M - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

II-4 Préculture / Culture en biofilm
a) Préculture
Avec une oese stérile, des bactéries prélevées du cryotube sont étalées à la surface d’une
boîte de Pétri contenant du milieu gélosé Marine Agar (MA). Les boîtes sont ensuite incubées
à 20°C pendant 72 h afin de permettre la croissance bactérienne. Cinq mL de milieu de
culture MB liquide sont alors inoculés avec une colonie prélevée sur la boîte de Pétri. Cette
étape permet de synchroniser la croissance des bactéries en culture liquide.
b) Culture en erlenmeyer
Les bactéries doivent être en phase post-exponentielle ou stationnaire de croissance pour être
en mesure de produire un biofilm de manière optimale. Ceci a été préalablement mis au point
au laboratoire en milieu VNSS. Les DO des précultures précédentes sont donc mesurées de
façon à obtenir une DO de 0,1 dans un volume final de 50 mL de VNSS. Les cultures sont
incubées à 20°C sous agitation (120 rpm) jusqu’à leur phase post-exponentielle respective.
c) Culture en biofilm
Pour chaque souche, à partir des cultures en erlenmeyer dont les bactéries sont arrivées en
phase stationnaire (délai connu d’après les courbes de croissance réalisées préalablement),
100 boîtes de Pétri (en polystyrène) sont ensemencées à une DO600nm de 0,1 dans 10 mL de
milieu liquide MB. Les boîtes de Pétri sont incubées 72 heures à 20°C sans agitation, afin de
laisser le temps aux bactéries d’adhérer et de former un biofilm. 10 mL de milieu MB sont
ajoutés après 48 h d’incubation.
II-5 Extraction des substances extrapolymériques.
Quatre étapes ont été mises au point pour extraire les EPS des biofilms formés par les
bactéries étudiées :
- récupération du milieu de culture contenant les bactéries non adhérées et les substances
relarguées au cours de la croissance, et centrifugation à 4000g pour séparer le culot CT1
(bactéries libres) du surnageant SN1. Celui-ci est filtré sur 0,2 µm et dialysé (seuil de coupure
3500 Da). Dans SN1 se trouvent les EPS dits solubles, relargués.
- 5 mL de tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) sont ensuite ajoutés dans les boîtes de Pétri
et le fond est gratté afin de décrocher le biofilm.
- 1 traitement est appliqué au biofilm récupéré afin d’extraire les composés de la matrice
extracellulaire sans lyser les cellules (centrifugation à 4000g et filtration du surnageant sur 0,2
µm pour obtenir un CT2 correspondant aux bactéries du biofilm dans leur matrice
exopolymérique (non extraite à ce stade) et un SN2 correspondant aux EPS dits solubles
faiblement liés (décrochés par la centrifugation à faible vitesse).
- puis traitement du biofilm bactérien (CT2) avec une résine échangeuse de cations DOWEX
(forme Na + ) suivi d’étapes de centrifugations à 12000 puis 15000g. La 1 ère est destinée à
décrocher les EPS de la matrice dont les interactions ioniques ont été rompues du fait de
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