1. Digestion de l'ADN par les enzymes de - Département de biologie

Département de biologie Page 6 sur 6
Étape 7 : étalement des bactéries transformées sur des boîtes de Pétri
contenant du milieu de culture
• Centrifugez les trois tubes de transformations pendant 1 minute dans le microfuge
à vitesse maximale (centrifugeuse de paillasse). N’oubliez pas d’équilibrer !!!!
• Vous allez obtenir un culot de bactérie. Vous aspirez délicatement le surnagent à
l’aide de la pipette, vous jetez le surnageant, et vous ajoutez 75 µl de L-broth
pour re-suspendre les bactéries (= faire que les bactéries ne soient plus tassées
dans le culot, mais réparties de manière homogène dans le milieu de culture), à
l’aide la pipette, sans faire de bulles : il faut manipuler avec précautions !
• Vous allez maintenant étaler stérilement les bactéries sur les boîtes de Pétri, avec
des billes de verres (qui ont été stérilisées auparavant). Chaque tube de
transformation sera étalé sur une boîte de Pétri. Nous allons vous montrer
comment faire l’étalement avec des billes de verre.
• IMPORTANT :
o N'oubliez pas de marquer vos boites avec vos noms et le n° de la
ligation.
o A votre avis, vous identifiez vos trois boîtes de Pétri en écrivant sur le
fond de la boîte ou sur le couvercle ?
ETAPE ULTIME : vous RANGEZ votre plan de travail avant de partir !!!!!!
• Les boîtes de Pétri sont mises à 37°C toute la nuit dans un incubateur réglé à
cette température. La présence d’un antibiotique (ici l'ampicilline) dans l’agar va
empêcher les bactéries sans plasmide (= non transformées) de pousser. Le
lendemain, on devrait avoir des colonies sur les boîtes : une colonie est un clone
de bactéries (= toutes les bactéries d’un clone descendent d’une seule cellule
bactérienne initiale) qui contiennent toutes le même plasmide. Ces colonies sont
visibles à l’œil nu. Les colonies bleues sont non-recombinantes, les blanches sont
recombinantes. Les enseignants se chargeront de sortir vos boîtes, de les mettre
dans une chambre froide à 4°C pour stopper la croissance bactérienne tout en
préservant leur viabilité.
Mercredi, de 14 à 16h, nous observerons les boîtes, puis nous commenterons et
interpréterons ensemble vos résultats.
BONNES MANIPULATIONS!!!!!