié par lecalcul du ratio : (lumière émise à 530 nm) / (lumière émise à 480 nm).Avant tout, il est nécessaire de valider nos constructions en vérifiant qu’ellespartagent les mêmes caractéristiques que le récepteur BLT1 natif. Pour cela, on peututiliser la microscopie confocale afin de démontrer que les protéines de fusion sontbien exprimées à la membrane plasmique. De plus, des expériences de fixation deLTB 4 radioactif permettront de s’assurer que les fusions ne modifient pas l’affinité durécepteur pour son agoniste naturel.Si une homodimérisation est observée, d’autres contrôles pourront êtreenvisagés (figure 15). D’une part, en contrôle positif, on pourra utiliser une fusionentre Rluc et EYFP qui devra donner un signal BRET plus important que nosconstructions BLT1/Rluc et BLT1/EYFP. D’autre part, afin de démontrer que le signalobservé ne résulte pas d’une interaction non-spécifique entre Rluc et EYFP, on coexprimeraRluc et EYFP (non-fusionnées) dans des cellules Cos-7 : aucun signal nedevra être enregistré. Enfin, pour vérifier la spécificité d’interaction entre les deuxmonomères BLT1, deux contrôles sont envisageables :- D’une part, la co-expression de BLT1/Rluc avec la constructionrécepteur β 2 -adrénergique/EYFP. Ces deux récepteurs n’étant passensés hétérodimériser, aucun signal ne devra être détecté.- D’autre part, la co-expression de BLT1/Rluc, BLT1/EYFP et BLT1non taggué : dans ce cas, le récepteur sauvage entrera encompétition avec les deux autres, ce qui devra résulter en unediminution du signal.Enfin, il a été montré précédemment que LTB 4 stabilise la dimérisation(Banères et Parello, 2003). Donc, en traitant avec LTB 4 les cellules co-exprimantBLT1/Rluc et BLT1/EYFP, les dimères étant favorisés, on devra observer uneaugmentation du signal.27

ABLT1 Rluc+ Signal ++BLT1 EYFPBRluc EYFP Signal +++CRluc+ EYFPSignalDBLT1 Rluc+ Signalβ 2 R EYFPBLT1BLT1+RlucEYFPSignal +E+BLT1Figure 15 : Expériences de BRETA. Constructions co-exprimées dans les cellules Cos-7 pour tester l’homodimérisation.B. Contrôle positif : fusion de Rluc et EYFP. Le signal BRET obtenu doit être optimal.C. Contrôle négatif : co-expression de Rluc et EYFP non-fusionnées. Ce contrôle permet de vérifierqu’il n’y a pas d’interaction non-spécifique entre les deux tags et donc pas de signal BRET.D. Contrôle permettant de vérifier la spécificité de l’homodimérisation de BLT1. Le récepteur β 2 -adrénergique n’étant pas sensé dimériser avec BLT1, aucun signal ne devra être observé quand lesdeux constructions sont co-exprimées dans les cellules Cos-7.E. Contrôle supplémentaire permettant de vérifier la spécificité de l’homodimérisation. Quand les deuxfusions sont co-exprimées avec le BLT1 sauvage (non-taggué), il y a compétition et donc diminutiondu signal.Après avoir démontré que BLT1 homodimérise in vivo, on peut se demander àquelle étape de la biosynthèse du récepteur cette dimérisation se produit. A savoir sicomme pour le récepteur GABA B , elle se produit dans le réticulum endoplasmique(Terrillon et Bouvier, 2004 ; Bulenger et al., 2005 ; Pin et al., 2005) ou aprèsadressage à la membrane plasmique.28

c. Localisation cellulaire de la dimérisation de BLT1Dans ce but, une étude utilisant la bréfeldine A, drogue qui bloque la formationdes vésicules allant du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi, peut êtreréalisée.On utilise la même construction que précédemment, soit une co-expressiondans les cellules Cos-7 de BLT1/Rluc et BLT1/EYFP. Puis, les cellules transfectéessont traitées à la bréfeldine A : les récepteurs sont donc bloqués au niveau duréticulum endoplasmique. Ainsi, si un signal BRET est détecté, cela signifie que ladimérisation se produit dans le réticulum endoplasmique.Comme contrôle positif, on pourra utiliser des cellules Cos-7 exprimant lesrécepteurs GABA B1 /Rluc et GABA B2 /EYFP. Après traitement à la bréfeldine A, ons’attendra à observer un signal BRET étant donné que le récepteur GABA B dimériseau niveau du réticulum endoplasmique.3. PerspectivesS’il apparaît que l’homodimérisation de BLT1 est bien confirmée in vivo, il seraalors intéressant d’étudier sa capacité à hétérodimériser avec d’autres GPCRs de lamême famille ou partageant une plus faible homologie. En effet, il a été montré quepar exemple, les récepteurs δ-opioïde et κ-opioïde sont capables de s’associer.L’hétérodimérisation pourra être mise en évidence par coimmunoprécipitation.Il est à noter que l’expérience d’immunoprécipitation sur lesmembranes de leucocytes envisagée dans notre projet de recherche peut déjàrévéler la présence de nouveaux partenaires de BLT1. Ces protéines seront alorsidentifiées par une analyse de spectrométrie de masse en tandem. Aprèscaractérisation des partenaires, une analyse par BRET pourra confirmer l’existencede tels hétérodimères dans les cellules vivantes.La découverte d’hétérodimères pourrait avoir une importance physiologique etpharmacologique. En effet, si les deux monomères de l’hétérodimère activent desprotéines G différentes, on peut supposer que de nouvelles voies de signalisationpourront être activées. De plus, en utilisant des ligands bivalents, il serait alorspossible de cibler spécifiquement ces hétérodimères, dans le cas où ilsprésenteraient un intérêt thérapeutique.29

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Figure 1 : Topologie des GPCRsL’extrémité N-terminale est extracellulaire, l’extrémité C-terminale intracellulaire. Ilsprésentent 3 boucles extracellulaires (E1 à 3) et 3 boucles intracellulaires (I1à 3).Notons la présence d’un pont disulfure entre les boucles E1 et E2, des sites de N-glycosylation au niveau du domaine N-terminal ainsi qu’un site d’acylation par descomposés lipidiques au niveau de la pseudo-boucle I4.

AFigure 2 : Mécanisme général de la transduction du signal et changementsconformationnels relatifs du domaine transmembranaireA. Un GPCR au repos (1) est activé par la liaison d'un agoniste spécifique (2). Lechangement de conformation du complexe agoniste-récepteur, induit par cetteliaison, permet l'activation de l'échange du GDP par du GTP et donc l'activation de laprotéine-G hétérotrimérique : sous-unités Gα et Gβγ intracellulaires (3) qui vontaller réguler l'activité de divers effecteurs (4) membranaires ou cytosoliques. Ledéclenchement de l'activité phosphatase, intrinsèque à la sous-unité G entraîne laréassociation des sous-untités Gα et Gβγ (5) et le retour à l'état initial (1).

B. L’activation du récepteur par la fixation de son agoniste entraîne un changementconformationnel. On observe la rotation dans le sens des aiguilles d’une montre deTM6 et un éloignement des TMs 3 et 6.↓Figure 3 : Internalisation d’un GPCRLe récepteur est découplé de la protéine G par phosphorylation par la GRK (GproteinReceptor Kinase). Le récepteur phosphorylé est reconnu par l’arrestine quiinduit son endocytose clathrine-dépendante. Il sera alors, soit recyclé à la membraneaprès déphosphorylation et élimination de l’agoniste, soit dégradé après fusion de lavésicule d’endocytose avec le lysosome.