M - laboratoire PROTEE - Université du Sud - Toulon - Var

II-9 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
20 µL de phase organique à une concentration de 1 mg/mL dans du méthanol sont injectés sur
une chaîne de chromatographie liquide haute performance HPLC (système VWR-Hitachi
composée d’une pompe quaternaire L-2130, d’un injecteur automatique L-2200 et d’un four à
colonnes L-2300) équipée d’une colonne analytique en phase inverse (Phenomenex, C18,
250 × 3 mm, 5 µm). Cette chaîne chromatographique est équipée d’une triple détection
composée : i) d’un spectromètre de masse (Brüker, Esquire 6000) à ionisation par
électrospray (ESI) et à trappe d’ions, ii) d’un détecteur UV-Vis à barrettes de diodes (VWR-
Hitachi, L-2455) et iii) d’un détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (EUROSEP,
Chromochem). Pour la séparation, l’éluant de départ consiste en un mélange eau/acétonitrile
(9:1, v/v) qui est maintenu pendant 2 minutes. Ensuite, après un gradient de 14 minutes
permettant d’aller de 10% à 100% d’acétonitrile dans l’eau, un palier isocratique final de 3
minutes est appliqué. Les expériences sont réalisées à un débit de 0,5 mL/min. En fin
d’injection, l’éluant revient à sa composition initiale en 1 minute puis la colonne est
rééquilibrée pendant 5 minutes, conduisant à une analyse totale de 35 minutes. Afin d’obtenir
une meilleure ionisation en spectrométrie de masse en mode positif, l’eau utilisée est acidifiée
à 0,1% avec de l’acide formique. Tous les solvants utilisés sont de qualité CLHP (VWR).
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