La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G (2008) - M2 ...

2. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vivoa. Immunoprécipitation à partir de membranes de leucocytesL’anticorps polyclonal de lapin dirigé contre le récepteur BLT1 humain étantdisponible (GeneTex), il est possible de réaliser une immunoprécipitation afin devérifier la dimérisation du récepteur in vivo.Le récepteur BLT1 est majoritairement exprimé chez l’homme dans lesleucocytes, c’est pourquoi nous choisissons de travailler sur des membranes deleucocytes humains.La démarche expérimentale est de purifier les leucocytes à partird’échantillons sanguins. Puis, les cellules sont soumises à un cross-link et une lyse.La fraction membranaire ensuite récupérée est solubilisée dans du détergent. Onpeut alors réaliser l’immunoprécipitation afin de récupérer les complexes stabiliséspar le cross-linker. Ces complexes sont ensuite analysés sur gel natif dans le but devérifier la présence de l’homodimère dont la taille attendue est d’environ 76 kDa. Onpeut également s’attendre à détecter le complexe pentamérique (dimère BLT1-protéine G) qui a une masse théorique de 161,9 kDa (Banères et Parello, 2003).Les bandes correspondant à ces différentes espèces peuvent enfin êtreanalysées par spectrométrie de masse pour déterminer leur masse moléculaireexacte, et par spectrométrie de masse en tandem afin d’identifier les partenaires deBLT1 dans ces complexes.Cependant, le problème majeur de l’immunoprécipitation est la possibilitéd’agrégation artefactuelle des récepteurs suivant les conditions de solubilisation etde précipitation utilisées. En effet, les GPCRs sont de nature hydrophobe et ont donctendance à s’agréger en solution. Il est alors important de réaliser des expériencesde contrôle pour évaluer ce problème. D’une part, il sera pertinent de tester différentsdétergents aux propriétés physico-chimiques variées (par exemple : β-D-dodecylmaltoside et hexadecyl-β-D-maltoside) afin d’être sûr que le détergent n’est pas àl’origine des interactions observées. D’autre part, il faudra également tester différentsagents cross-linkers (tels que : le formaldéhyde, le 2-iminothiolane hydrochloride et ledithiobis [succinimidyl propionate]) pour les mêmes raisons.24