M - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

Université du Sud Toulon-Var
Master 1 : Sciences et Techniques Mention Chimie et Matériaux
Spécialité Chimie Analytique Réactionnelle et Modélisation en
Environnement
Étude comparative de la nature de
métabolites secondaires de bactéries
marines pionnières du biofilm
Responsable de Stage : Annick Ortalo-Magné
Laboratoire MAPIEM
Matériaux – Polymères – Interfaces – Environnement Marin
DUDEFOI William Année universitaire 2011-12
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Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier M. André MARGAILLAN, Directeur du laboratoire MAPIEM
ainsi que M. Yves BLACHE qui m’ont permis de réaliser mon stage au sein de ce laboratoire.
Je remercie également ma responsable de stage Mme Annick ORTALO-MAGNE pour m’avoir
fait confiance et m’avoir guidé tout au long de ces 2 derniers mois.
Je remercie tout le personnel du laboratoire, tous les professeurs et tous ceux qui m’ont aidé
durant ce stage, notamment M. Gérald CULIOLI pour toute son aide concernant la LC-MS et
la RMN.
Je tiens aussi à remercier tous les doctorants et doctorantes du laboratoire, notamment
Ahlem OTHMANI, Mireille AYE, Cynthia OUEINY, Perrine VAN OVERTVELT, Denis LINARES et
plus particulièrement ma chef Florence BRIAN-JAISSON avec qui j’ai partagé de nombreux
moments, et qui ont toujours répondu présents pour moi. Je remercie enfin les autres
stagiaires : Félix, Vincent, et Elodie pour leur bonne humeur quotidienne.
Je tiens enfin à remercier Mme Véronique LENOBLE, pour tous les conseils et
encouragements qu’elle m’a donnés lors de cette année de Master 1, ainsi que tous les
autres professeurs du Master Chimie et Matériaux.
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Sommaire
I- Introduction .................................................................................................................................................... 4
I-1 Introduction bibliographique ..................................................................................................................... 4
I-1.1 Biofouling en milieu marin ................................................................................................................. 4
a) Conséquences économiques .............................................................................................................. 4
b) Conséquences écologiques ................................................................................................................ 5
c) Lutte contre le biofouling .................................................................................................................. 6
d) Les alternatives .................................................................................................................................. 7
e) Composés antifouling naturels d’origine marine ............................................................................... 8
I-1.2 Biofilms et biofouling ......................................................................................................................... 9
a) Chronologie ....................................................................................................................................... 9
b) Avantages de la vie en biofilm ........................................................................................................ 10
c) La matrice des biofilms bactériens .................................................................................................. 10
I-2 Introduction du sujet du stage ................................................................................................................ 15
II- Matériels et méthodes : ................................................................................................................................. 16
II-1 Souches bactériennes .......................................................................................................................... 16
II-2 Conservation des souches ................................................................................................................... 16
II-3 Milieux de culture ............................................................................................................................... 16
II-4 Préculture / Culture en biofilm............................................................................................................ 17
a) Préculture ........................................................................................................................................ 17
b) Culture en erlenmeyer ..................................................................................................................... 17
c) Culture en biofilm ........................................................................................................................... 17
II-5 Extraction des substances extrapolymériques. .................................................................................... 17
II-6 Protocole de partage ............................................................................................................................ 18
II-7 Résonance magnétique nucléaire (RMN) ........................................................................................... 18
II-8 Infra-rouge à transformée de Fourier (IR-TF) .................................................................................... 18
II-9 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP) ..................................................................... 19
III- Résultats & Discussion .............................................................................................................................. 20
III-1 Résultats antérieurs.............................................................................................................................. 20
III-2 Démarche expérimentale pour l’extraction des EPS : Cultures sur 100 boîtes de Pétri. ...................... 22
III-3 Etude comparative de métabolites des souches cultivées en biofilm : cultures sur 10 boîtes de Pétri. 23
a) Partage ............................................................................................................................................. 24
b) Spectres RMN ................................................................................................................................. 25
c) Spectres IR-TF ................................................................................................................................ 27
d) CLHP .............................................................................................................................................. 28
IV- Conclusion et Perspectives ........................................................................................................................ 31
Références bibliographiques ................................................................................................................................. 32
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I- Introduction
I-1 Introduction bibliographique
I-1.1 Biofouling en milieu marin
Toute surface immergée dans le milieu marin subit inévitablement une colonisation par des
organismes marins : c’est le phénomène de biofouling (biosalissure) (Costerton 1994). Ce
processus est à l’origine de nombreux problèmes pour les activités humaines liées au milieu
marin, à la fois au niveau économique et au niveau écologique.
a) Conséquences économiques
Le phénomène de biofouling se retrouve évidemment sur les coques des bateaux, mais aussi
sur de nombreuses autres structures telles les pipelines, les installations liées à l'aquaculture,
les structures portuaires ou encore toutes sortes de matériels scientifiques immergés (Fig. 1a).
On retrouve aussi des biofilms sur les membranes des usines de dessalement ou sur les
systèmes de refroidissement dont ils diminuent, de fait, l'efficacité.
Le cas qui pose le plus de problème économique est celui des navires (Fig. 1b). En effet,
l’augmentation de la biomasse due au biofouling entraine une augmentation de la rugosité de
la surface, et donc des forces de friction du navire lors de son déplacement dans l'eau, ainsi
qu'une surcharge. Cela provoque une réduction de la vitesse et donc un accroissement de la
consommation en carburant.
Fig. 1a : Matériel scientifique recouvert de biofouling
Fig. 1b : Coque de navire recouverte de fouling (macroorganismes)
Fig. 1c : Bouée recouverte de moules
Parallèlement, le biofouling a des effets sur les matériaux eux-mêmes. En effet, il peut
engendrer une altération de leurs propriétés originelles : c’est le phénomène de biocorrosion,
cas de corrosion accélérée, (Haras, 2005), aussi appelé MIC pour Microbiologically
Influenced Corrosion (Fig. 2). Il englobe tous les phénomènes de corrosion dans lesquels les
bactéries jouent un rôle plus ou moins direct par l’intermédiaire de leur métabolisme. Ces
dernières sont en effet capables de favoriser l’avènement d’un processus déjà existant, ou
même de créer les conditions favorables à la corrosion. Les bactéries responsables peuvent
4

avoir des modes d’actions très différents, inhérents à leurs propriétés métaboliques, comme
par exemple la faculté de réduire l’oxygène, les sulfates, les thiosulfates et le fer III ou
d’oxyder les sulfures et ions ferreux, ou même d’être fermentaires ou de produire des acides.
Fig. 2 : Biocorrosion sur un poteau métallique
Des revêtements dits antifouling, c’est-à-dire de lutte contre l’adhésion de salissures,
appliqués sur des surfaces immergées, s'avèrent donc indispensables, mais leur
renouvellement et leur récupération, entraînent une augmentation drastique des coûts
d'entretien.
b) Conséquences écologiques
Suite à un macro-fouling (biofouling dû à l’attachement de macro-organismes), les coques de
bateaux peuvent être le vecteur d'une dissémination des organismes à grande échelle,
notamment d’espèces invasives pouvant perturber profondément certains écosystèmes dont
l’équilibre est fragile. Crepidula fornicata (Fig. 3a) et Ficopomatus enigmatus (Fig. 3b et 3c),
deux espèces d’invertébrés marins, en sont des exemples. (Brian Jaisson, 2011)
Fig. 3a : Crepidula fornicata
Fig. 3b et c : Ficopomatus enigmatus
D'autre part, des espèces développant une résistance aux métaux – et notamment au cuivre,
largement utilisé dans les revêtements antifouling depuis l'interdiction des oxydes de
tributylétain (TBTO) – peuvent alors être transportées et pourront être favorisées vis-à-vis des
espèces endémiques (Piola, et al., 2009).
5

c) Lutte contre le biofouling
A partir du moment où l’homme a utilisé un navire comme moyen de locomotion, il a eu
besoin de le protéger contre les salissures marines. Les premiers revêtements connus étaient
fait de cire, de goudron ou encore d’asphalte. Vers 700 J.C, les Phéniciens et les Carthaginois
semblent avoir été les premiers à utiliser du cuivre.
Jusqu’au milieu du XXème siècle, des revêtements à base de métaux (cuivre, arsenic ou
oxydes mercuriques) dispersés dans un polymère (résine, vernis) étaient utilisés, formant ce
que l’on appelle des polymères associés à des biocides.
Depuis la moitié du XXème siècle, d’autres types de peintures sont utilisés, ce sont des
peintures auto-polissantes composées de copolymères acryliques sur lesquels sont greffés les
agents biocides – typiquement le TBTO.
Bu
O
Sn
Bu
CH 3 CH3
O
Eau de mer
m n Sn(C4H9) 3
Bu
O
O
CH 3
Fig. 4 : Formule chimique d’un copolymère TBTO (Blache, 2008)
Le biocide est progressivement libéré par hydrolyse, puis le copolymère restant est dissout,
laissant apparaître une nouvelle couche de copolymère greffé. Ce type de peinture offre une
durée d’action d’environ 5 ans (Almeida et al., 2007).
Cette efficacité, associée à un coût faible, a permis à ces peintures auto-polissantes à base de
TBTO de se répandre largement au cours de ces dernières décennies jusqu’à représenter près
de 70% du marché des peintures antifouling.
Cependant, cette sur-utilisation du TBTO entraina une augmentation de sa concentration dans
le milieu marin et dans les zones portuaires au point qu’elle est devenue toxique pour toutes
sortes d’organismes marins.
Fig. 5 : Huître normale et huître anormale retrouvée dans un environnement contaminé par du TBTO.
C’est pourquoi en 2008, l’organisation maritime internationale (International Maritime
Organization (IMO)) décida d’interdire l’application de revêtements à base de TBTO. Aucun
navire possédant un revêtement de ce type n’est désormais autorisé à circuler. (IMO & marine
environmental protection comittee, Directives 76/769/EC - 99/51/EC)
6
+ Cl -
O
CH 3 CH3
O -
m
O
Na +
O
n
CH 3

La recherche d’une alternative à ces peintures devient alors un enjeu majeur. Il existe
plusieurs approches investies dans le but de trouver de nouvelles solutions plus respectueuses
de l’environnement. (Chambers et al., 2006)
d) Les alternatives
- Les peintures à base de métaux
Il existe des peintures dites auto-polissantes (ou self polishing) à base de zinc ou d’oxydes de
cuivre. Le problème est qu’elles sont nettement moins efficaces que celles formulées avec du
TBTO. On utilise alors des co-biocides organiques ce qui permet aux revêtements d’atteindre
des durées de vie d’environ trois ans, contre cinq ans pour les précédents revêtements à base
de TBTO. Néanmoins, les concentrations en métaux et en co-biocides doivent être
suffisamment importantes pour atteindre l’efficacité des peintures à base de TBTO, ce qui
finalement amène à se poser des questions concernant leur impact environnemental. Ce type
de revêtement ne peut donc constituer qu’une solution transitoire en attendant de trouver une
réelle alternative non-toxique.
- L'approche répulsive
Le principe est d’éviter que les organismes ne viennent se fixer sur la coque, ou au moins de
favoriser leur détachement lorsque le bateau navigue à une vitesse donnée. Il s’agit pour cela
de minimiser l’énergie de surface du revêtement. Pour cela, deux technologies existent
actuellement : les polymères à base de silicone et les polymères fluorés.
Ce type d’alternative, dépourvue de tout agent biocide, donc de toute toxicité présente en plus
un large spectre d’action. Cependant, elle présente un grand désavantage, celui d’être
inefficace en régime stationnaire : des organismes épiphytes peuvent alors coloniser la coque
du navire.
- L'approche biomimétique
Cette méthode consiste à s’inspirer des moyens de défense utilisés par les organismes marins
qui apparaissent peu colonisés, et de tenter de les reproduire.
Il existe deux principaux types de mécanismes de défense :
La défense chimique : production de métabolites secondaires ayant pour but de repousser
les organismes épiphytes, ou du moins de réguler leur colonisation. (Fig. 6)
Fig. 6 : Exemple d’organismes produisant des métabolites secondaires à propriété antifouling
6a : Etoile de Mer
6b : Plathelminthe
6c : Posidonie
7

La défense physique : présence d’épines, ou microtopographie de surface permettant de
lutter contre les espèces colonisatrices, par exemple le tégument externe de globicéphale (Fig.
7a) ou le tégument externe de requin (Fig. 7b).
Fig. 7a : Tégument externe de globicéphale
Fig. 7b : Tégument externe de requin
Les limites de cette approche biomimétique résident dans l’application. En effet, trouver une
molécule naturelle présentant à la fois une activité antifouling à large spectre, une faible
toxicité vis-à-vis des organismes non-ciblés et une structure chimique simple en vue de sa
production à grande échelle paraît presque utopique.
De même, la diversité des nombreux organismes à repousser, ayant des tailles et des modes de
colonisation différents, en utilisant une même microarchitecture de surface donnée semble
difficile.
Le revêtement antifouling idéal, à la fois efficace, peu coûteux, à longue durée de vie et non
toxique combinera surement une facette de chacune des approches citées précédemment.
e) Composés antifouling naturels d’origine marine
Comme vu brièvement dans le paragraphe précédent, les organismes marins peuvent
représenter un important réservoir de molécules actives potentiellement intéressantes dans la
recherche d’un produit antifouling : c’est l’approche biomimétique.
En effet, ces composés peuvent être métabolisés par un organisme dans le but de se défendre
contre d’autres organismes compétiteurs. De ce fait, les propriétés antifouling de nombreux
composés, fractions ou extraits issus d’organismes marins ont été étudiées, notamment à partir
d'algues (brunes, vertes et rouges) ou de bryozoaires mais également issus de bactéries
pionnières, c’est-à-dire participant aux premières étapes de colonisation d’un support
immergé.
Les composés ayant à ce jour été répertoriés pour leur activité antifouling témoignent d’une
grande diversité chimique : ce sont des terpènes, des composés aromatiques, des dérivés
lipidiques, des composés halogénés, des oses ou encore des alcaloïdes ( Exemple Fig. 8a, 8b
et 8c).
8

Fig. 8a : Le SEA-NINE® extrait depuis Haliclona rubens
Fig. 8b : Molécule extraite depuis Zoobotrion verticillatum (Omae, 2003)
Fig. 8c : Acide zostérique extrait depuis Zostera marina (Blache, 2008)
I-1.2 Biofilms et biofouling
a) Chronologie
Fig. 9 : Etapes de formation du biofouling (Haras, 2005)
Le biofouling correspond à la colonisation de surfaces immergées inertes ou vivantes par des
organismes vivants. Ce phénomène débute par la mise en place d’un film conditionnant sur la
surface immergée. Les bactéries pionnières vont ensuite se fixer dans un premier temps de
manière réversible sur ce film conditionnant puis dans un deuxième temps de manière
irréversible. L’étape suivante correspond à la formation d’un biofilm bactérien correspondant
à une croissance bactérienne avec production d’une matrice extracellulaire adhésive et
protectrice (Sutherland et al., 2001). Enfin d’autres micro-organismes (micro-algues par
exemple) puis des macro-organismes (balanes, moules…) vont se fixer sur le biofilm
bactérien.
Plusieurs types de biofouling peuvent donc être distingués en fonction du stade d’avancement
du processus :
- le micro-fouling, ou fouling primaire, au sein duquel les organismes impliqués dans la
colonisation sont des micro-organismes tels que des bactéries, des champignons, des
diatomées, des micro-algues ou des larves d'invertébrés.
- le macro-fouling, ou fouling secondaire, correspondant à la colonisation par des macroorganismes
(types macro-algues, invertébrés, etc) (Fig. 9).
9

) Avantages de la vie en biofilm
L’association organisée de bactéries au sein d’une matrice d’exopolymères, EPS pour
Extracellular Polymeric Substances leur confère de nombreux avantages (Haras, 2005):
- Création de leur propre micro-niche, ce qui leur offre une protection contre des conditions
environnementales potentiellement défavorables,
- Protection contre la dessiccation,
- Plus grand accès aux nutriments circulant entre les bactéries,
- Concentration des nutriments,
- Communications et échanges (chaîne nutritionnelle) inter-espèces,
- Transferts d’éléments génétiques mobiles,
- Résistance aux bactériophages,
- Résistance aux agents antibactériens : biocides et antibiotiques en établissant une barrière de
diffusion et en concentrant dans la matrice les enzymes sécrétées (types lactamases,
protéases…).
c) La matrice des biofilms bactériens
- Les substances polymériques extracellulaires
La matrice des biofilms bactériens est constituée d’EPS pouvant occuper jusqu’à 75-95% du
volume du biofilm mature et lui donnant une architecture particulière. (Fig. 10) Ces EPS
peuvent être issus de la dégradation des bactéries mais sont synthétisées et sécrétées par les
bactéries au sein du biofilm. Leur production est donc sous contrôle génétique. Leurs
propriétés physico-chimiques sont donc très variées, en fonction du genre de la bactérie, l’âge
du biofilm, de la température et de la disponibilité en nutriments ainsi que des facteurs
environnementaux. Il n’y a pas si longtemps, EPS signifiait « exopolysaccharides », or il est
devenu clair que la matrice était également composée de protéines, d’acide nucléiques, de
lipides et d’autres biopolymères comme des substances humiques. La figure 10 montre
différents types d’EPS que l’on peut rencontrer au niveau d’un biofilm mature.
10

Fig. 10. Schéma de la matrice de substances polymèriques extracellulaires à différentes échelles (Flemming and
Wingender, 2010)
10a | Modèle d’un biofilm bactérien fixé à une surface
10b | Les composants de la matrice – polysaccharides, protéines et acides nucléiques représentés ici –
sont distribués autour des cellules dans une disposition non homogène, conférant des différences de
composition à l’intérieur même de la matrice.
Les lipides ne sont pas représentés sur ce schéma de Flemming et Wingender, mais sont bien
présents comme le montre la figure 11 tirée d’un article d’Andersson (Andersson et al., 2011).
Fig. 11 : Composition en EPS de biofilms mono et pluri-espèces cultivés pendant 20 jours (Andersson et al.,
2011).
- Fonction des EPS
La formation et le maintien de la structure multicellulaire microbienne dépend
essentiellement de la production et de la quantité d’EPS (Sutherland, 2001). Outre leur rôle
très important dans l’architecture du biofilm, les exopolymères possèdent d’autres fonctions
11

différentes mais non moins importantes décrites, pour certaines, dans le tableau 1 établi
d’après (Flemming and Wingender, 2010).
Fonction Intérêt pour le Biofilm Nature des EPS mis en jeu
Adhésion Permettent d’initialiser la première
étape de colonisation de la surface
et l’attachement à long terme du
biofilm
Agrégats de cellules bactériennes Permettent la liaison intercellulaire,
immobilisation temporaire de la
population bactérienne et la
reconnaissance cellule-cellule
Cohésion du biofilm Forment un réseau de polymères
hydratés, mécanisme médiateur de
la stabilité du biofilm, détermine la
structure du biofilm et assure une
bonne communication cellulecellules
Rétention d’eau Maintiennent des microenvironnements
hautement
hydratés autour des organismes,
empêche la dessiccation
Barrière protectrice Confèrent une résistance aux
défenses non-spécifique et
spécifique de l’hôte lors de
l’infection, et une tolérance aux
agents antimicrobiens
Sorption de molécules
Assurent une accumulation en
organiques
nutriments venant du milieu
Sorption d’ions inorganiques Contribuent à la détoxification de
l’environnement
Activité enzymatique Permettent la digestion de
macromolécules exogènes pour
l’acquisition de nutriments et
dégradent la structure des EPS,
assurent la libération des cellules
du biofilm
Source en nutriment Fournissent une source de carbone,
nitrogène et de phosphate utilisée
par le biofilm
Echange d’information
Facilitent le transfert horizontal de
génétique
gène entre les cellules du biofilm
Donneur et accepteur d’électron Permettent une activité redox dans
la matrice du biofilm
Export de composés cellulaires Libération de matérielles
cellulaires suite à un changement
de métabolite
Réservoir d’énergie Conservation de l’excès de carbone
lors d’un ratio inégale carbone
nitrogène
12
Polysaccharides, protéines, ADN et
molécules amphiphiliques
Polysaccharides, protéines et ADN
Polysaccharides neutres et chargés,
protéines et ADN
Polysaccharides hydrophiles et
possible présence de protéines
Polysaccharides et protéines
Polysaccharides chargés et
hydrophobes et protéines
Polysaccharides chargés et
protéines, incluant substituant
inorganiques comme le phosphate
et le sulfate
Protéines
Potentiellement tous les types
d’EPS
ADN
Protéines comme celles qui
forment les pili et substances
humiques
Vésicules membranaires avec
acides nucléiques, enzymes,
lipopolysaccharides et
phospholipides
Polysaccharides
Tableau 1 : Fonctions d’EPS dans un biofilm bactérien d’après (Flemming and Wingender, 2010)

- Isolement des exopolysaccharides
La nature des EPS dépend de la méthode utilisée pour les isoler, donc la méthode
d’extraction devra être adaptée au type d’EPS recherchés. De nos jours, il n’existe pas de
technique d’isolement universelle. Dans la littérature, de nombreuses techniques physiques,
chimiques ou une combinaison des deux sont décrites (exemple tableau 2) (Caudan et al.,
2012).
Elles sont réalisées à partir de centrifugation, filtration, traitement à la chaleur, sonication,
traitement avec des agents complexes, des résines échangeuses d’ions ou par utilisation
d’hydroxyde de sodium.
Tableau 2 : Comparaison de plusieurs méthodes d’extraction des protéines et polysaccharides de biofilms
bactériens (Caudan et al., 2012). PN=Protéines PS=Polysaccharides
Une des méthodes recommandée est l’utilisation de résines échangeuses de cations (Frolund
et al., 1996), qui permet de retirer les cations interagissant avec les groupements chargés
négativement (acides uroniques des polysaccharides, chaînes latérales d’acides aminés des
protéines) ceci, en préservant l’intégrité des cellules.
Fig. 12 : Les classes de faibles interactions physico-chimiques et les enchevêtrements des biopolymères qui
dominent la stabilité de la matrice d’EPS (Flemming and Wingender, 2010).
Afin d’obtenir un maximum d’exopolymères que ce soit en quantité ou bien en qualité, qu’ils
soient insolubles ou solubles, il est nécessaire de combiner les techniques chimiques et
13

physiques comme le montre la figure 13, où l’extraction a été réalisée sur des extraits de vase
marine (Domínguez et al., 2010).
Fig. 13 : Exemple de méthodes d’extraction d’EPS (Domínguez et al., 2010)
14

I-2 Introduction du sujet du stage
Le phénomène de biofouling concerne toute surface immergée dans le milieu marin, celle-ci
subissant inévitablement une colonisation par des organismes marins.
Le biofouling débute avec la formation d’un biofilm c’est-à-dire d’une communauté de
microorganismes fixée à une surface et maintenue par la sécrétion d’une matrice adhésive et
protectrice (Sutherland et al., 2001). Cette matrice est constituée d’EPS (Extracellular
Polymeric Substances) pouvant occuper jusqu’à 95% du volume du biofilm mature. Sa
composition est très variée (polysaccharides, protéines), acides nucléiques pour les plus
étudiés, et des composés lipidiques (Andersson et al., 2011), moins étudiés) ce qui confère
une architecture particulière au biofilm.
Parmi les exopolymères de la matrice, se trouvent des métabolites secondaires ayant
potentiellement une activité antifouling. Certains de ces métabolites ont été étudiés dans
plusieurs travaux récents (Sayem et al., 2011) pour leurs structures et activités éventuelles.
Ce stage s’inscrit dans le cadre de la thèse de Florence BRIAN-JAISSON, ayant pour intitulé
« Identification et caractérisation des exopolymères de biofilms de bactéries marines:
recherche d’agents antifouling ou réducteurs de trainée hydrodynamique ».
Dans le cadre de ces recherches, des travaux préliminaires ont été réalisés au laboratoire
MAPIEM, et ont porté sur la caractérisation de plusieurs souches de bactéries marines
pionnières du biofilm. A la suite de cela, l'étude de la matrice extrapolymérique des biofilms
formés par ces bactéries en cultures monospécifiques à été entreprise.
Le sujet de ce stage correspond d’une part à la mise au point d’un protocole permettant de
caractériser les composés de la matrice ainsi que ceux relargués dans le milieu, d’autre part à
l’étude des métabolites secondaires, en particulier les lipides produits par les souches
bactériennes sélectionnées. Ces souches sont cultivées dans des conditions favorisant la
formation de biofilm et ainsi la production de matrice extrapolymérique. La mise au point
d’un protocole pour l’extraction des EPS appliqué sur des cultures bactériennes en biofilm a
pour objectif l’obtention d’une grande quantité de matériel.
Dans un premier temps, il s’agira donc d’isoler deux souches bactériennes cultivées à raison
de 100 boîtes de Pétri par souche et de les traiter en vue d’isoler les exopolymères de la
matrice produite, ceci par des procédés de séparation et de partage spécifiques appliqués
respectivement aux bactéries issues des cultures sessiles, c'est-à-dire adhérées, puis à l’extrait
d’EPS obtenu. Le but du protocole mis au point est d’isoler suffisamment de composés de la
matrice (donc extracellulaires associés aux cellules cultivées en biofilm) afin de les
caractériser et de les comparer aux composés relargués dans le milieu. Cette étude pourrait
permettre d’établir des relations entre, la composition générale du biofilm et la fonction de ces
composés produits en biofilm dans le recrutement ou au contraire dans la répulsion d’autres
espèces bactériennes. (Wilson et al., 2011).
Parallèlement, un travail sur des plus petites quantités (10 boîtes) pour 8 souches bactériennes
à été réalisé. Il s’agissait d’avoir une vue d’ensemble des métabolites produits par ces 8
souches (notamment des lipides produits), afin de pouvoir commencer à confronter les
résultats. Pour cela, les étapes de culture, d’extraction ainsi que de partage et d’analyse ont été
faites sur toutes les souches bactériennes.
15

II- Matériels et méthodes :
II-1 Souches bactériennes
Dans le cadre de ce stage, 8 souches bactériennes ont été utilisées :
TC8 / TC9 / TC5 / FRA1 / FRA2 / FRA4 / FRN1 / TC10 (voir tableau 3 page 19)
TC pour Toulon Collection.
FRA pour Full Release Ancient.
FRN pour Full Release New.
II-2 Conservation des souches
La conservation de toutes les bactéries marines a été réalisée par cryogénisation. Pour cela
500 μl de suspension bactérienne en phase exponentielle de croissance en milieu VNSS
auxquels sont additionnés 500 μl de glycérol sont introduits dans des cryotubes et conservés à
-80°C.
II-3 Milieux de culture
Marine broth (MB) et marine broth agar (MA) :
Le MB (BD® : Becton, Dickson and company, Grenoble, France) (AnnexeI- I.2) est un
milieu liquide couramment utilisé pour la croissance des bactéries marines. Après sa
préparation, il est autoclavé et filtré sur du 0,2 μm. Le MA (BD® : Becton, Dickson and
company, Grenoble, France) se différencie du MB par sa concentration en MgCl2 et par
l’ajout d’agar à 1,5% (p/v). Il est coulé en surfusion dans des boîtes de Pétri. Ces milieux
permettent ici de faciliter la décongélation et la remise en culture.
Vaatanen Nine Salt Solution (VNSS) et VNSS agar :
Les cultures planctoniques des souches marines ont été caractérisées dans le milieu VNSS.
Pour 1 L de solution ce milieu comprend 1 g/L de peptone, 0,5 g/L de yeast extract, 0,5 g/L de
glucose, 0,5 g/L d’amidon soluble, 0,01 g/L de FeSO4.7H2O, et 0,01 g/L de Na2HPO4.
Ces composants sont dissous dans du NSS (Nine Salt Solution), constitué de 17,6 g/L de
NaCl, 1,47 g/L de NaSSO4, 0,08 g/L de NaHCO3, 0,25 g/L de KCl, 0,04 g/L de KBr, 1,87
g/L de MgCl2,6H2O, 0,41 g/L de CaCl2.2H2O, 0,01 g/L de SrCl2.6H2O, et de 0,01 g/L de
H3BO3. L’ensemble du milieu est homogénéisé puis autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.
16

II-4 Préculture / Culture en biofilm
a) Préculture
Avec une oese stérile, des bactéries prélevées du cryotube sont étalées à la surface d’une
boîte de Pétri contenant du milieu gélosé Marine Agar (MA). Les boîtes sont ensuite incubées
à 20°C pendant 72 h afin de permettre la croissance bactérienne. Cinq mL de milieu de
culture MB liquide sont alors inoculés avec une colonie prélevée sur la boîte de Pétri. Cette
étape permet de synchroniser la croissance des bactéries en culture liquide.
b) Culture en erlenmeyer
Les bactéries doivent être en phase post-exponentielle ou stationnaire de croissance pour être
en mesure de produire un biofilm de manière optimale. Ceci a été préalablement mis au point
au laboratoire en milieu VNSS. Les DO des précultures précédentes sont donc mesurées de
façon à obtenir une DO de 0,1 dans un volume final de 50 mL de VNSS. Les cultures sont
incubées à 20°C sous agitation (120 rpm) jusqu’à leur phase post-exponentielle respective.
c) Culture en biofilm
Pour chaque souche, à partir des cultures en erlenmeyer dont les bactéries sont arrivées en
phase stationnaire (délai connu d’après les courbes de croissance réalisées préalablement),
100 boîtes de Pétri (en polystyrène) sont ensemencées à une DO600nm de 0,1 dans 10 mL de
milieu liquide MB. Les boîtes de Pétri sont incubées 72 heures à 20°C sans agitation, afin de
laisser le temps aux bactéries d’adhérer et de former un biofilm. 10 mL de milieu MB sont
ajoutés après 48 h d’incubation.
II-5 Extraction des substances extrapolymériques.
Quatre étapes ont été mises au point pour extraire les EPS des biofilms formés par les
bactéries étudiées :
- récupération du milieu de culture contenant les bactéries non adhérées et les substances
relarguées au cours de la croissance, et centrifugation à 4000g pour séparer le culot CT1
(bactéries libres) du surnageant SN1. Celui-ci est filtré sur 0,2 µm et dialysé (seuil de coupure
3500 Da). Dans SN1 se trouvent les EPS dits solubles, relargués.
- 5 mL de tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) sont ensuite ajoutés dans les boîtes de Pétri
et le fond est gratté afin de décrocher le biofilm.
- 1 traitement est appliqué au biofilm récupéré afin d’extraire les composés de la matrice
extracellulaire sans lyser les cellules (centrifugation à 4000g et filtration du surnageant sur 0,2
µm pour obtenir un CT2 correspondant aux bactéries du biofilm dans leur matrice
exopolymérique (non extraite à ce stade) et un SN2 correspondant aux EPS dits solubles
faiblement liés (décrochés par la centrifugation à faible vitesse).
- puis traitement du biofilm bactérien (CT2) avec une résine échangeuse de cations DOWEX
(forme Na + ) suivi d’étapes de centrifugations à 12000 puis 15000g. La 1 ère est destinée à
décrocher les EPS de la matrice dont les interactions ioniques ont été rompues du fait de
17

l’action de la résine. Les bactéries se retrouvent dans le culot. Afin de poursuivre la séparation
de bactéries restantes (+ grains de résine) avec les produits du surnageant obtenu, 2 autres
centrifugations sont effectuées suivies d’une filtration sur 0,2 µm et d’une dialyse pour
finalement arriver à l’obtention de SN6 correspondant aux EPS dits fortement liés.
Le schéma récapitulatif de l’ensemble de ces étapes se trouve en annexe 1.
II-6 Protocole de partage
Les échantillons d’EPS solubles, d’EPS faiblement liés et d’EPS liés (respectivement SN1,
SN2 et SN6) sont, après lyophilisation et pesée, re-solubilisés dans 8 mL d’eau distillée. Pour
8 mL de solution, 20 mL de méthanol sont ajoutés puis 10 mL de chloroforme, le tout dans
une ampoule à décanter. Après agitation, la solution est laissée décanter pendant 1 heure. A ce
stade une seule phase est visible.
Suite à cela, 5 mL de chloroforme sont ajoutés puis 5 mL d’eau distillée. Après agitation, 2
phases apparaissent. La solution est laissée décanter toute la nuit.
Le lendemain, les phases organiques, aqueuses et une interphase qui s’est formée sont
récupérées puis concentrées à l’évaporateur rotatif (pour les 2 premières).
La phase organique est réduite à sec puis passée à la pompe à vide pour enlever toute trace de
solvant. Les phases aqueuse et interphase sont lyophilisées puis pesées.
II-7 Résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les spectres de RMN 1 H ont été réalisés sur un spectromètre Brüker Avance à 400 MHz.
Le solvant utilisé pour l’étude des phases organiques est le chloroforme deutéré (CDCl3)
tandis que les phases aqueuses ont été analysées dans D2O.
Les spectres RMN 1 H ont été enregistrés par accumulation de 32 scans sur une fenêtre
spectrale de 10 ppm, pour une durée d’analyse d’environ 3min30.
II-8 Infra-rouge à transformée de Fourier (IR-TF)
Les spectres IR de chaque phase organique obtenue pour les 8 souches bactériennes ont été
réalisés avec un appareil FT-IR Nexus Thermo Nicolet.
Une goutte d’échantillon de la phase organique (dissoute dans le chloroforme) est déposée au
centre d’une pastille de KBr, séchée puis recouverte d’une seconde pastille de KBr. Les 2
pastilles sont placées dans un dispositif spécial, qui est inséré dans le spectromètre. Les
spectres sont enregistrés en 16 scans et pour chacun une soustraction du bruit de fond
(« background ») est réalisée.
18

II-9 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
20 µL de phase organique à une concentration de 1 mg/mL dans du méthanol sont injectés sur
une chaîne de chromatographie liquide haute performance HPLC (système VWR-Hitachi
composée d’une pompe quaternaire L-2130, d’un injecteur automatique L-2200 et d’un four à
colonnes L-2300) équipée d’une colonne analytique en phase inverse (Phenomenex, C18,
250 × 3 mm, 5 µm). Cette chaîne chromatographique est équipée d’une triple détection
composée : i) d’un spectromètre de masse (Brüker, Esquire 6000) à ionisation par
électrospray (ESI) et à trappe d’ions, ii) d’un détecteur UV-Vis à barrettes de diodes (VWR-
Hitachi, L-2455) et iii) d’un détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (EUROSEP,
Chromochem). Pour la séparation, l’éluant de départ consiste en un mélange eau/acétonitrile
(9:1, v/v) qui est maintenu pendant 2 minutes. Ensuite, après un gradient de 14 minutes
permettant d’aller de 10% à 100% d’acétonitrile dans l’eau, un palier isocratique final de 3
minutes est appliqué. Les expériences sont réalisées à un débit de 0,5 mL/min. En fin
d’injection, l’éluant revient à sa composition initiale en 1 minute puis la colonne est
rééquilibrée pendant 5 minutes, conduisant à une analyse totale de 35 minutes. Afin d’obtenir
une meilleure ionisation en spectrométrie de masse en mode positif, l’eau utilisée est acidifiée
à 0,1% avec de l’acide formique. Tous les solvants utilisés sont de qualité CLHP (VWR).
19

III- Résultats & Discussion
III-1 Résultats antérieurs
Dans le cadre de ce stage, huit souches bactériennes ont été utilisées (tableau 3).
Date
Durée
Lieux
Souches d’isolement
d’immersion
d’immersion
(h)
Substrat
Couleur
Gram des
colonies
Taxonomie
TC 5 13/02/2008 Mourillon
(Toulon)
6
silicone
ELP08/55554/13
- Jaune Polaribacter sp.
TC 8 13/02/2008 Mourillon
(Toulon)
6
silicone
ELP08/55554/13
- Beige Pseudoalteromonas
byunsanensis
TC 9 13/02/2008 Mourillon
(Toulon)
6
silicone
ELP08/55554/13
- Blanche
Shewanella
surugensis
TC 10 13/02/2008 Mourillon
(Toulon)
6
silicone
ELP08/55554/13
- Beige
Shewanella
donghaensis
Port militaire
FRA 1 10/06/2010
de Toulon
24
silicone fluoré
ELP08/55554/13
-
Beige
saumon
Shewanella
pneumatophori
Port militaire
FRA 2 10/06/2010
de Toulon
24
silicone fluoré
ELP08/55554/13
- Blanche
Alteromonas
genovensis
Port militaire
FRA 4 10/06/2010
de Toulon
24
silicone fluoré
ELP08/55554/13
- Violette Pseudoalteromonas
sp.
Port militaire
FRN 1 10/06/2010
de Toulon
24
silicone fluoré
ELP08/5555/1
- Blanche Pseudoalteromonas
sp.
Tableau 3 : Souches bactériennes utilisées.
Comme décrit dans le tableau 3, plusieurs types de plaques (en polystyrène, silicone et
silicone fluoré Fig. 14b) ont été immergés pendant 6 ou 24 heures à deux endroits de la
Méditerranée : au Mourillon (Toulon) et au port militaire de Toulon (Fig. 14a) afin de
caractériser les bactéries pionnières des biofilms formés.
Fig. 14a : Emplacement géographique du lieu d’immersion des plaques
Fig. 14b : Plaques immergées
Fig. 14c : Culture sur milieu gélosé d’une souche isolée (boîte de Pétri)
20

Après cette courte durée d’immersion, les plaques ont été sorties et un travail d’isolement et
d’étude des différentes souches de bactéries adhérées a été réalisé, cela dans le but premier de
déterminer les espèces présentes.
L’étude des souches a nécessité plusieurs étapes, listées ci-dessous, permettant leur
identification et leur caractérisation physicochimique et métabolique.
Pour l’identification :
- étude morphologique
- coloration de Gram
- morphologie sur milieu solide et état frais
- courbe de croissance
- phylogénie
- mobilité
Pour la caractérisation physicochimique et métabolique :
- MATS (Microbial Adhesion To Solvents)
- potentiel zêta
- galeries API (ZYM pour une étude enzymatique, 20NE étude métabolique et 50CH
pour étudier la fermentation des sucres)
-BFRT (Biofilm Ring Test) pour une étude de la formation de biofilm
Parmi toutes les souches isolées des plaques immergées, les résultats du BFRT ont permis de
sélectionner huit souches pour lesquelles les résultats sont présentés ici (figures 15a et 15b).
La technique du BFRT permet de mesurer la mobilité de billes magnétiques inoculées avec
des bactéries ensemencées et d’évaluer ainsi la densité du biofilm produit par ces bactéries
après incubation et aimantation.
Fig. 15 : Formation de biofilm en fonction du temps (24 à 72h) dans le milieu de culture MB (Marine Broth)
Fig. 15b : Formation de biofilm par la souche TC5 en fonction du temps dans le milieu MB
21

Ces travaux ont finalement permis de caractériser de manière approfondie huit souches isolées
à partir des plaques immergées dans la Méditerranée.
Il ressort de cette étude que :
• Toutes les bactéries sont des bacilles à Gram négatif, chargées négativement à leurs
surfaces ;
• La population au sein d’un même biofilm est hétérogène in situ ;
• On observe une certaine diversité taxonomique mais on retrouve 2 genres présents
majoritairement dans le cadre de cette étude : Pseudoalteromonas et Shewanella ;
• Certaines souches sont plus mobiles que d’autres ;
• Parmi les 8 souches identifiées et caractérisées, seule la souche TC5 semble (d’après
les résultats du Biofilm Ring Test) ne pas produire de matrice d’EPS tout en ayant des
capacités d’adhésion.
• De plus cette souche TC 5 se distingue également car elle est non mobile, présente un
caractère hydrophobe et a la capacité de fermenter certains sucres.
III-2 Démarche expérimentale pour l’extraction des EPS :
Cultures sur 100 boîtes de Pétri.
Le schéma du protocole mis au point est décrit page 17 et 18 et présenté en annexe 1.
Ce protocole a été mis au point avec pour objectif la récupération d’un maximum d’EPS (en
masse) tout en préservant l’intégrité des bactéries, afin de ne pas contaminer les échantillons
avec des composés intracellulaires.
Pour l’extraction des EPS, le choix d’une action chimique avec une résine échangeuse de
cations (Dowex – Forme Na + ) suivi d’une action physique (centrifugation à grande vitesse) a
été fait.
Le protocole a été appliqué sur les souches TC9 et FRN1. Le tableau suivant présente les
résultats obtenus en termes de quantité pour chaque échantillon récupéré.
TC 9 FRN 1
SN 6 0,052 SN 6 0,0795
CT 5 + CT 6 0,1415 CT 5 + CT 6
CT 4 jeté CT 4 jeté
CT 3 3,09 CT 3 23,91
SN 1 0,474
SN 1 + 2 + 3 0,2527 SN 2 + SN 3 0,24
Après partition Après partition
TC 9 SN6 inter 0,0113 FRN1 SN6 aq 0,0303
TC 9 SN 1 2 3 inter 0,256 FRN1 SN 23 inter 0,0729
TC 9 SN 6 aq 0,0285 FRN1 SN 2 3 aq 1,211
TC 9 SN 1 2 3 aq 0,0289 FRN 1 SN 6 inter 0,034
Tableau 4 : Tableau des masses (en g) des différentes fractions obtenues à partir des cultures de 100 boîtes
aq=phase aqueuse / inter=interphase
22

Il s’agira par la suite de répéter ce protocole mis au point sur les autres souches bactériennes,
afin d’extraire les EPS liés (contenus dans SN6), de les purifier et d’analyser leurs structures
avant la recherche d’une activité antifouling de l’un deux.
Ces manipulations prenant énormément de temps (environ 4 semaines par souche), il a été
décidé, dans le cadre du stage, de lancer en parallèle de cette étude, des cultures en plus petite
quantité afin d’avoir un aperçu des résultats futurs pour les 8 souches bactériennes.
III-3 Etude comparative de métabolites des souches
cultivées en biofilm : cultures sur 10 boîtes de Pétri.
L’objectif est ici de comparer les métabolites relargués dans le milieu de culture (contenus
dans SN1) avec les EPS faiblement liés (contenus dans SN2) décrochés par une centrifugation
à faible vitesse (4000g, 40 minutes à 4°C), cela pour les 8 souches bactériennes (pour le
protocole, voir page 19, première partie seulement, jusqu’à l’obtention de SN2).
Souches masse CT1 (mg) masse CT2 (mg) masse SN1 (mg) masse SN2 (mg) BFRT (ΔBFI)
TC 5 230 20 37 6,7 14,3
TC 8 70 70 27 23 20,88
TC 9 140 30 39 18 21,36
TC 10 170 50 22 27 ND
FRA 1 110 70 34 3,6 20,86
FRA 2 130 80 47 1 22,25
FRA 4 70 240 21 55 21,14
FRN 1 180 110 26 9 21,25
Tableau 5 : tableau des masses pour les cultures de 10 boîtes
Pour rappel :
CT1: bactéries libres dans le milieu
CT2: bactéries du biofilm (adhérées)
SN1: EPS solubles libérés dans le milieu
SN2: EPS solubles attachés faiblement au biofilm
Les résultats du BFRT sont exprimés ici en termes de BFI. Plus cet indice est grand, plus la
quantité de biofilm produit est grande. Si l’on regarde les résultats obtenus pour la souche
TC5, c’est la souche qui a le ΔBFI le plus faible, donc c’est celle qui, d’après ce test, forme le
moins de biofilm. De plus, les masses de CT1 (230 mg, valeur maximale) et de CT2 (20 mg,
valeur minimale) coïncident avec le fait que la souche TC5 se multiplie essentiellement en
planctonique et très peu de manière sessile.
En ce qui concerne la souche FRA 4, celle-ci produit du biofilm de façon importante (ΔBFI >
20). Elle se multiplie donc facilement, de façon adhérée au fond des boîtes, ceci étant
confirmé par la masse de CT2 (240 mg, valeur maximale), et moins de façon planctonique
comme le prouve la masse de CT1 (70 mg, valeur minimale). De plus, FRA 4 forme des
voiles visibles à l’œil nu, comme le montre la figure 16.
23

Fig. 16 : Biofilm formé par la souche FRA 4 lors de sa culture sur boîte de Pétri.
Enfin, FRA 2 a aussi un ΔBFI > 20, ce qui laisserait penser à la production d’une matrice
importante. Or, la quantité de bactéries sessiles est moyenne (CT1 = 130 mg) et la masse des
surnageants est maximale pour SN1 (47 mg) et minimale pour SN2 (1mg). Cela pourrait
s’expliquer par le fait que beaucoup de produits soient relargués dans le milieu liquide et que
peu d’entre eux restent associés aux cellules. De plus, SN2 représentant la masse d’EPS
faiblement liés, il se peut que l’essentiel des composés de la matrice soient encore associés
aux cellules.
Il est à noter aussi qu’un ΔBFI important (> 20) traduit avant tout une viscosité importante du
biofilm, qui peut provenir (i) d’une quantité importante d’EPS produits et/ou (ii) d’une
viscosité très importante des EPS de la matrice même s’ils sont produits en faible quantité.
a) Partage
Chacun des échantillons SN1 et SN2 obtenus à partir des 8 souches a fait l’objet d’un partage
CHCl3/MeOH/H2O afin de séparer les composés présents selon leur polarité. Pour chaque
échantillon, trois phases se sont formées, une phase organique et une phase aqueuse attendues
par les proportions du mélange de solvants ainsi qu’une interphase créée par des composés
n’ayant pas d’affinité pour l’une ou l’autre des phases.
Les résultats des masses des différentes phases obtenues (phase aqueuse – interphase – phase
organique) sont donnés dans le tableau suivant.
24

Souches Masse (mg) Masse (mg)
SN1 SN2-3 SN1 SN2-3
25
Masse totale
(mg)
Masse totale
(mg)
TC 5 Phase aqueuse 22 0,1 36,3 6,4
Interphase 7,7 0,9
Phase organique 6,6 5,4
TC 8 Phase aqueuse 19,8 18,3 22,6
Interphase ND 0,6
Phase organique 5,8 3,7
TC 9 Phase aqueuse 24,7 10,4 37,1 17,7
Interphase 8,2 1,7
Phase organique 4,2 5,6
TC 10 Phase aqueuse 12,5 16,8 22 26,2
Interphase 4,6 6
Phase organique 4,9 3,4
FRA 1 Phase aqueuse 15,8 9 236,9 17,3
Interphase 216 2
Phase organique 5,1 6,3
FRA 2 Phase aqueuse 1018,9 0,3 1026,1 2,3
Interphase 6,5 1,8
Phase organique 0,7 0,2
FRA 4 Phase aqueuse 12,7 29,6 18,1 49,2
Interphase 2,3 16,1
Phase organique 3,1 3,5
FRN 1 Phase aqueuse 21,4 5,3 25 8,9
Interphase 3,5 1,9
Phase organique 0,1 1,7
Tableau 6 : Masses des différentes phases après l’étape de partage.
Il apparaît que quelque soit la souche, la quantité d’EPS solubles dans la phase aqueuse est la
plus importante (par rapport aux EPS formant l’interphase ou à ceux qui sont solubles dans la
phase organique). Une exception pour la souche TC5 est à remarquer. Pour cette souche les
composés organiques prédominent dans l’échantillon SN2. Une corrélation peut être faite
avec le caractère hydrophobe de ces bactéries déterminé dans les travaux de caractérisation
préalables au stage (voir fin partie III-1).
b) Spectres RMN
Dans le cadre des cultures sur 10 boîtes, pour chacune des phases organiques de SN1 et SN2
de nos 8 souches, soit pour 16 échantillons, des spectres RMN 1 H ont été réalisés. De plus,
dans le cadre des cultures en grandes quantités, réalisées sur deux souches TC9 et FRN1, les
phases aqueuses et organiques des différents surnageants récupérés ont été également
analysées par RMN 1 H.

Voici en exemple, le profil comparatif de TC9 : SN1 1,2,3 en vert, SN6 en rouge (RMN- 1 H).
Fig. 17 : Superposition des spectres RMN 1 H de TC9 SN1,2,3 et TC9 SN6
Les spectres RMN 1 H ont la même allure et présentent deux régions intéressantes. La
première correspond à une zone comprise entre 0,5 et 2,5 ppm et comporte des signaux
caractéristiques de protons d’acides gras.
En effet, comme annoté sur la figure, les pics à 0,9 ppm correspondent aux signaux des
méthyles terminaux (qui sortent sous la forme de triplets car couplés à un seul méthylène). A
1,3 ppm, apparaissent sous forme d’un signal intense, les méthylènes des chaînes principales.
Les pics à 1,6 et 2,3 ppm correspondent respectivement aux signaux des méthylènes en β et en
α d’un COOH. Enfin, le pic observé à 2 ppm est difficilement attribuable. Il peut s’agir d’un
méthylène en α d’une double liaison CH=CH non conjugué ou d’un méthylène en α d’une
triple liaison.
La seconde zone du spectre (agrandissement sur la figure 18) comprise entre 3,8 et 5,4 ppm
est caractéristique de la présence d’un glycérol : le massif allant de 4 à 4,5 ppm est typique de
protons Ha du glycérol tandis que la zone de 5 à 5,5 ppm correspond au proton Hb. Les
déplacements chimiques et la complexité de ces signaux du glycérol sont en accord avec la
présence d’un mélange complexe de triglycérides, les mono- et les diglycérides présentant des
signaux typiques non observés sur ces spectres.
Remarque : les pics barrés correspondent aux pics des solvants : 7,2 ppm : CDCl3, 3,48 et
1,24 ppm : Ether. Pic à 0,07 ppm : pollution par de la graisse silicone.
26

c) Spectres IR-TF
Pour chacune des phases organiques obtenues après partage des échantillons SN1 et SN2 des
8 souches, les spectres IR-TF ont été enregistrés.
Voici en exemple les spectres IR-TF de FRA 4 SN1 (en rouge) et SN2 (en bleu) [figure 18]
ainsi que les spectres IR-TF de TC9 SN1 (en rouge) et SN2 (en bleu) [figure 19].
Fig. 18 : Spectres FT-IR de FRA 4 SN1 et FRA 4 SN2
Fig. 19 : Spectres FT-IR de TC9 SN1 et TC9 SN2
Les spectres sont annotés ; on peut observer les bandes de vibration de valence des liaisons C-
H, C=O ou encore C-O caractéristiques de la présence d’acides gras.
Ces spectres infrarouge ne permettent pas de déterminer une structure moléculaire, mais ils
nous donnent des indications sur la classe de composés constituant notre échantillon, ici
typiquement des lipides saturés.
27

d) CLHP
Un extrait organique de FRA 4 (identifiée comme une Pseudoalteromonas ulvae), bactéries
formant des colonies violettes (voir tableau 3) et un biofilm violet (voir figure 16) a été
analysé en CLHP (triple détection) dans l’optique de déterminer la présence ou non d’un
pigment connu du nom de violacéine. Ce pigment est, comme son nom l’indique, de couleur
violette et a déjà été identifié essentiellement dans des bactéries appartenant au genre
Chromobacterium (Durán et al., 2007).
La violacéine présente une masse de 343 g/mol et 3 maxima sont observés à 258, 372 et
575 nm sur son spectre UV-visible.
Fig. 20 : Structure chimique de la violacéine
Les résultats de l’analyse chromatographique sont les suivants :
Fig. 21 : Résultats LC-MS
1 ère fenêtre : intensité en fonction de la longueur d’onde
2 nde fenêtre : les 3 dimensions sont la longueur d’onde (en ordonnée), l’intensité (axe
perpendiculaire) et le temps de rétention (en abscisse).
3 ème fenêtre : intensité en fonction du temps de rétention
28

Sur le chromatogramme obtenu, à l’aide de la détection UV-visible à barrettes de
photodiodes, on observe bien trois maxima d’absorption à 258, 372 et 575 nm pour un
composé élué à tR = 4 min.
Fig. 22 : Spectre de masse (-MS) pour tr=4 min
Fig. 24 : Spectre de masse (+MS) pour tr=4 min
29

Les spectres de masse de ce même composé sont en accord avec la présence de violacéine :
deux ions pseudo-moléculaires à m/z 342 [M-H + ] - et m/z 344 [M+H + ] + sont en effet observés
respectivement sur les spectres –MS et +MS.
Il paraît donc maintenant fort probable que le composé responsable de la couleur violette de la
souche FRA 4 est la violacéine. Cette souche a été identifiée comme étant Pseudoalteromonas
ulvae (résultats antérieurs – tableau 3). Elle est décrite dans la littérature comme étant « darkpurple
» et présentant des activités antifouling (Egan et al., 2001). Par ailleurs, des travaux de
recherche d’activité de la violacéine isolée de bactéries du genre Chromobacterium ont
montré que ce pigment possède également de nombreuses activités biologiques (pour
exemples : antitumorale, antibactérienne, antivirale) (Durán et al., 2007). Dans l’optique de
trouver un composé aux propriétés antifouling, mener des tests avec la violacéine isolée
depuis notre souche Pseudoalteromonas ulvae (FRA4) semble être une piste intéressante.
30

IV- Conclusion et Perspectives
Ce stage a permis la mise au point d’un protocole d’extraction des EPS de biofilms formés
par différentes souches de bactéries marines.
L’application de ce protocole à deux souches, TC9 et FRN1, cultivées en condition sessile en
quantité importante a permis d’isoler des EPS selon leurs forces d’adhésion au biofilm. Le
protocole doit donc se poursuivre, pour ces mêmes souches, par l’analyse des molécules
présentes dans les échantillons obtenus à partir de SN1, SN2 et SN6, correspondant
respectivement aux EPS solubles relargués dans le milieu, faiblement associés et fortement
associés au biofilm. Il s’agira là de déterminer, grâce à des techniques de dosages
colorimétriques spécifiques, le pourcentage en protéines et en polysaccharides ; la quantité de
composés lipidiques étant déterminée, après l’étape de partage, en mesurant la masse de
produits allant dans la phase organique (comparativement à la masse des phases aqueuse et
interphase). Après élimination des protéines de chaque échantillon (phases aqueuses et
interphases) grâce à un traitement enzymatique, les polysaccharides pourront être caractérisés
(composition en monosaccharides, masse molaire). Enfin, dans le cas d’une purification
possible, en termes de quantités disponibles, une analyse structurale par RMN et CPG-SM
sera effectuée.
Ce même travail de recherche est envisagé sur l’ensemble des souches sélectionnées. Tout
composé purifié, de nature lipidique ou polysaccharidique sera testé pour son activité
antifouling sur d’autres souches bactériennes.
Parallèlement au travail réalisé sur les cultures importantes de deux souches, des
cultures de l’ensemble des huit souches sélectionnées, sur 10 boîtes de Pétri, ont permis quant
à elles d’avoir un aperçu de la teneur en EPS solubles ou faiblement liés produits par chacune
des souches. Une attention particulière a été portée sur les profils lipidiques des EPS isolés.
Une étude plus approfondie de tous les spectres RMN et IR-TF devra être faite, et un
protocole d’analyse par CLHP sera appliqué dans le but d’obtenir une signature chimique de
métabolites secondaires produits par les bactéries adhérées versus non adhérées. Cette analyse
comparative qualitative et quantitative des métabolites secondaires produits pourrait permettre
d’établir la fonction de ces composés produits en biofilm dans le recrutement ou au contraire
dans la répulsion d’autres espèces bactériennes.
Enfin, concernant le pigment produit par la souche FRA 4, Pseudoalteromonas ulvae,
qui semble être la violacéine d’après les résultats obtenus par CLHP triple détection, une
purification ainsi qu’une analyse structurale en RMN doivent être faites afin de confirmer
notre hypothèse. S’il s’agit bien de la violacéine, et étant donné que la bactérie
Pseudoalteromonas ulvae a été décrite pour son activité antifouling (Egan et al., 2000), une
idée intéressante serait de tester la violacéine extraite de notre souche de Pseudoalteromonas
ulvae, afin de voir si celle-ci aurait une activité antifouling tout en n’étant non toxique
(activité antibactérienne notamment, à plus forte concentration).
31

Références bibliographiques
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Blache Y., Produits naturels marins pour l'élaboration de revêtements antisalissure respectueux de
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32

ANNEXE
33

Annexe 1 : Schéma récapitulatif du protocole mis au point pour l’extraction des EPS.
SN : Surnageant
CT : Culot
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