Etude de Pax 3 dans la différenciation des cellules souches - M2 ...

Ces contrôles permettront de vérifier l’effet d’activation sur les gènes Myf 5 et
Myo D. Pour chaque type cellulaire et pour chaque gène, un plasmide exprimant de façon
constitutive la β caténine sera cotransfecté (Figure 14). Il faudra également créer des
contrôles afin d’évaluer l’efficacité de transfection pour normaliser les résultats obtenus.
Le taux d’activation des promoteurs Myf 5 et Myo D est mesuré via la
bioluminescence de la luciférine. Celle-ci est oxydée en oxyluciférine, en présence d’ATP,
par la luciférase qui est une protéine monomérique de 61 kDa, comme décrit dans la
figure 15.
d) Détermination de l’interaction de la β caténine avec les promoteurs Myf 5 et
Myo D
L’expérience de choix pour déterminer si la β caténine interagit avec les séquences
d’ADN des promoteurs Myf 5 et Myo D est : l’Immuno Précipitation de Chromatine (ChIP).
Ainsi, à partir de cellules modèles C2C12, cette technique sera mise en place afin de
précipiter les complexes, contenant à priori la β caténine, se fixant sur les promoteurs
d’intérêt. Après avoir cross linké les protéines à l’ADN par le formaldéhyde, les noyaux des
cellules seront récupérés puis une sonication permettra de couper la chromatine toutes les
500 pb environ. L’immunoprécipitation sera réalisée à l’aide d’un anticorps anti β caténine
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