Etude de Pax 3 dans la différenciation des cellules souches - M2 ...

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Résumé Les mélanocytes sont des cellules différenciées pourvues de la machinerie enzymatique permettant la synthèse de mélanine, responsable de la pigmentation de la peau. Lors de l’embryogenèse, le tube neural génère les cellules de la crête neurale. Ces cellules migrant dans la voie dorsolatérale, c'est-à-dire entre les somites et l’ectoderme, se différencieront ultérieurement en mélanocytes. Le développement des cellules du lignage mélanocytaire est un processus pendant lequel il y a prolifération et différenciation cellulaire. Les facteurs de transcription Mitf, Sox 10 et Pax 3 semblent jouer des rôles essentiels lors de ces évènements. Mitf est un facteur de transcription intervenant dans le développement des mélanocytes. Il régule les gènes de la différenciation des cellules souches ainsi que ceux de leur progression dans le cycle cellulaire. Son expression est activée par les facteurs de transcription Sox 10 et/ou de Pax 3. Sox 10 a un rôle important dans le développement du lignage mélanocytaire. Une mutation du gène Sox 10 a pour conséquence, soit une absence complète de la protéine Sox 10 et donc un défaut de crêtes neurales, soit un syndrome de Waardenburg de type 4. Pax 3 est un facteur de transcription uniquement présent dans les cellules non différentiées en mélanocyte. C’est un compétiteur de Mitf pour l’activation du gène Dct mais peut également activer la transcription du facteur de transcription Mitf. Si le gène Pax 3 est muté, il y a apparition du syndrome de Waardenburg de type 1 dont le phénotype correspond à des anomalies de pigmentation de l'iris (hétérochromie), des cheveux et de la peau, à une dysmorphie faciale modérée et à une surdité. Pax 3 joue un rôle central dans la différenciation des cellules souches. En effet, il initie la cascade mélanogénique tout en inhibant la différenciation terminale des cellules souches en mélanocytes adultes, en aval. Etant donné le rôle de Pax 3 dans la différenciation des cellules souches en mélanocytes ainsi que sa présence dans les cellules pro génitrices des cellules musculaires, nous allons nous intéresser au mécanisme moléculaire permettant de conserver des cellules à l’état de progéniteur de cellules musculaires. En effet, dans les cellules de muscles striés, la protéine Pax 3 ainsi que les protéines régulatrices de la transcription Six 1 et Six 4 ont un effet sur Myf 5 et Myo D, deux gènes impliqués dans la détermination des cellules musculaires. Par conséquent, en comparaison au mécanisme moléculaire de régulation de Pax 3 dans le développement du lignage mélanocytaires, ce rapport décrit l’étude de l’implication de la β caténine dans la voie de différentiation des cellules musculaires. Par conséquent, ce projet de recherche pourrait s’inscrire dans le cadre d’études de maladies musculaires telles que la myopathie de Duchenne. 2
Sommaire Page 1. Introduction…………………………………………………….. 4 a) Mélanocytes…………………………………………………………..………... 4 b) Développement des cellules du lignage mélanocytaire….................................. 4 c) Mitf…………………………………………………………………………….. 6 d) Sox 10………………………………………………………………………… ..7 e) Pax 3…………………………………………………………………………… 8 f) Les cellules souches et Pax 3…………………………………………………... 9 2. Résultats………………………………………………………... 9 a) Localisation de l’expression de Pax 3…………………………………………. 9 b) Effet inhibiteur de Pax 3……………………………………………………….. 11 i - Etude de la séquence promotrice de Dct……………………………………… 11 ii - Séquence de la boîte 2 du promoteur Dct……………………………………. 12 iii - Identification de la séquence de fixation de Pax 3 sur le promoteur Dct…… 12 iiii - Effet de la mutation de la séquence de fixation de la protéine Lef sur le promoteur Dct…………………………………………………………………. 13 c) Inhibition de l’activité de Pax 3 par la β caténine……………………………... 15 i -Activité de la β caténine……………………………………………………….. 15 ii - Mécanisme d’action de la β caténine………………………………………… 16 d) Bilan du mode d’action et de la régulation de Pax 3 dans le bloquage de la différentiation des cellules souches en mélanocytes………………................. 17 3. Projet de recherche……………………………………….. ……19 a) Choix du modèle cellulaire…………………………………………………….. 20 b) Localisation de la β caténine…………………………………………………... 20 c) Effet de la β caténine sur l’expression des gènes Myf 5 et Myo D……………. 21 d) Détermination de l’interaction de la β caténine avec les promoteurs Myf 5 et Myo D………………………………………………………………………….. 22 e) Détermination des partenaires de la β caténine par Co immunoprécipitation…. 23 4. Conclusion et Perspectives………………………………...…… 24 Bibliographie……………………………………………………… 25 3
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