La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G (2008) - M2 ...

1. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vitroComme décrit par Banères et al. (2003), le récepteur BLT1 recombinant estproduit chez E. coli dans un vecteur pET21b (figure 12). Il est exprimé en fusion avecun tag His en C-terminal. Après induction par l’IPTG, le récepteur BLT1 est produiten corps d'inclusion. Après solubilisation dans l'urée 8 M, le récepteur est purifié surcolonne Ni-NTA (Nickel- NitriloTriacetic Acid), puis refoldé. Enfin, le tag C-terminalest clivé par digestion à la thrombine.Supprimé : la fractionmembranaire est récupéréepuis dénaturée dans l’urée. Lerécepteur recombinant est alorspurifiéAmp RHis-tagMCSPromoteur T7pET21b(5442 pb)lac IoripBR322Figure 12 : Vecteur pET21bCe vecteur comprend une origine de réplication bactérienne (ori pBR322), un gène de sélection(Amp R ) permettant la synthèse d’une β-lactamase, un promoteur T7 régulé par un opérateur lac O, legène lac I permettant la régulation de l’opérateur lac O et enfin un tag histidine que l’on retrouvera enC-terminal de notre protéine de fusion. La protéine d'intérêt est clonée en utilisant les sites uniques derestriction du site de clonage multiple (MCS).Le problème majeur rencontré lors de la production du récepteur recombinantest sa surexpression. En effet, celle-ci pourrait être à l’origine d’une dimérisationartefactuelle. Par exemple, il a été montré pour le récepteur à la neurotensine NST1(GPCR de classe A) que, pour une faible concentration en détergent,l’oligomérisation du récepteur est dépendante de sa concentration. En effet, à faible22