1. Digestion de l'ADN par les enzymes de - Département de biologie

Département de biologie Page 2 sur 6
Étapes 1 et 2 : les digestions par les enzymes de restriction
Sur votre paillasse (= plan de travail), vous allez trouver dans un portoir les tubes
suivants qui contiennent:
· De l’ADN du bactériophage lambda (1µg/µl) [1 µg= 1 millième de gramme]
· De l’ADN du plasmide pBluescript (1µg/µl)
· De l’eau stérile
· Du tampon de digestion (10X [10 fois concentré] ; donc il devra être dilué 10 fois)
· De l’enzyme de restriction EcoRI (5unités/µl)
· De l’enzyme de restriction HindIII (5unités/µl)
Digestion de l’ADN lambda
• Préparer un tube Eppendorf (de contenance 1,5ml) en mettant dans l'ordre
indiqué :
1µl ADN lambda (tube 1 du portoir des réactifs)
2µl tampon
15µl d'eau
1µl Eco R1
1µl Hind III
Soit un volume final de 20 µl
Les enzymes sont dans un tampon avec du glycérol ; donc quand vous les
ajoutez aux réactifs déjà présents dans le tube, le glycérol, plus dense, tombe
au fond sans se mélanger. Il faut homogénéiser avec précaution les réactifs
avec le pipetman ou par tapotage.
• Mettez le tube à 37°C (dans le bain-marie) pendant 30 minutes
Digestion du plasmide
La digestion du plasmide se fait de la même manière.
• Préparer un second tube Eppendorf (de contenance 1,5ml) en mettant dans
l'ordre indiqué :
1µl du tube contenant le plasmide pBluescript (tube 2 du portoir des
réactifs)
2µl tampon
15µl d'eau
1µl Eco R1
1µl Hind III
Soit un volume final de 20 µl
Les enzymes sont dans un tampon avec du glycérol ; donc quand vous les
ajoutez aux réactifs déjà présents dans le tube, le glycérol, plus dense,
tombe au fond sans se mélanger. Il faut homogénéiser avec précaution les
réactifs avec le pipetman ou par tapotage.
• Mettez le tube à 37°C (dans le bain-marie préchauffé à cette température)
pendant 30 minutes