M - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

l’action de la résine. Les bactéries se retrouvent dans le culot. Afin de poursuivre la séparation
de bactéries restantes (+ grains de résine) avec les produits du surnageant obtenu, 2 autres
centrifugations sont effectuées suivies d’une filtration sur 0,2 µm et d’une dialyse pour
finalement arriver à l’obtention de SN6 correspondant aux EPS dits fortement liés.
Le schéma récapitulatif de l’ensemble de ces étapes se trouve en annexe 1.
II-6 Protocole de partage
Les échantillons d’EPS solubles, d’EPS faiblement liés et d’EPS liés (respectivement SN1,
SN2 et SN6) sont, après lyophilisation et pesée, re-solubilisés dans 8 mL d’eau distillée. Pour
8 mL de solution, 20 mL de méthanol sont ajoutés puis 10 mL de chloroforme, le tout dans
une ampoule à décanter. Après agitation, la solution est laissée décanter pendant 1 heure. A ce
stade une seule phase est visible.
Suite à cela, 5 mL de chloroforme sont ajoutés puis 5 mL d’eau distillée. Après agitation, 2
phases apparaissent. La solution est laissée décanter toute la nuit.
Le lendemain, les phases organiques, aqueuses et une interphase qui s’est formée sont
récupérées puis concentrées à l’évaporateur rotatif (pour les 2 premières).
La phase organique est réduite à sec puis passée à la pompe à vide pour enlever toute trace de
solvant. Les phases aqueuse et interphase sont lyophilisées puis pesées.
II-7 Résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les spectres de RMN 1 H ont été réalisés sur un spectromètre Brüker Avance à 400 MHz.
Le solvant utilisé pour l’étude des phases organiques est le chloroforme deutéré (CDCl3)
tandis que les phases aqueuses ont été analysées dans D2O.
Les spectres RMN 1 H ont été enregistrés par accumulation de 32 scans sur une fenêtre
spectrale de 10 ppm, pour une durée d’analyse d’environ 3min30.
II-8 Infra-rouge à transformée de Fourier (IR-TF)
Les spectres IR de chaque phase organique obtenue pour les 8 souches bactériennes ont été
réalisés avec un appareil FT-IR Nexus Thermo Nicolet.
Une goutte d’échantillon de la phase organique (dissoute dans le chloroforme) est déposée au
centre d’une pastille de KBr, séchée puis recouverte d’une seconde pastille de KBr. Les 2
pastilles sont placées dans un dispositif spécial, qui est inséré dans le spectromètre. Les
spectres sont enregistrés en 16 scans et pour chacun une soustraction du bruit de fond
(« background ») est réalisée.
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