BINDAZYME™ Human Anti-Gliadin EIA Kit For in-vitro ... - inova

BINDAZYME Human Anti-Gliadin
(MGP) EIA Kits
Nur zur in- vitro Diagnostik
Bestell Nr.: IgG: MK135
IgA: MK136
IgG oder IgA: MK137
Hergestellt von:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK.
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Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:
The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straβe 2A
D-68723 Schwetzingen, Deutschland
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1 VERWENDUNGSZWECK
Diese Kits dienen der in-vitro Bestimmung spezifischer IgG- oder IgA-Antikörper gegen
ein modifiziertes Gliadin-Peptid (MGP) in Humanserum und zur Unterstützung bei der
Diagnosestellung und Überwachung einer Zöliakie zusammen mit anderen Befunden
aus Labor und Klinik.
2 EINFÜHRUNG
Zöliakie ist eine entzündliche Erkrankung des Dünndarms, die durch den Verzehr von
Gluten, einem in Weizen und verwandten Getreidesorten (Roggen, Gerste) vorkommenden
Protein hervorgerufen wird. Im Dünndarm wird das aufgenommene Gluten zu Gliadin-
Peptiden abgebaut, die dann von der Gewebstransglutaminase (tTG) enzymatisch
desaminiert werden, was dazu führt, dass aus den Glutamin-Aminosäureresten
Glutaminsäure wird. Diese so modifizierten Gliadin-Peptide sind für die toxische
Mechanismen der Zöliakie entscheidend: Sie verstärken die Immunogenität des
Gliadins und lösen eine Immunantwort aus 1 . Werden nämlich diese desaminierten
Peptide den Zellen des Immunsystems präsentiert, produzieren diese IgA- und IgG-
Antikörper gegen Gliadin und weitere Autoantigene und es kommt zu einer starken
lokalen Entzündungsreaktion, die den Verlust von Mikrovilli und damit eine dramatische
Abnahme in der Absorptionsfähigkeit von Nährstoffen nach sich zieht 2 .
Bei den herkömmlichen ELISAs wird zur Bestimmung der Anti-Gliadin-Antikörper die in
Ethanol lösliche Fraktion des Glutens eingesetzt. Hinsichtlich der diagnostischen
Aussagekraft weisen diese Tests allerdings nur eine eingeschränkte Sensitivität und
Spezifität auf 3,4 . Neuere Studien haben gezeigt, dass Gliadin-reaktive Antikörper an nur
eine begrenzte Anzahl spezifischer Epitope auf dem Gliadinmolekül 5 binden und diese
Bindung durch Desaminierung des Gliadins verstärkt wird 6,7 . ELISAs, die zum
Antikörpernachweis spezifische, desaminierte Gliadin-Peptide verwenden, weisen
demnach eine deutlich höhere diagnostische Aussagekraft auf als diejenigen, die eine
unbehandelte Gliadin-Antigenpräparation einsetzen 7 .
Die Bestimmung von Anti-Gliadin-Antikörpern ist zur Überwachung der Krankheitsaktivität
und Einhaltung einer glutenfreien Diät sinnvoll 8 . Auch zum frühzeitigen Nachweis einer
Zöliakie ist sie hilfreich, da diese Antikörper bereits zu einem frühen Zeitpunkt der
Erkrankung produziert werden 8 . Während IgG-Antikörper gegen Gliadin als sensitivere
Zöliakie-Marker gelten als die des IgA-Typs, sind letztere spezifischer. Es wird
empfohlen, grundsätzlich auf beide Antikörperklassen, IgG und IgA, zu testen, da unter
Zöliakie-Patienten ein IgA-Mangel 9 sehr verbreitet ist und ein serologischer Nachweis
von IgA-Antikörpern trotz Vorliegen einer Zöliakie negativ ausfallen könnte.
3 TESTPRINZIP
Die Vertiefungen (Wells) der Mikrotiterplatten sind mit modifiziertem Gliadin-Peptid
beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und verdünnten Patientenproben werden in den
Vertiefungen inkubiert, so dass in diesem ersten Inkubationsschritt Antikörper an das
immobilisierte Antigen binden können. Nach dem Waschen der Vertiefungen - um
ungebundenes Protein zu entfernen - wird Peroxidase-markiertes Kaninchen anti-Human-
IgG- oder IgA-Konjugat (spezifisch für die γ- bzw. α-Kette) zugegeben. Das Konjugat
bindet an die gebundenen humanen Antikörper. Ungebundenes Konjugat wird durch
einen weiteren Waschschritt entfernt. Das gebundene Konjugat wird mit Hilfe von
3,3’,5,5’ Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues
Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Antikörper-Konzentration der
Probe ist. Um die Reaktion zu stoppen, wird in jede Vertiefung Phosphorsäure
pipettiert. Das gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450nm gemessen.
4 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN
4.1 WARNUNGEN
Jede Einzelspende wurde auf Antikörper gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen
(HBsAg), Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1&2) und Hepatitis C-Virus untersucht
und negativ befundet. Da es aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum
Ausschluss von Infektionsträgern gibt, sollten die Reagenzien als potenziell infektiös
eingestuft werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potenziell
infektiöses Material entsprechen und der Test nur von entsprechend geschultem
Personal durchgeführt werden.
Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der
Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen, um Azidablagerungen zu
vermeiden.
Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym-Inhibitoren als
Konservierungsmittel. Diese sollten mit der entsprechenden Vorsicht behandelt werden.
INHIBITOR
KONZENTRATION
Kathon
0,02%
Natriumazid
0,099%
ProClin 300
0,045%
Bromonitrodioxan
0,002%
Methylisothiazon
0,002%
ProClin ist ein Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen.
Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure. Sie ist reizend, deshalb Kontakt mit Haut
und Augen vermeiden.
Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und
gesetzliche Bestimmung zu beachten.
4.2 VORSICHTSMAßNAHMEN
Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden.
Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die
Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen ‚Hinweise‘
und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung.
Die Chargen von Kalibratoren, Kontrollen, Konjugat und Mikrotiterstreifen sind nicht
austauschbar. Wird eine dieser Komponenten durch eine andere Charge, die nicht in
dem gelieferten Kit enthalten ist, ersetzt, kann es zu inkonsistenten und inakkuraten
Ergebnissen kommen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel
entnommen werden.
Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastik- oder
Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen zurückgeben.
Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehen lassen. Die daraus resultierende
Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen.
TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen!
Die Verwendung von mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer oder
lipämischer Seren vermeiden.
Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit-Kontrollen
gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und geeignete interne
Kontrollen zu verwenden.
Bei der Verwendung von automatisierten Testsystemen, Probenverdünnern und anderem
automatisierten Zubehör, sind die Anweisungen des Herstellers sorgfältig zu befolgen.
Besondere Sorgfalt gilt der Aufstellung und Installation der Geräte und der Verbindung zu
externen Systemen. Alle Einstellungen, die die automatisierten Wasch- und Lesegeräte
betreffen, müssen sorgsam befolgt werden. Die Geräte müssen den Herstellerangaben
entsprechend instand gehalten und gewartet werden.
4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT
Den Kit bei 2-8°C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur beeinflusst
die Ergebnisse.
Der Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei 2-8°C bis maximal 4
Wochen haltbar. Der Waschpuffer kann kalt ohne das die Qualität des Tests
beeinflusst wird, verwendet werden.
Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben.
5 PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG
Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen.
Serum vom Gerinnsel trennen. Die Seren können bei 2-8°C bis zu 7 Tage vor dem
Test gelagert werden 10 . Für eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren
aliquotiert bei mindestens -20°C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der
Proben vermeiden. Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falsch-positiven
Ergebnissen führen.
6 MATERIALIEN
Der Kit enthält genügend Material um maximal 41 Proben in Doppelbestimmung oder
89 Proben in Einzelbestimmung, sowie eine Kalibrationskurve, eine Positiv- und eine
Negativkontrolle zu messen. Es werden semiquantitative Ergebnisse erhalten. Der Kit
kann auch als qualitativer Test verwendet werden. Im qualitativen Test können
maximal 45 Proben in Doppelbestimmung oder 93 Proben in Einzelbestimmung, eine
Cut-Off-Kontrolle und je eine Positiv- und eine Negativkontrolle gemessen werden.
6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN – Für alle Kits
6.1.1 Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung.
6.1.2 QC-Zertifikat: mit Angabe der Leistungsdaten der Charge.
6.1.3 Gliadin (MGP) Coated Wells (mit Gliadin (MGP) beschichtete
Mikrotiterstreifen): 12 Mikrotiterstreifen mit je 8 vereinzelbaren Wells, die mit
modifiziertem Gliadin-(MPG)-Antigen beschichtet sind. Die Streifen sind in
einem wieder-verschließbaren Folienbeutel, der ein Trockenmittel enthalt verpackt.
6.1.4 Type III Sample Diluent (Probendiluens Typ III): 2 Flaschen mit je 50mL
gebrauchsfertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb.
6.1.5 Type III Wash Buffer (Waschpuffer Typ III): 1 Flasche mit 50mL eines
20-fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Wells.
6.1.6 TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung. Gebrauchsfertig.
6.1.7 Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure.
Gebrauchsfertig.
6.2 GELIEFERTE MATERIALIEN – PRODUKTSPEZIFISCH
6.2.1 BINDAZYME Anti-Gliadin (MGP) IgG (MK135)
6.2.1.1 Gliadin (MGP) IgG Calibrators (Gliadin (MGP)-IgG-Kalibratoren): 5
Flaschen mit je 1mL gebrauchsfertig verdünntem Humanserum mit folgenden
Konzentrationen an Anti-Gliadin (MGP)-IgG-Antikörpern 100; 33,3; 11,1; 3,7;
1,23 U/mL.
6.2.1.2 Gliadin (MGP) IgG Cut-off-Control (Gliadin (MGP)-IgG-Cut-off-Kontrolle): 1
Flasche mit 1mL gebrauchsfertig verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist
auf dem QC-Zertifikat angegeben.
6.2.1.3 Gliadin (MGP) IgG Positive Control (Gliadin (MGP)-IgG-Positivkontrolle): 1
Flasche mit 1mL gebrauchsfertig verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist
auf dem QC-Zertifikat angegeben.
6.2.1.4 Gliadin (MGP) Negative Control (Gliadin (MGP)-Negativkontrolle): 1
Flasche mit 1mL gerbrauchsfertig verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist
auf dem QC-Zertifikat angegeben.
6.2.1.5 Gliadin (MGP) IgG Conjugate (Gliadin (MGP)-IgG-Konjugat): 1 Flasche mit
12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG.
Farbcodierung: rot. Gebrauchsfertig.
Insert Code: E135, Version: 25 th March 2009, Page 4 of 13