2 - IBMC

Chap VI.
La Phosphorylation oxydative
I. Introduction
1. Vue générale
Formation d’ATP // transfert d’e - de NADH / FADH 2 sur O 2
• effectuée par des « ensembles respiratoires »
• oxydation et phosphorylation couplées
• ensembles respiratoires contenant de nombreux transporteurs
d’e - (ex : cytochromes)
• transport d’e - pompage de protons hors de la mitochondrie :
force proton motrice
• retour des H+ synthèse ATP
Figures tirées de
Lehninger Principles of Biochemistry
Fourth Edition
Copyright © 2004 by W. H. Freeman & Company

2. Vue générale
H 2 O
Membrane
Matrice
ATP
e -
ADP
+ Pi
O 2
----
+ + + +
H + H +

3. Description de la mitochondrie
Membrane
externe
Perméables aux petites molécules et aux ions
Mb interne
Matrice
Phosphorylation oxydative
Imperméable aux ions et molécules non
chargées transporteurs d’ADP, ac. gras à
longues chaînes
Krebs, oxydation des acides gras
PORINE

II. Les navettes de transport du NADH et du FADH 2
cytoplasmique
1. La navette glycérol-phosphate
CYTOSOL
MATRICE
L-Glycérol-P
P-OCH 2
-CHOH-CH 2
OH
L-Glycérol-P
P-OCH 2 -CHOH-CH 2 OH
QH 2
O 2
2 ATP
NAD +
c Glycérol-
P DH
NADH
+ H +
FAD
FADH 2
Q
DHAP
P-OCH 2
-CO-CH 2
OH
DHAP
P-OCH 2 -CO-CH 2 OH
mGlycérol-P DH
Bilan : NADH + H + + E-FAD NAD + + E-FADH 2
Membrane
cytoplasmique externemitochondriale
Membrane
cytoplasmique interne
mitochondriale

La navette glycérol-phosphate

2. La navette malate / aspartate
3 ATP
+ O 2

III. Les potentiels redox et les variations d’énergie libre
Conversion du
Potentiel de transfert électronique
en
Potentiel de transfert de groupe phosphate
E’ 0
ΔG’
Rappel :
X + e - X -
oxydant
= forme oxydée
réducteur
= forme réduite
Rq : potentiel rédox :
force +/- importante de capter / donner des e -

Appareil pour mesurer un potentiel rédox
1 M H + en
équilibre avec
1 atm de H 2
gazeux
Solution de
1 M X et 1
M X -

Bilan :
• Potentiel rédox NÉGATIF
Composé a une affinité plus FAIBLE pour les électrons que H 2
REDUCTEUR
• Potentiel rédox POSITIF
Composé a une affinité plus GRANDE pour les électrons que H 2
OXYDANT

Calcul de la variation d’énergie libre à partir des potentiels rédox
a) pyruvate + NADH + H + lactate + NAD +
b) pyruvate + 2 H + + 2 e - lactate
E’ 0 = -0,19 V
c) NAD + + 2 e - + 2 H + NADH + H + E’ 0 = -0,32 V
b - c = a
pyruvate + H + + NADH lactate + NAD +
ΔE’ 0 = E’ 0 b) - E’ 0 c)
= -0,19 - (-0,32)
= +0,13 V

ΔG’ = -n F ΔE’ 0
n = nombre d’électrons transférés
F = l’équivalent calorique du faraday
= 23,062 kcal V -1 mol -1
ΔE’ 0 = exprimé en volt
Δ’ = -2 × 23,062 × 0,13
kcal × Volts
= -6
Volts × mole
= -6 kcal / mole
Rq : ΔE’ 0 positif correspond à réaction exergonique

Oxydation du NADH
a) 1/2 O 2 + 2 H + + 2 e - H 2 O
b) NAD + + H + + 2 e - NADH
E’ 0 = +0,82 V
E’ 0 = -0,32 V
a -b = 1/2 O 2 + H + + NADH H 2 O + NAD +
ΔE’ 0 = +0,82 V + 0,32 V = 1,14 V
ΔG°’ = -2 . 23,062 . 1,14
= - 52,6 kcal / mole

Oxydation du FADH 2
a) 1/2 O 2 + 2 H + + 2 e - H 2 O
b) FAD + 2 H + + 2 e - FADH 2
E’ 0 = +0,82 V
E’ 0 = -0,1 V
a -b = 1/2 O 2 + FADH 2
H 2 O + FAD
ΔE’ 0 = +0,82 V + 0,10 V = 0,92 V
ΔG°’ = -2 × 23,062 × 0,92
= - 42,4 kcal / mole

IV. Composition de la chaîne respiratoire
V
Complexe I : NADH - ubiquinone réductase
Complexe II : succinate - ubiquinone réductase
Q : Coenzyme Q = Ubiquinone
Complexe III : Ubiquinol - cytochrome c réductase
Complexe IV : Cytochrome c oxydase
Complexe V : ATPase / ATP synthase

Caractéristiques des complexes protéiques de la chaîne
respiratoire de transport d’électrons dans la mitochondrie
Complexe
Protomères
Masse
moléculaire
Nombre de
composants
I.
NADH-ubiquinone
réductase
25
800.000
•1 FMN
• 22-24 Fe-S ds 5 à 8
centres
II.
Succinate-ubiquinone
réductase
4
125.000
•1 FAD
• 7-8 Fe-S ds 3 centres
• Cytochrome b 560
III.
Ubiquinol-cytochrome c
réductase
8
220.000
• 2 centres Fe-S
• Cytochrome b 560
• Cytochrome b 566
• Cytochrome c 1
IV.
Cytochrome c oxydase
12
200.000
• Cytochrome a
• Cytochrome a 3
• 2 ions cuivre

Centres Fer - Soufre
4 Soufre, 1 Fer
6 Soufre, 2 Fer
8 Soufre, 4 Fer
Ce sont des micro chemins pour les électrons

Les hèmes des cytochromes
‣ 4 groupements pyrrols : liés avec alternance /
‣ coordination d’1 atome de Fe au milieu
‣ différences entre les hèmes : les chaînes latérales
Longue chaîne carbonée (isoprénique)
hydrophobe ancrage dans la membrane

Hème famille cyt. b :
• Petites chaînes latérales
• Hème tient dans une protéine
Hème famille cyt c :
• liaisons covalente avec sa protéine

Le Coenzyme Q
= ubiquitine car ubiquitaire
Ubiquinone (Q)
Forme oxydée
Intermédiaire
Semiquinone
( • QH)
Chaîne isoprénique
(taille variable,
hydrophobe, reste collé à
la membrane)
Ubiquinol (QH 2 )
Forme réduite

FMN (Flavine mononucléotide)
e - + H + e - + H +
Flavine
mononucléotide
(FMN)
forme oxydée
Semiquinone
intermédiaire
Flavine
mononucléotid
e
(FMNH 2 )
forme réduite

Le complexe I
H + , e - H + , e -
H + , H -
• FMN FMNH 2 FMNH• FMN
• Q
ubiquinone
e - e - , 2 H +
Q •-
semiquinone
QH 2
ubiquinol

Le complexe II
matrice
FAD
2 . 1 e - 2 . 1 e -
FADH 2
Fe - S
2 e -
QH 2
Q
succinate fumarate
succinate déshydrogénase
2 H +
pas de pompe à protons

Le complexe II
matrice

Le complexe III
QH 2
H + Cyt c

Le complexe III
Oxydation du premier QH 2
Oxydation du second QH 2

Le complexe III
Cytochrome bc1 complexe

Le complexe IV
Cytochrome c oxydase
Cyt c
2 . 1 e -
a - Cu a 2 . 1 e -
3 -Cu
2 H + 2 H +
2 H + + 1/2 O 2 H 2 O

Le complexe IV

NADH FMN Fe-S Q Fe-S
Cyt b
Succinate FAD Fe-S
-0,4
NADH
Complexe I
-0,2
NAD +
NADH-ubiquinone
réductase
Cyt c 1 Cyt c Cyt a Cyt a 3 O 2
Trajet
des
électrons
ΔG°’
(kcal / mol)
50
40
0
0,2
Succinate
Fumarate
Complexe II
Q
Complexe III
30
0,4
Succinate-ubiquinone
réductase
Cyt c
Complexe IV
20
0,6
Ubiquinol-cytochrome c
réductase
Cytochrome c
oxydase
1/2 O 2
+ 2 H +
10
E°’ (V)
H 2
O

V. Couplage oxydation / phosphorylation
1. Théorie de Mitchell
Théorie chimiosmotique (1961)
Transfert d’e -
Synthèse d’ATP
Couplage par gradient de protons
(potentiel de membrane)
ΔΨ
• organisation vectorielle du transport d’électrons et de l’ATPase
• compartiments fermés
• L’événement primaire conservant l’énergie est le mouvement
des protons à travers la membrane

Preuves de la théorie de Mitchell
1. Existence d’un gradient de protons
• pH inter membranaire

Lumière
Vésicule
lipidique
H + H +
H +
F 1 F 0 -ATP
synthase de
mitochondrie
Bactériorhodopsine
• Vésicule hybride
reconstituée, contenant de
l’ATP synthase et de la
bactériorhodopsine. Ce
système a été utilisé par
Stoecknius et Racker pour
confirmer la théorie
chimiosmotique de Mitchell.
ADP + Pi
H +
ATP

2. L’ATP synthase mitochondriale
F 1
α 3 β 3 γδε
F 0
a, b, c
F 1 : • contient le site catalytique pour la synthèse d’ATP
• particule sphérique (côté matriciel)
F 0 : • contient le canal protonique / transmembranaire
Tige entre F 1 et F 0 : • contient les sites de régulation :
- du flux de protons / de la synthèse
(sensibilité à l’oligomycine)

L’ATP synthase mitochondriale

L’ATP synthase mitochondriale

L’ATP synthase mitochondriale

L’ATP synthase mitochondriale

3. Synthèse d’ATP par les sous unités β
“loosly interactive“
“open“
“tight“
Rôle du flux de protons :
- n’intervient pas dans la synthèse d’ATP
- intervient dans la libération d’ATP

Synthèse d’ATP par les sous unités β

3 ATP synthétisés à partir de 1 NADH + H+
2 ATP synthétisés à partir de 1 FADH2

4. Synthèse d’ATP
ADP 3- + Pi 2- + H +
ATP 4- + H 2 O
O
O
O
R
O
P
O
P
O
+ O P OH + H +
O
ADP
O
O
Pi
intermédiaire
pentacovalent
R
O
O
P
O
O
O
P
O
O
O O
P
O
O
H
H +
O
O
O
ATP
R
O
P
O
P
O
P
O
+ H 2 O
O
O
O

5. Le transport transmembranaire de l’ADP et de l’ATP

ADP - ATP translocase
(14 % des protéines membrane interne)
++ ++
ADP c
ADP
éversion
Matrice
-------
ATP c
ADP
ATP
éversion
ATP m
ATP
• autres transporteurs : citrate, succinate, calcium etc…

6. Bilan total glycolyse + cycle de Krebs
• Glucose + 2 NAD + + 2 Pi + 2 ADP
2 Pyruvate + 2 NADH + 2 H + + 2 ATP + 2 H 2 O
• 2 Pyruvate + 2 NAD + + 2 HS-CoA
2 Acétyl-CoA + 2 CO 2 + 2 NADH + 2 H +
• 2 Acétyl-CoA + 4 H 2 O + 6 NAD + + 2 FAD + 2 GDP + 2 Pi
4 CO 2 + 6 NADH + 2 FADH 2 + 2 GTP + 4 H + + 2 CoA
Glucose + 10 NAD + 6 CO 2
+ 4 Pi + 10 NADH
+ 2 ADP + 6 H +
+ 2 GDP + 2 ATP
+ 2 H 2 O + 2 GTP
+ 2 FAD + 2 FADH 2

or
Chaque NADH
Chaque FADH 2
3 ATP
2 ATP
1 glucose 10 × 3 = 30 (NADH)
+ 2 × 2 = 4 (FADH 2 )
+ 2 = 2 (ATP)
+ 2 = 2 (GTP)
38 ATP
ΔG° = -688 kcal / mole pour le glucose
Synthèse d’ATP = 38 × -7,3 = -277,4 kcal / mole
100 × 277,4
L’efficacité est de
= 40,3 %
688
60 % de l’énergie se retrouvent sous forme de chaleur

Bilan
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
+ NADH + H + + FADH 2
Palmitate + CoASH + ATP + 7 FAD + 7 NAD +
+ 7 CoASH + 7 H 2 O
8 CH 3 CO~S.CoA + AMP + PPi + 7 FADH 2 + 7 NADH + 7 H +

or 1 NADH 3 ATP
1 FADH 2 2 ATP
1 CH 3 CO~S.CoA 12 ATP
8 × 12 = 96
7 × 2= 14
131 ATP formés
7 × 3= 21
or 2 liaisons riches en énergie consommées
129 ATP

Rendement de conservation en énergie
énergie calculée : 129 × -7,3 = -940 kcal
énergie mesurée : - 2340 kcal
- 940 × 100
Rendement = = 40 %
- 2340
1 Glucose 1 Palmitate
38 ATP 129 ATP
38
6
= 6,33 ATP par
carbone
129
16
= 8,06 ATP par
carbone

VI. Régulation de la chaîne respiratoire
1. Bilan énergétique, rapport P / O
• Oxydation d’1 mole de NADH
‣ ΔG = -220 kJ
(oxydation couplée à l’expulsion de 10 moles de H + )
• Transport des protons (intérieur vers extérieur)
‣ 204 kJ (pour 10 moles H + )
Rendement de couplage =
204
220
= 90 %
• Retour des H + dans ATP synthase
‣ ΔG = -20,4 kJ
Or il faut 3 moles de H + / 1 ATP
‣ ΔG = -61,2 kJ

• Synthèse d’1 ATP
‣ ΔG = 45 kJ
204
Rendement = = 90 %
220
Rapport P / O =
nombre ATP formé
nombre d’oxygène consommé
P / O = 3 pour NADH
P / O = 2 pour FADH 2

2. Contrôle respiratoire
‣ par vitesse de retour des H +
‣ par vitesse de consommation de O 2
Régulateurs principaux = [ADP] [ATP]
3. Découplages
‣ H + reviennent dans matrice SANS passer par ATP synthase
I
III
H + H + H + H +
IV
V
• déplacement d’e -
• gradient de protons
• retour des protons
PAS de synthèse d’ATP FORTE PRODUCTION de CHALEUR

Agents découplants naturels
‣ nouveaux nés
‣ mammifères adaptés au froid
‣ animaux en hibernation
• tissus adipeux brun
spécialisé en thermogenèse contient Thermogénine
activée par acides gras libres, acides gras libérés par noradrénaline
Découplage sous contrôle hormonal
• “Aposère fétide“ = plante, chauffage des pointes florales
évaporation des molécules odoriférantes
attraction des insectes

• Agents découplants artificiels
Autre schéma illustrant le phénomène
de découplage

4. Blocage des pompes à protons
• Complexe I : roténone, anytal
attention
n’interfèrent pas avec oxydation du succinate
• Complexe III : antimycine A
blocage contournable par ascorbate
• Complexe IV : CN -
N 3
CO
cyanures
azides
oxyde de carbone

5. Élimination des dérivés toxiques de O 2
O 2
e - H +
O
-•
2 HO
•
2
anion
superoxyde
radical
hydroperoxyl
HO 2
•
O 2
H 2 O 2
peroxyde
d’hydrogène
DESTRUCTEUR
SUPEROXYDE DISMUTASE
2 H +
O
-•
2 + O
-•
2 H 2 O 2 + O 2
CATALASE H 2 O 2 +H 2 O 2 2 H 2 O + O 2
PÉROXYDASES H 2 O 2 + AH 2 2 H 2 O + A