Etude de Pax 3 dans la différenciation des cellules souches - M2 ...

(Genscript) fixé à des billes de sépharose. Ceci est possible du fait que la β caténine est prêt
de la séquence d’ADN. Il faut noter qu’une étape préalable de Clearing des billes aura lieu,
celle–ci ayant pour but d’enlever toute protéine se liant de façon non spécifique aux billes.
Une fois l’ADN décrosslinké du complexe, les séquences d’ADN piégées (promoteurs de Myf
5 et Myo D) seront amplifiées par PCR. Les amorces utilisées pour amplifier la région
promotrice de Myf 5 encadreront la région de 145 pb et les amorces utilisées pour amplifier le
promoteur de Myo D encadreront la région enhancer de 258 pb. L’expérience contrôle
consistera à amplifier avec les mêmes amorces, de l’ADN prélevé avant
l’immunoprécipitation. Cette étape permet de vérifier l’état de la chromatine et le bon
fonctionnement des amorces.
e) Détermination des partenaires de la β caténine par Co immunoprécipitation
Que les résultats du ChIP soient positifs ou négatifs, les différents partenaires de la β
caténine seront identifiés par une expérience de Co immunoprécipitation (CoIP).
A partir d’un lysat de cellules C2C12 induites, la CoIP est réalisée avec un anticorps
(Genscript) dirigé contre la β caténine. Cet anticorps sera couplé à des billes de sépharose
dans le but de piéger la β caténine avec tous ses partenaires. Comme dans la ChIP, une étape
supplémentaire de clearing sera effectuée sur les billes de sépharose. Après avoir purifié le
complexe β caténine/partenaires et afin d’identifier ces partenaires, un gel SDS PAGE 1D
sera effectué. Chacun des spots révélés au Bleu de Coomassie sera soumis à une digestion
trypsique puis à une analyse en spectrométrie de masse : MALDI TOF MS puis une
vérification sera effectuée en LC-MS/MS.
Dans le cas où la β caténine a un effet inhibiteur sur l’induction de la différentiation,
alors il faudra regarder comment cette protéine agit sur les facteurs de transcription tels que
Pax 3.
Dans le cas où la β caténine n’aurait aucun effet inhibiteur sur la différentiation, les
recherches devront être orientées vers d’autres protéines impliquées dans la voie Wnt ou alors
vers des inhibiteurs transcriptionnels tels que ceux de la famille Groucho.
Cependant, cette technique de CoIP nous indiquera un certain nombre de
partenaires dont certains n’auront aucun intérêt par rapport aux promoteurs. Toutefois, ceci
nous permettra d’avoir une idée générale sur les partenaires de la β caténine.
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