1. Digestion de l'ADN par les enzymes de - Département de biologie

Département de biologie Page 3 sur 6
Commentaire : 1 unité d’enzyme peut digérer 1µg d’ADN en une heure. Vous allez
utiliser 5 unités d’enzyme (contenues dans un microlitre d’enzyme) pendant 30 minutes
ce qui est plus que suffisant pour digérer 1µg de plasmide. On utilise habituellement plus
d’enzyme que nécessaire (= on dit que l’on travaille en excès d’enzyme).
Étape 3 : l’inactivation des enzymes de restriction à la fin des digestions
À la fin de la digestion, il faut chauffer les deux tubes à 70°C (en les transférant
dans un bain-marie chauffé à cette température) pendant 10 minutes, pour inactiver les
enzymes. Les enzymes sont des protéines et à 70°C leurs structures secondaires et
tertiaires sont fortement modifiées, et de ce fait, elles ne sont plus actives.
Étape 4 : la ligation
Il faut d’abord centrifuger brièvement les deux tubes car pendant l’inactivation il
se produit un peu d’évaporation : des gouttelettes se sont formées sur la paroi et le
capuchon des tubes. Donc, vous centrifugez les deux tubes pendant 10 secondes dans la
microfuge (une petite centrifugeuse de paillasse). Les gouttelettes retombent au fond du
tube.
ATTENTION à la manière de disposer les tubes dans la centrifugeuse !!! Ils
doivent être dans des supports diamétralement opposés !
Mettre ensuite les tubes dans de la glace pilée, dans une boîte de polystyrène, pendant
que vous préparez les tubes de l’étape suivante.
Vous allez faire maintenant 3 ligations, chacune dans un tube Eppendorf différent :
1. une fraction du plasmide digéré plus 2µl de l’ADN lambda digéré
2. une fraction du plasmide digéré plus 4µl de l’ADN lambda digéré
3. une fraction du plasmide digéré seul (= sans ajouter de l’ADN de lambda)
Les ligations se font dans un volume final de 10µl.
Vous avez dans le portoir les tubes contenant :
− du tampon de ligation (5X [concentré 5 fois] ; donc il devra être dilué 5 fois)
− de l’enzyme ligase (concentration de l’enzyme dans le tube : 1unité/µl)
• Ligation des molécules : Dans chacun des 3 tubes Eppendorf
(contenance :1,5ml), vous ajoutez dans l'ordre indiqué:
− 2 µl de plasmide digéré
− 2 µl de tampon de ligation 5X
Ligation 1 : on ajoute 2 µl l’ADN lambda digéré plus 3 µl d’eau
Ligation 2 : on ajoute 4 µl l’ADN lambda digéré plus 1 µl d’eau
Ligation 3 : on ajoute 5 µl d’eau
Et enfin1 µl de ligase