Etude de Pax 3 dans la différenciation des cellules souches - M2 ...

D’une part, la présence de β caténine dans le modèle cellulaire choisi sera vérifiée
via une immunohistochimie. Ensuite, l’effet de la protéine β caténine sur les promoteurs des
gènes Myf 5 et Myo D sera étudié grâce à des constructions reportrices. Puis, des expériences
de ChIP seront réalisées afin de déterminer quelles sont les protéines présentes, avec la β
caténine, sur les promoteurs Myf 5 et Myo D. Finalement, une co immunoprécipitation sera
effectuée dans le but d’identifier toutes les protéines responsables de la régulation des
promoteurs d’intérêt, telles que les protéines de la famille Groucho.
a) Choix du modèle cellulaire
Les cellules murines C2C12 ont été retenues pour cette étude. Il s’agit d’un modèle
cellulaire pour l’étude de la différentiation des cellules non musculaires en cellules
musculaires squelettiques, d’après les travaux de Wu Y ( 14 ). Ces cellules sont cultivées dans
du milieu Dubelcco’s modified Eagle’s medium (DMEM) contenant 10% de sérum bovin
fétal (FBS). Leur différentiation en cellules musculaires est induite en remplaçant le FBS par
2 % de sérum de cheval. Il faut noter que lors de cette étude, les cellules seront induites afin
de pouvoir observer les mécanismes moléculaires impliqués dans la différentiation.
b) Localisation de la β caténine
Dans un premier temps, la présence de β caténine dans les cellules musculaires
progénitrices en différentiation sera vérifiée. Pour cela, une méthode immuno histochimique
sera mise en place. Pour réaliser cette expérience, des anticorps polyclonaux de lapin anti β
caténine (Genscript) et anti Pax 3 (Merck Calbiochem) seront utilisés. L’anticorps primaire
anti Pax 3 sera reconnu par un anticorps secondaire couplé à un fluorophore de couleur verte :
la Cyanine 3 dont la longueur d’onde d’excitation (λ ex) est de 548 nm et dont la longueur
d’onde d’émission (λ em) est de 562 nm. D’autre part, un anticorps secondaire couplé à un
fluorophore rouge (Cyanine 7, λ ex= 710 nm, λ em= 805 nm) sera dirigé vers l’anticorps
primaire anti β caténine. Ces deux systèmes permettent la localisation des protéines d’intérêt
dans les cellules C2C12.
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