1. Digestion de l'ADN par les enzymes de - Département de biologie

Département de biologie Page 4 sur 6
Ne jetez surtout pas les tubes dans lesquels vous avez fait les digestions !!! Laissez-
les dans la boîte à glace. Vous allez en avoir encore besoin !!
Tableau récapitulatif :
Ordre dans
lequel on ajoute
les réactifs
1
2
3
• Laissez les 3 tubes dans le portoir sur la paillasse : 60 minutes à température
ambiante
Étape 5 : analyse par électrophorèse des fragments à l’issue de la digestion des
étapes 1 et 2
Normalement après avoir effectué la digestion de l’ADN, il faut vérifier que les
enzymes ont bien fonctionné, avant de procéder aux étapes suivantes. Nous sommes
obligés ici de faire les ligations avant de savoir si les digestions sont bonnes (=
complètes), car le temps imparti à ce TP d’initiation à la biologie moléculaire est court.
Vous allez faire migrer sur un gel d’agarose 1% (=1g d’agarose pour 100ml de
tampon) les fragments d’ADN que vous avez produits pendant les digestions. Vous allez
faire migrer en parallèle des marqueurs de taille, ce qui va vous permettre de déterminer
la taille des fragments obtenus à l’issue de la digestion, et vous assurer de la conformité
des résultats de la digestion par rapport à vos attentes lorsque vous avez établi le
protocole.
Préparation des échantillons pour le gel :
• Dans des tubes Eppendorf (contenance 1,5ml) mettre dans l’ordre indiqué :
Tube A 4 µl de la digestion de lambda
2 µl de tampon « bleu de charge »
4 µl d’eau stérile
Tube B 2µl de la digestion du plasmide
2 µl de tampon « bleu de charge »
6 µl d’eau
Tube C 2 µl des marqueurs de taille
2 µl de tampon « bleu de charge »
6 µl d’eau
Donc, volume final : 10 µl
• Charger les gels.
Tube 1 Tube 2 Tube 3
2 µl de plasmide
digéré
2 µl de tampon de
ligation 5X
2 µl l’ADN lambda
digéré
2 µl de plasmide
digéré
2 µl de tampon de
ligation 5X
4 µl l’ADN lambda
digéré
2 µl de plasmide
digéré
2 µl de tampon de
ligation 5X
4 3 µl d’eau 1 µl d’eau 5 µl d’eau
5 1 µl de ligase 1 µl de ligase 1 µl de ligase