Cinétique pré-stationnaire et réactions rapides - IBMC

CINETIQUE PRE-STATIONNAIRE ET REACTIONS RAPIDES : POURQUOI
ET COMMENT ETUDIER LES REACTIONS RAPIDES ?
Chapitre 1 : état stationnaire et introduction à l’état pré-stationnaire
Rappel : l’état stationnaire
Henri, d’une part, et Michaelis et Menten, d’autre part, ont étudié plusieurs réactions
enzymatiques. Ils ont montré que leurs observations expérimentales peuvent s’expliquer en
considérant le mécanisme réactionnel suivant :
k +1 k +2
E + S ES E + P (1)
k1
où E, S et P représentent respectivement l’enzyme, le substrat et le produit.
Henri établit le premier l’équation liant la vitesse d’apparition du produit à la
concentration en enzyme et en substrat. Son modèle repose sur deux hypothèses :
- Un équilibre rapide s’établit entre l’enzyme et le substrat.
- La concentration en substrat est largement supérieure à celle de l’enzyme.
Michaelis et Menten ont repris les mêmes hypothèses et ont systématisé l’usage des
mesures de la vitesse initiale (v). Ainsi, en tenant compte que la constante de dissociation du
complexe ES est définie par :
[ ][ S]
[ ]
K 1
= E
ES
= k 1
k +1
(2)
et de la conservation de la concentration totale en enzyme
E 0
= [ E]+ [ ES] (3)
où E 0 est la concentration totale en enzyme et [E] et [ES] représentent les concentrations
d’enzyme libre E et de complexe ES au temps t, (Notons que le plus souvent : E 0
= [ E] 0
, où
[E] 0 est la concentration en enzyme libre E au temps t = 0.), ils ont obtenu la relation :
[ ] 0
[ S]
[ ]
v = k E +2
K 1
+ S
Il est cependant possible d’établir l’équation d’apparition de vitesse du produit sans
faire les hypothèses restrictives de Henri et Michaelis et Menten, ainsi que l’ont montré
Briggs et Haldane. La vitesse nette d’apparition du produit est obtenue en appliquant la loi
d’action des masses à l’étape de conversion de ES en P :
v = k +2 [ ES] (5)
(4)
1

Si la concentration en substrat est largement supérieure à celle de l’enzyme et que l’on
se place dans la phase initiale de la réaction, il existe une phase, dite phase ou état
stationnaire, où la concentration de ES ne varie pas au cours du temps :
dES [ ]
= 0 (6)
dt
(N.B. : il ne faut pas confondre état stationnaire et état d’équilibre, ce dernier étant
caractérisé par une concentration constante de S et P.)
Durant la phase stationnaire, la vitesse d’apparition de ES est égale à sa vitesse de
disparition :
et
k +1
[ E] [ S]= k 1
+ k +2
[ E]= k 1
+ k +2
k +1
S
( )[ ES] (7)
( )[ ES]
[ ]
En combinant les relations (3) et (8), on obtient :
(
[ E 0 ]= k + k 1 +2) [ ES]
(
+ [ ES]= [ ES] 1+ k + k 1 +2)
= [ ES] k [ S +1 ]+ k + k
1 +2
(9)
k +1 [ S]
k +1 [ S]
k +1 [ S]
En tenant compte que si [S] 0 >> [E] 0 , la fraction de substrat consommée durant la phase
initiale de la réaction est négligeable et donc [S]=[S] 0 et en combinant les relations (5) et (9),
on obtient :
v = k E +2
k 1
+ k +2
k +1
[ ] 0
[ S] 0
(10)
+ [ S] 0
Notons que cette relation a la même forme que l’équation (4).
Aujourd’hui, les noms de Michaelis et Menten sont associés à une forme générale de
l’équation de vitesse qui utilise indifféremment l’hypothèse de l’état stationnaire ou
l’hypothèse de l’équilibre rapide. Si on définit la constante de Michaelis K m :
K m
= k 1 + k +2
k 1
(11)
et que l’on remarque que la vitesse maximale V max est atteinte lorsque toute l’enzyme est
complexée au substrat :
V max
= k +2 [ E] 0
(12)
on obtient la relation bien connue :
v = V max[ S] 0
K m
+ S
[ ] 0
(13)
(8)
2

Un graphique de v en fonction de [S] a la forme d’une hyperbole (Figure 1). En
déterminant la vitesse initiale en fonction de la concentration initiale en substrat, il est
possible de déterminer V max et K m par ajustement paramétrique non linéaire des données
expérimentales avec la relation (13). Cependant, pour des raisons essentiellement historiques,
l’équation de Michaelis et Menten est le plus souvent transformée de manière à générer des
graphiques linéaires (Lineweaver et Burk, Hanes, Eadie et Hofstee, Eisenthal et Cornish-
Bowden). Les logiciels permettant de réaliser des ajustements paramétriques non linéaires
sont nombreux (Igor, Kaleidagraph, Mathematica, Origin, Prism…)
Figure 1 : Dépendance de la vitesse initiale vis-à-vis de la concentration en substrat pour une
réaction obéissant à la relation (13).
Utilité et limitations de l’étude des cinétiques des réactions enzymatiques à l’état
stationnaire
En utilisant l’hypothèse de l’état stationnaire pour le(s) complexe(s) enzyme/substrat et
les lois de conservation des masses de l’enzyme et de chacun des substrats, il est possible de
dériver les équations reliant la vitesse initiale à la concentration en substrat(s) pour de
nombreux mécanismes réactionnels plus compliqués que celui décrit dans la relation (1).
Il y deux domaines où l’étude des cinétiques à l’état stationnaire s’est révélée très utile :
l’étude des réactions à deux substrats (ou plus) et l’étude des mécanismes d’inhibition des
réactions enzymatiques. Dans les réactions à deux substrats, la cinétique à l’état stationnaire
permet en général de déterminer l’ordre de fixation des substrats et celui de la libération des
3

produits. Elle permet ainsi de discriminer entre mécanisme séquentiel ordonné (Bi Bi
ordonné), mécanisme séquentiel aléatoire (Bi Bi aléatoire), mécanisme de Theorell-Chance
(où le second substrat réagit avec le premier complexe enzyme/substrat dans un processus
bimoléculaire) et mécanisme ping-pong (où le premier produit est libéré avant la fixation du
second substrat). Dans le cas de l’inhibition des réactions à un substrat, la cinétique à l’état
stationnaire permet de déterminer l’affinité relative de l’inhibiteur, I, pour E et pour ES. On
distingue ainsi l’inhibition compétitive (I ne se fixe qu’à E), l’inhibition anti-compétitive ou
incompétitive (I ne se fixe qu’à ES) et l’inhibition non compétitive (I a la même affinité pour
E et ES). Tous ces cas ne sont que des cas particuliers de l’inhibition mixte, où I à une affinité
non nulle et différente pour E et ES.
Au plan expérimental, la cinétique à l’état stationnaire présente de nombreux
avantages. Elle est économique : puisque l’on travaille en large excès de substrat(s) par
rapport à l’enzyme, la quantité d’enzyme requise est limitée (E 0 = 10 -10 à 10 -5 M,
généralement 10 -9 à 10 -6 ). Elle est simple : en jouant sur la concentration en enzyme et en
substrat, il est possible de mesurer v sur des domaines de temps allant de quelques minutes à
quelques heures et aucun appareillage sophistiqué n’est requis. Elle est adaptable: la
concentration du (des) substrat(s) ou du (des) produit(s) peut être déterminée par un très grand
nombre de techniques biochimiques ou biophysiques. La caractérisation d’une enzyme
commencera donc toujours par l’étude de la cinétique à l’état stationnaire, malgré ses
limitations.
Dans les cinétiques à l’état stationnaire, on ne suit généralement que la disparition du
substrat ou l’apparition du produit et on obtient généralement peu ou pas d’information sur
le(s) complexe(s) enzyme/substrats.
Considérons une réaction impliquant plusieurs étapes, par exemple :
E + S ES1 ES2 …
k1 k2
k n
k +1
k +2
k + n
ESn
k p
k + p
E + P (14)
où les complexes ES 1 , ES 2 , …ES n peuvent différer par la conformation de l’enzyme ou des
modifications covalentes de celle-ci. Dans le meilleur des cas, la vitesse globale de la
réaction à l’état stationnaire coïncide avec l’étape la plus lente et ne fournit en aucun cas
d’information sur les étapes les plus rapides. Ainsi, si l’étape la plus rapide est mille fois plus
rapide que l’étape la plus lente et qu’une mutation de l’enzyme la ralentit d’un facteur cent,
l’effet ne sera pas détectable en cinétique stationnaire. Pour comprendre le mécanisme d’une
réaction enzymatique, il est nécessaire d’obtenir des informations sur les étapes rapides autant
que sur les étapes lentes.
4

En cinétique, comme dans toutes les situations où l’on compare des données
expérimentales aux prédictions d’un modèle, il est possible de montrer qu’un modèle ne
décrit pas correctement la situation concrète, mais il est rigoureusement impossible de
démonter qu’un modèle est correct. En effet, même si un modèle permet un ajustement
satisfaisant des données expérimentales, il est possible de trouver un ou plusieurs autres
modèles qui permettront un ajustement tout aussi satisfaisant. Ce n’est qu’en obtenant un
maximum d’informations, en particulier sur la formation du (des) complexe(s)
enzyme/substrat, qu’il sera possible d’écarter certains mécanismes et d’en affiner d’autres.
Nous avons déjà vu que Victor Henri a montré que le mécanisme (1) :
k +1 k +2
E + S ES E + P (1)
k1
permettait de rendre compte de ses observations sur l’hydrolyse du saccharose par l’invertase.
Il a aussi montré que le mécanisme suivant, comprenant deux réactions parallèles :
k +1
E + S ES
k1
E + S k +1
'
E + P
explique tout aussi bien ses observations. Les mécanismes (1) et (15) ont en commun la
formation de ES. Cependant son rôle est entièrement différent. Dans le mécanisme (1), ES est
un complexe essentiel, à partir duquel P est produit par un processus monomoléculaire. Dans
le mécanisme (15), P est formé par un processus bimoléculaire et ES est essentiellement une
nuisance qui ralentit la formation de P. Ce n’est que la mise en évidence, par d’autres études,
du rôle essentiel de ES dans la formation de P qui ont permis d’éliminer le mécanisme (15).
En effet, les relations (2) et (3) restent valables pour ce mécanisme et si l’on étudie la
phase initiale de la réaction et que le substrat est en large excès par rapport à l’enzyme,
l’approximation [S]=[S] 0 est également valide. Pour le mécanisme (15), la vitesse initiale
d’apparition du produit est donnée par :
'
'
v = k +1
[E][S] k +1
[E][S] 0
(16)
En combinant les relations (2) et (3) et assimilant [S] à [S] 0 , on obtient :
et
[E] 0
= E
[ ] 1+ k +1
[ S] 0
k 1
v = k '
+1[E] 0
[S] 0
1+ k =
+1
[S] 0
k 1
(15)
(17)
k +1
'
k 1
k +1
[E] 0
[S] 0
k 1
k +1
+ [S] 0
(18)
5

Remarquons que cette relation exactement la même forme que la relation (10) et qu’elle
peut être réécrite sous la forme de l’équation de Michaelis et Menten (13), bien que dans ce
cas, V max et K m auront des définitions différentes. Il s’en suit que toutes les données
expérimentales pouvant être ajustées avec la relation (10) seront ajustées de manière
également satisfaisante avec la relation (18). En d’autres termes, la cinétique à l’état
stationnaire ne permet pas de discriminer les mécanismes enzymatiques (1) et (15).
L’étudiant est encouragé à démontrer que la vitesse initiale d’apparition de P suivant le
mécanisme :
E + S k +1
E'+P
(19)
E' k +2
E
où E’ est une forme inactive de l’enzyme qui est lentement reconvertie en enzyme active E, a
également la forme de l’équation de Michaelis et Menten.
Etat stationnaire et phases transitoires
Revenons au mécanisme enzymatique (1). Lorsque [S] 0 >> [E] 0 , l’approximation de
l’état stationnaire est valable pendant une bonne partie du temps que dure la réaction. Elle
n’est cependant pas respectée au tout début et en fin de la réaction (Figure 2).
Figure 2 : Variations de la concentration de S, P, E et ES au cours du temps pour une réaction
enzymatique répondant au mécanisme (1).
La phase pré-stationnaire
Au tout début de la réaction, [ES]=0 et la vitesse de d’apparition du produit est nulle. Il
existe donc une phase, dite pré-stationnaire, au cours de laquelle le complexe ES va se former
6

jusqu’à atteindre une concentration maximale qui restera approximativement constante
durant toute la phase stationnaire (Figure 2). Durant cette phase, la vitesse d’apparition de P
est plus petite que pendant la phase stationnaire. La formation de P n’atteindra une vitesse
constante, donnée par la relation (10) que lorsque [ES] aura atteint sa valeur maximale. Ainsi,
la formation de P est caractérisée par un délai (« lag ») (Figure 3).
Figure 3 : L’apparition du produit suivant le mécanisme (1) est caractérisé par un délai (lag)
au tout début de la réaction. La concentration réelle de produit est donnée par la courbe
continue. La pente de la partie linéaire de cette courbe correspond à la vitesse initiale mesurée
à l’état stationnaire.
Nous verrons dans le chapitre 3 que la détermination du délai en fonction de la
concentration en substrat, associée à l’étude de la vitesse initiale, permet de déterminer les
constantes k +1 , k -1 , et k +2 . Le délai est donc du même ordre de grandeur que ces constantes,
qui sont typiquement comprises entre 10 0 et 10 7 s -1 , et la détermination des cinétiques préstationnaires
requiert de mesurer l’apparition du produit (ou la disparition du substrat) dans
des temps allant du dixième de microseconde à la seconde. Les techniques permettant de
telles mesures seront décrites dans le chapitre 2. De plus, pour que la quantité de produit
formée lors de la phase initiale puisse être déterminée avec précision, les cinétiques à l’état
pré-stationnaires requièrent 100 à 1000 fois plus d’enzyme que les cinétiques à l’état
7

stationnaire : de 10 -7 à 10 -3 M (généralement de 10 -6 à 10 -4 M). Alors que le rapport [S] 0 /[E] 0
peut atteindre ou même dépasser 1000 pour la détermination des cinétiques à l’état
stationnaire, il dépasse rarement 10 pour les mesures à l’état pré-stationnaire.
Lorsque [S] 0 /[E] 0 > 1, chaque molécule d’enzyme réalise plusieurs cycles catalytiques
consécutifs avant que le substrat ne s’épuise (« multiple turnover »). Dans certaines situations,
il peut s’avérer plus simple et/ou avantageux de ne suivre qu’un seul acte catalytique (ou non
catalytique) (« single turnover »). Par exemple, dans les réactions impliquant deux substrats
S 1 et S 2 , en utilisant une concentration saturante d’enzyme par rapport au premier substrat (E 0
> S 1 0), on s’assure que [ES 1 ] 0 = S 1 0, ce qui permet de mesurer aisément le K m réel du second
substrat et le k cat réel de la réaction. Les ARN et ADN polymérases constituent une classe
importante d’enzymes à deux substrats : elles lient d’abord une matrice (ARN ou ADN), puis
un nucléotide (NTP ou dNTP). Un cas intéressant qui impose l’étude des cinétiques en
conditions de « single turnover » est celui du repliement spontané des macromolécules
biologiques (principalement celui des protéines et des ARN). Les méthodes utilisées pour
l’étude de la phase pré-stationnaire des réactions enzymatiques sont aussi utilisées pour
l’étude du repliement des macromolécules.
La phase post-stationnaire
Lors de l’étude des réactions enzymatiques en condition de cycles catalytiques
multiples, à la fin de la réaction, une quantité importante de substrat a été consommée et la
condition [S] >> [E] 0 n’est plus vérifiée. Lorsque [S] n’est plus largement supérieure à K m ,
[ES] diminue, de même que la vitesse de formation du produit. Cette phase, suivant l’état
stationnaire est appelée phase post-stationnaire (Figure 2). Les phases pré- et poststationnaires
sont généralement appelées phases transitoires. L’étude de la phase poststationnaire
est plus compliquée que l’étude de la phase pré-stationnaire et est peu utilisée
pour l’étude des mécanismes enzymatiques. Nous ne nous y intéresserons pas ici.
8

Chapitre 2 : Mesure des vitesses des réactions rapides
La mesure des vitesses des réactions rapides est essentielle pour l’étude des cinétiques
enzymatiques à l’état non-stationnaire et l’étude du repliement des macromolécules
biologiques. La gamme de temps de réaction rapide en solution et les méthodes développées
pour les étudier sont reprises dans la Figure 4.
Figure 4 : Gamme de temps des réactions rapides et des méthodes pour les observer.
Les méthodes de flux
Les méthodes de flux ont en commun le mélange rapide de l’enzyme et du substrat à
l’aide de seringues actionnées mécaniquement par un moteur ou de l’air comprimé qui
conduisent les réactifs par confluence forcée à l’entrée d’un tube d’écoulement ou
d’observation. La plus simple d’entre elles est la technique de flux continu. Tout comme la
technique de « stopped flow », elle est utilisable lorsque l’état d’avancement de la réaction
peut-être suivi par une méthode spectroscopique telle que l’absorbance, la fluorescence ou le
dichroïsme circulaire (CD). La technique de « quenched flow » est utilisée lorsque l’état
d’avancement de la réaction ne peut pas être détectée directement.
Principe de la technique de flux continu
La technique du flux continu est la première technique développée pour l’étude des
réactions rapides. Elle a été introduite en 1922 par H. Hartridge et F.J. W. Roughton pour
l’étude de la fixation de l’oxygène à l’hémoglobine. Son principe est décrit dans la Figure 5.
9

Figure 5 : Principe de la méthode de flux continu. En déplaçant le système de détection le
long du tube d’observation, il est possible d’étudier le mélange à des âges différents.
Dans un appareil à flux continu, après le mélange, le milieu réactionnel progresse à
l’intérieur d’un tube d’observation une vitesse constante v. Ainsi, le mélange atteint un point p
situé dans le tube d’observation à une distance d du point de mélange après un temps t donné
par la relation :
t = d v
(20)
Tant que v est constante, mesurer une propriété spectroscopique (absorbance, fluorescence,…)
le long du tube d’observation revient donc à mesurer cette propriété en fonction du temps.
Ainsi pour v = 10 m•s -1 , le mélange à 1 cm de la chambre de mélange est vieux de 1 ms. A un
point donné du tube d’observation, l’âge du milieu réactionnel et ses caractéristiques
spectroscopiques sont constantes. La technique de flux continu ne nécessite donc pas de
système de détection avec une réponse rapide, contrairement aux autres méthodes utilisant la
variation d’une caractéristique spectroscopique au cours du temps. Cependant, plus le temps
d’enregistrement des données sera court, plus petite sera la quantité de réactif utilisée.
En pratique, la vitesse minimale de la solution est imposée par l’efficacité de mélange
(voir ci-dessous). La vitesse du liquide doit être maintenue au dessus d’une valeur critique,
environ 2 m/s. Ainsi, il existe une limite supérieure du temps de réaction qui peut être étudié
par la technique de flux continu. Cette limite dépend de la longueur du tube d’observation,
mais la quantité de réactif nécessaire est directement proportionnelle à celle-ci. En pratique,
suivant les applications, des cellules d’observations de 1 cm à 1 m ont été utilisées.
La vitesse maximale utilisable en flux continu est supérieure à celle utilisable dans les
techniques de stopped flow et quenched flow car les problèmes de cavitation et de vibrations
parasites apparaissent d’abord lors de l’arrêt du flux. Des vitesses jusqu’à 100 m/s ont été
utilisées en flux continu, comparées à des vitesses maximales d’environ 10 m/s en stopped
flow et en quenched flow.
10

Deux paramètres cruciaux dans les techniques de flux : l’efficacité de mélange et le
temps mort
Idéalement, dans les techniques de flux, le mélange des réactifs devrait être instantané,
ce qui n’est évidemment pas possible. Un mélange rapide et homogène est obtenu lorsque le
flux est turbulent. Ce type de flux est obtenu lorsque la vitesse du liquide est maintenue au
dessus d’une valeur critique, environ 2 m/s. En dessous de cette valeur, le flux devient
laminaire : le liquide au centre du tube se déplace plus vite que celui à proximité de la paroi.
Ainsi, dans les appareils à flux continu, et certains appareils de stopped flow et de quenched
flow, il existe une limite supérieure du temps de réaction qui peut être étudié.
Indépendamment de l’efficacité de mélange, il existe dans toutes les techniques de flux
un temps mort, pendant lequel la réaction ne peut pas être observée (Figure 6).
Figure 6 : Schéma du mélange et du système de détection d’un appareil à flux continu ou de
« stopped-flow » et effet de la largeur de la fente d’observation.
M, O, et L, correspondent respectivement au centre de la cellule de mélange, au point
où le mélange est effectivement complet et au milieu de la fenêtre, ou fente d’observation. La
fente de largueur l est délimitée par ses deux bords L 1 et L 2 situés respectivement à une
distance l 1 et l 2 du point O. Le temps nécessaire au mélange progressant à vitesse constante v
pour atteindre les points L 1 et L 2 est t 1 et t 2 , respectivement. Le temps nécessaire au mélange
11

pour traverser la fenêtre est t pass et le temps mort, t d , est le temps nécessaire pour atteindre le
milieu de la fenêtre d’observation depuis le point O.
Ce qui se passe durant le temps mort ne peut être étudié, et seule la partie de la réaction
suivant t d peut-être étudiée explicitement. Dès lors, la fraction observable de la courbe
réactionnelle dépend de la relation entre la vitesse de réaction et le temps mort. Supposons
que l’on observe une réaction de premier ordre dont la constante de vitesse est k. L’amplitude
du changement (d’absorbance, de fluorescence…) A obs qui peut être observée en commençant
l’observation au temps t = t d est inférieure à l’amplitude réelle (totale) A tot . Le rapport entre
ces deux valeurs est donné par la relation :
ln A tot
A obs
= k t d
(21)
et puisque le temps de demi-vie de la réaction, t 1/2 , est donné par :
t 1/2
= ln2
k
la fraction observable de la réaction, f obs , est donnée par :
ln f obs
= ln A obs
A tot
et donc :
(22)
= k t d
= ln2
t 1/2
t d
(23)
f obs
= 0,5 t d / t 1/2 (24)
Figure 7 : Fraction de la réaction observable en fonction du rapport t d /t 1/2 .
La figure 7 montre que f obs décroît rapidement lorsque le rapport t d /t 1/2 augmente. Ainsi,
si l’on étudie une réaction dont la demi-vie est 1 ms avec un appareil dont le temps mort est
12

de 5 ms, on ne peut observer que 3 % de la réaction. Cependant, 25 et 50 % de la réaction
peuvent être détectés si l’on parvient à abaisser le temps mort de l’appareil à respectivement 2
et 1 ms. Dès lors, diminuer le temps mort est extrêmement important pour améliorer la
performance d’un appareil à flux continu ou d’un appareil de stopped-flow. Il est possible de
diminuer le temps mort en augmentant la vitesse du flux et en diminuant la largeur de la fente
d’observation, ce qui permet de raccourcir la distance l 2 et donc la distance entre les points O
et L (Fig. 6). Cependant, une large fente permet d’augmenter le rapport signal/bruit et il existe
donc une largeur de fente optimale pour obtenir un rapport signal/bruit maximal avec un
temps mort donné, qui dépend de la vitesse de la réaction étudiée.
Un autre problème apparaît du fait que l’âge du mélange n’est pas le même aux temps t 1
et t 2 et la concentration des réactifs et des produits a une distribution non linéaire le long du
flux dans la cellule d’observation. Il est possible de démontrer que dans le cas d’une réaction
de premier ordre, la largeur de la fente n’a pas d’effet sur la détermination de la constante de
vitesse, bien qu’elle décale la courbe expérimentale. Dans le cas d’une réaction de second
ordre, la constante de vitesse apparente augmente avec la largeur de la fente et il existe une
procédure pour corriger cet effet.
Expérimentalement, on détermine le temps mort d’un appareil en analysant des
réactions très rapides donnant un signal facilement détectable, comme la neutralisation d’une
solution alcaline de p-nitrophénol avec un acide, qui est complète en moins de 0,1 ms, ou la
dilution d’une solution colorée (par exemple une solution à 0,003 % de K 3 Fe(CN) 6 ) avec de
l’eau ou un tampon incolore. La constante de vitesse apparente déterminée pour ces réactions
correspond en général à l’inverse du temps mort. Le temps mort déterminé expérimentalement
tient donc compte du temps mort théorique dont nous avons parlé ci-dessus et de l’efficacité
de mélange des réactifs.
Quelques appareils de flux continu
Les appareils à flux continu ont été longtemps délaissés à cause de la quantité de réactif
(d’enzyme) nécessaire et il n’existe pas d’appareil commerciaux de ce type. Cependant, des
appareils expérimentaux très performants ont été développés. Nous en décrirons brièvement
quelques-uns afin de montrer de quelles manières les principaux obstacles ont été surmontés.
Le temps mort de la plupart des appareils à flux continu et de stopped-flow est
généralement d’environ 1 ms. Pour diminuer ce temps mort, il faudrait diminuer la taille des
tubes et accroître la vitesse du flux, ce qui nécessite des très hautes pressions, difficiles à
atteindre dans la pratique. Cependant, le groupe de Thomas Jovin, en Allemagne, s’est rendu
13

compte que le temps mort peut être significativement diminué en apportant plusieurs
innovations (Fig. 8).
Figure 8 : Schéma de l’appareil à flux continu ultra-rapide développé par l’équipe de Thomas
Jovin.
Afin de réduire la résistance du flux, des tuyaux relativement larges amènent les réactifs
à la chambre de mélange. Avant d’arriver à cette chambre, les deux liquides se rejoignent
tangentiellement sans se mélanger (flux laminaire). La chambre de mélange consiste en une
pointe dans laquelle est placée une sphère dont la taille peut être réduite à quelques dizaines
de micromètres. Un mélange efficace est obtenu en quelques s en projetant le liquide sur la
sphère. Afin de minimiser la pression, le tube d’observation a été supprimé : le mélange forme
un jet dans l’air qui est stable sur quelques centimètres. Des flux de 10 à 100 m/s et des temps
morts de 100 à 10 s ont été obtenus avec cet appareil. La longueur du jet limite l’étude à des
temps de réaction allant de quelques s à quelques ms.
Le second appareil, schématiquement représenté dans la Figure 9, a été développé par
Roder et collaborateurs. Comme dans l’appareil précédent, un mélange ultrarapide (environ
15 s) est obtenu par projection des réactifs sur une petite bille de platine. Le tube
d’observation a été conservé, ce qui augmente le temps mort, mais augmente la stabilité
optique du système par rapport à l’appareil précédent. Le temps mort a été minimisé (45-50
s) en réduisant au maximum le volume de la chambre de mélange et de la cellule
d’observation. L’originalité de cet appareil réside dans son système de détection. Le classique
photomultiplicateur a été remplacé par un détecteur CCD (charge-coupled device)
multicanaux. En illuminant la totalité du tube d’observation, le signal de fluorescence ou
d’absorbance est collecté simultanément sur toute la longueur par le détecteur CCD qui
décompose le signal en 1035 points correspondant à des temps de réaction différents. Il n’est
plus besoin de déplacer le détecteur et une courbe réactionnelle complète est enregistrée en
14

quelques s à quelques ms (suivant l’intensité du signal). Ce système permet donc de réduire
considérablement la quantité de matériel nécessaire pour déterminer la cinétique d’une
réaction et ainsi de faire disparaître un des principaux inconvénients des appareils à flux
continu.
Figure 9 : Schéma de l’appareil à flux continu ultra-rapide développé par Roder et
collaborateurs.
Les deux appareils que nous avons présentés ici ont été utilisés pour l’étude du
repliement des protéines, qui est généralement un processus très rapide, qui ne peut pas être
étudié par les appareils classiques de stopped-flow.
Principe du « stopped-flow »
Le principal défaut de la méthode de flux continu, dans la plupart des dispositifs
expérimentaux, réside dans la quantité de réactifs requise (plus de 6 litre de solution
d’hémoglobine pour une mesure dans le premier appareil décrit par H. Hartridge et F.J. W.
Roughton). Pour palier à ce problème, F.J.W. Roughton a introduit la méthode de « stopped
flow » en 1934, qui a été largement améliorée par B. Chance en 1940. Le principe en est
décrit dans la figure 10.
Les deux seringues contenant les réactifs sont brièvement comprimées pour expulser
une quantité limitée de liquide (50 à 200 l), puis elles sont mécaniquement stoppées.
Supposons que la cellule d’observation soit située à un cm de la chambre de mélange. Si la
15

vitesse du flux durant la compression est de 10 m/s, durant cette phase de flux continu, le
détecteur voit un mélange vieux de 1 ms. Lorsque le flux est arrêté, le détecteur suit
directement le vieillissement du mélange dans la cellule de détection.
Figure 10 : Principe du « stopped flow ». Les deux méthodes alternatives d’arrêt sont
représentées sur ce schéma : par arrêt des pistons sur une butée (en rouge) ou par une seringue
d’arrêt (en vert). Le système de détection schématisé permet de mesurer des variations
d’absorbance.
Un appareil de stopped-flow comprend donc trois fonctions principales. 1) Mélanger
rapidement deux réactifs pour démarrer la réaction. 2) Arrêter le flux rapidement. 3) Détecter
et enregistrer la variation d’un paramètre physique (absorbance, fluorescence, …) tandis que
la réaction se poursuit dans la cellule d’observation.
Les problèmes liés à l’efficacité de mélange et au temps mort des appareils sont les
mêmes que dans la technique de flux continu. La nécessité d’un arrêt rapide est propre au
stopped flow. Deux méthodes d’arrêt ont été utilisées. La solution techniquement la plus
simple consiste à installer une butée qui arrête le mouvement du bloc auquel sont fixés les
pistons des seringues contenant les réactifs (Fig. 10). De nos jours, cette solution est peu
repandue car elle a tendance à créer des phénomènes de cavitation : l’arrêt brutal des
seringues provoque une diminution de pression dans la chambre d’observation et les gaz
dissous se vaporisent en formant de petites bulles. La solution alternative consiste à arrêter le
flux à l’arrière de la cellule d’observation. Le mélange remplit une seringue d’arrêt dont le
piston va frapper un butoir (Fig. 10). Celui-ci est généralement équipé d’un déclencheur relié
à un ordinateur qui démarre l’acquisition du signal. Une valve permet de vider la seringue
d’arrêt entre chaque mesure. De même, les seringues qui injectent les réactifs sont reliées par
des valves à des seringues de grande contenance qui permettent de remplir rapidement les
seringues d’injection (Fig. 10).
16

Contrairement au flux continu, le stopped-flow requiert un système de détection rapide
capable de suivre les variations de signal en direct. A l’époque où la technique a été
développée, suivre les variations de signal dans le domaine de la ms (voire moins) était une
prouesse fastidieuse. Les variations de tension à la sortie d’un photomultiplicateur (ou tout
autre appareil de mesure) étaient enregistrées à l’aide d’un oscilloscope à mémoire dont
l’écran était photographié et la trace du signal était analysée manuellement. De nos jours les
micro-ordinateurs sont capables d’enregistrer les variations de signal dans le domaine de la
ms en temps réel, et l’utilisation d’un oscilloscope à mémoire n’est plus nécessaire.
Quelques appareils de stopped-flow
Contrairement aux appareils à flux continu, les appareils de stopped-flow se sont
démocratisés et sont devenus relativement courants dans les laboratoires. Plusieurs appareils
commerciaux existent. Ils se répartissent en deux classes.
Les premiers sont des accessoires ne comportant que le système de mélange rapide qui
s’adaptent sur des spectrophotomètres UV-visible ou des fluorimètres classiques. Deux
exemples d’appareils commerciaux de ce type sont montrés dans la figure 11.
Figure 11 : Deux accessoires de stopped flow. A gauche le RX2000 d’Applied Photophysics,
à droite le SFA20 de Hi-Tech. Dans les deux cas, les pistons sont actionnés par un sytème
pneumatique (non montré). Les trois seringues verticales sont les réservoirs de réactifs et la
« poubelle ».
L’avantage de ces accessoires est leur faible coût. Leurs performances sont correctes
sans atteindre celles des appareils dédiés. L’utilisation d’un spectrophotomètre ou d’un
17

spectrofluorimètre classique impose une variation de signal relativement importante. D’autre
part, la cellule de mesure est reliée à la chambre de mélange par des tuyaux relativement
longs, de manière à pouvoir l’insérer dans le spectromètre, ce qui occasionne des volumes
morts (perte de réactifs) et donc des temps morts relativement importants. Enfin, comme dans
tous les systèmes utilisant un seul moteur (ou système pneumatique) pour injecter les réactifs,
le rapport des volumes des différents réactifs ne peut être modifié qu’en utilisant des
seringues de volumes différents. Typiquement, ces accessoires de stopped flow ont un temps
mort minimum de 8 à 10 ms. Le volume d’amorçage de chaque réactif est de 260 l à 1 ml et
100 à 200 l de chaque réactif sont consommés à chaque mélange.
Plusieurs appareils commerciaux dédiés au stopped flow sont également disponibles :
les principaux fournisseurs sont Applied Photophysics, BioLogic et HighTec. Un exemple
d’instrument est présenté dans la figure 12.
Figure 12 : Deux vues du SX20 d’Applied Photophysics. L’appareil présenté est pourvu d’une
option permettant un mélange séquentiel (voir plus loin) et d’un système de détection de
l’absorbance.
Cette figure permet de distinguer les composants principaux de ce type d’instruments.
On distingue, de droite à gauche, l’alimentation de la lampe au xénon, la lampe (module noir),
un monochromateur, le module de mélange proprement dit à l’arrière duquel on aperçoit le
photomultiplicateur (sur la vue de droite), le module de gestion électronique (sous l’écran
dans la vue de gauche) et le microordinateur. Avec une cellule optique de 20 l dont les
trajets optiques sont de 2 et 10 mm (au choix), le temps mort est de 1,1 ms et le volume de
chacun des réactifs est de 40 l par injection. Une cellule de 5 l avec des trajets optiques de
1 et 5 mm permet de réduire le temps mort à 0,5 ms.
Comment mesurer précisément de faibles variations de signal ?
Dans les expériences de stopped-flow, ainsi que dans plusieurs techniques décrites plus
loin, les réactions étudiées s’accompagnent parfois de très faibles variations de signal (moins
18

de 0,01, voire moins de 0,001 unité d’absorbance ou moins de 1% de variation de la
fluorescence). Plusieurs principes permettent de mesurer précisément les vitesses de réactions
lorsque la variation de signal est faible.
Le premier consiste à amplifier la variation de signal plutôt que le signal lui-même en
appliquant une tension de compensation qui annule le signal au temps t = 0 ou t = (Figure
13). Ce principe permet d’amplifier une faible variation de signal sur une grande échelle.
Cette soustraction analogique de la ligne de base est plus précise que la soustraction digitale
de deux signaux de grande amplitude dont les valeurs sont presque identiques. Cette
technique permet d’utiliser des convertisseurs analogique/digital plus rapides et moins
coûteux. Dans le cas du stopped-flow, les mesures sont reproduites plusieurs fois d’affilée.
Ainsi, avant une injection, la cellule de mesure est remplie avec le mélange en fin de réaction
(t ) de l’expérience précédente. La tension de sortie du photomultiplicateur (ou de la
diode) correspondant à ce signal peut-être compensée par une tension d’amplitude égale mais
de signe contraire.
Figure 13 : Principe de la soustraction analogique de la ligne de base.
L’amplification d’une faible variation de signal résulte en un faible rapport signal/bruit.
Le rapport signal/bruit peut être accru en accumulant et en moyennant les données. Le rapport
signal/sur bruit augmente proportionnellement à la racine carrée du nombre d’accumulations.
Un exemple réel est donné dans la Figure 14. Une simulation montrant l’effet de
l’accumulation des données sur la détermination des paramètres cinétiques est présentée dans
la Figure 15.
19

Figure 14 : Effet de l’accumulation des mesures sur l’augmentation du rapport signal/bruit. La
réaction étudiée par stopped flow est la réduction du 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP ; 2
M) par l’acide ascorbique à pH 4,2 à 20 °C. La variation d’absorbance est mesurée à 524 nm
sous un trajet optique de 2 mm. Les chiffres au-dessus des courbes correspondent au nombre
d’accumulations.
Figure 15 : Effet de l’accumulation des données sur la détermination des constantes
cinétiques. Un, 10, ou 52 jeux de données (comprenant 150 points chacun) ont été générés à
partir de l’équation A = e kt avec k = 10 s -1 avec une distribution gaussienne des erreurs
correspondant à un écart-type de 0,5. Les jeux de données ont été moyennés et ajustés avec la
même équation. Les courbes obtenues par ajustement de 10 et 52 jeux de données se
superposent presque totalement à la courbe théorique (en magenta). Les valeurs de la
20

constante de vitesse (±SD) obtenues par ajustement de 1, 10, et 52 jeux de données sont
respectivement de 7,07 ± 2, 56, 9,15 ± 1,21 et 9,95 ± 0,54 s -1 .
Lorsqu’il n’est pas possible d’accumuler plusieurs jeux de données, mais qu’une courbe
comprend de nombreux points expérimentaux, il est possible d’augmenter le rapport
signal/bruit en lissant la courbe. Le lissage ne modifie pas (sensiblement) la valeur des
paramètres déterminés par ajustement des données avec une équation théorique, mais permet
de réduire l’incertitude sur ces valeurs.
Principe du quenched-flow
Dans certains cas, les réactions enzymatiques ne s’accompagnent pas d’une variation de
signal optique exploitable. Souvent, au contraire, les différentes étapes d’une réaction
enzymatique donnent lieu à des variations complexes d’absorbance ou de fluorescence et
plusieurs phases avec des constantes de vitesse se superposent. Dans ce cas, il est utile de
pouvoir mesurer directement la vitesse d’apparition d’un produit, même si celui-ci n’absorbe
ou ne fluoresce pas. Par exemple, dans les réactions d’aminoacylation des ARNt par les
synthétases il est utile de déterminer la fraction d’ATP hydrolysé ou la fraction d’ARNt
chargé au cours du temps ; dans les réactions de polymérisation d’ADN, il est souvent
nécessaire de déterminer la fraction d’amorce allongée d’un ou plusieurs nucléotide(s) au
cours du temps. La technique de quenched-flow consiste à mélanger rapidement les réactifs et
après un temps de réaction variable, à mélanger rapidement le milieu réactionnel avec une
solution d’arrêt. Celle-ci peut être un acide ou une base qui dénature l’enzyme (il faut dans ce
cas s’assurer que la dénaturation ne s’accompagne pas d’une précipitation), un chélateur qui
lie un cofacteur métallique essentiel de l’enzyme, etc… Les produits sont récupérés et
peuvent être analysés par diverses techniques : comptage de la radioactivité acido-insoluble,
électrophorèse sur gel de polyacrylamide, etc…
Le plus simple des appareils de quenched-flow comprend donc en principe trois
seringues et deux chambres de mélange (Fig . 16). L’enzyme et le substrat sont mélangés dans
une première chambre de mélange et le milieu réactionnel est envoyé dans un tube de
vieillissement puis est mélangé à la solution d’arrêt dans la seconde chambre de mélange
avant d’être éjecté.
21

Figure 16 : Représentation schématique d’un appareil de quenched-flow.
Contrairement au stopped-flow, dans une expérience de quenched-flow, chaque
injection ne génère (en général) qu’un seul point expérimental correspondant à un temps de
réaction donné. Celui-ci est déterminé par l’intervalle de temps entre les deux mélanges et
peut être contrôlé en ajustant la longueur du tuyau connectant les deux chambres de mélanges
et/ou la vitesse du flux. Le temps de réaction t est fonction du volume de la ligne de
vieillissement (ou ligne de délai) V d et de la vitesse du flux v exprimée en volume par unité de
temps :
t = V d
(25)
v
et la vitesse du flux est donnée par V R , le volume de réactifs (enzyme plus substrat) utilisé
pour une injection et T i , le temps de poussée sur les pistons, c’est à dire la durée d’une
injection, par :
v = V R
T i
(26)
d’où :
t = V d T i
V R
(27)
22

Des temps de réaction de 2 à 150 ms peuvent être obtenus avec le type d’appareil
schématisé dans la Fig. 16. Ce design ne permet cependant pas d’atteindre des temps de
réaction supérieurs à environ 200 ms car il est nécessaire de maintenir la vitesse du flux à une
valeur suffisante pour obtenir un mélange efficace (flux turbulent) et la ligne de délai ne peut
pas être allongée indéfiniment (Typiquement, un tuyau de 40 cm de long contenant 200 l de
réactifs permet d’obtenir un temps de réaction de l’ordre de 100 ms). De plus, ce design
gaspille un volume considérable d’échantillon souvent précieux, en utilisant l’enzyme et le
substrat pour pousser les réactifs dans et hors de la ligne délai. A la fin de chaque injection, la
ligne de délai est remplie de réactifs qu’il faut éliminer avant l’injection suivante. Des
appareils plus économes et permettant d’atteindre des temps de réaction plus longs ont été
conçus. Trois d’entre eux sont décrits ci-dessous.
Quelques appareils de quenched-flow
Dans l’appareil commercialisé par Kintek (Fig. 17), les trois seringues sont poussées par
un moteur pas à pas unique contrôlé par ordinateur. L’enzyme et le substrat (15 à 40 l) sont
chargés dans des boucles d’une contenance maximale de 40 l. Des valves à trois voies sont
alors utilisées pour connecter ces boucles aux seringues contenant du tampon. C’est donc du
tampon qui pousse les réactifs dans la chambre de mélange, puis dans la boucle de
vieillissement lorsque le moteur est actionné. Une valve à huit voies permet de sélectionner
parmi huit boucles de vieillissement de longueur variable, ce qui permet de couvrir une
gamme de temps de réaction allant de 2 à 100 ms. Des temps de réaction beaucoup plus longs
peuvent être obtenus en mode « push-pause-push ». Une première poussée conduit les réactifs
dans la boucle de vieillissement, puis le moteur s’arrête pendant un temps programmé par
l’utilisateur avant une deuxième poussée qui mélange le milieu réactionnel avec la solution
d’arrêt.
23

Figure 16 : L’appareil RQF-3 de Kintek.
L’appareil QFM-400 développé par BioLogic possède quatre seringues pilotées chacune
par un moteur pas à pas indépendant (Fig. 17). Cette particularité permet d’injecter des
volumes différents d’enzyme et de substrat et offre davantage de souplesse.
Figure 17 : Le QFM-400 de BioLogic.
Lorsque les échantillons sont précieux, ils sont introduits directement par les valves V1
et V2 dans les boucles L1 et L2 et les seringues S1 et S2 sont remplies avec du tampon. La
seringue S3 contient du tampon et est utilisée pour rincer les circuits. Elle peut aussi être
utilisée pour pousser le mélanger réactionnel hors de la ligne de délai (LD) lorsque l’enzyme
et le substrat sont contenus dans les seringues S1 et S2. La solution d’arrêt est contenue dans
la seringue S4. Le volume d’amorçage est 23 l et le volume minimum de réactif par injection
est de 15 l. Des temps de réaction de 2 ms à plusieurs secondes peuvent être mesurés.
24

Il est à noter qu’il existe aussi des équipements commerciaux pouvant fonctionner en
quenched-flow ou en stopped-flow qui possèdent trois chambres de mélange (Fig. 18). Les
réactifs contenus dans les seringues S1 et S2 sont mélangés en premier et après un temps
programmable par l’utilisateur, le troisième réactif est ajouté. Après un second délai
programmable, le quatrième réactif, généralement la solution d’arrêt dans le cas d’une
expérience de stopped-flow, est à son tour mélangé au milieu réactionnel.
Figure 18 : Le SFM-400 de BioLogic.
La photolyse induite par un flash
Les techniques de flux ont une résolution temporelle limitée par la nécessité de
mélanger les réactifs. La seule possibilité pour étudier des réactions extrêmement rapides est
de contourner le problème du mélange. Une possibilité est d’initier la réaction par une
impulsion lumineuse (produite par un laser). Cette technique a été introduite en 1959 par Q.
H. Gibson pour étudier la dissociation du monoxyde de carbone (CO) de la carbomonoxyhémoglobine
et de la carbomonoxy-myoglobin et de leur réassociation avec le CO et d’autres
ligands. L’amélioration de la technique par l’introduction de lasers à permis d’étudier des
vitesses de dissociation dans le domaine de la femtoseconde et des vitesses de réassociation
dans le domaine de la picoseconde.
La technique de « flash photolysis » proprement dite est applicable lorsque l’on dispose
d’un précurseur photo-activable de l’un des réactifs. Dans ce cas, les réactifs sont prémélangés
et la réaction est initiée par l’impulsion laser. Cette technique est applicable aux
réactions initiées par l’ATP ou le GTP. En effet, il existe des précurseurs de l’ATP et du GTP
(appelés « caged ATP/GTP ») qui se décomposent en quelques ns sous l’action d’un flash à
347 nm (Fig. 19).
25

NH 2
N
N
CH 3
HC
O
NO 2
N
O
O
O
N
h
P O P -O P O
O
O - O -
O -
H H
H
H
OH OH
ATP + COCH 3
NO 2
Figure 19 : Réaction de décomposition du 1-(2-nitrophenyl)ethyl-P 3 -ester d’ATP par la
lumière.
Les techniques de relaxation
Les techniques dites « de relaxation » constituent une façon radicalement différente de
contourner le problème du mélange. Dans les techniques précédentes, les concentrations
initiales des réactifs et des produits sont très différentes des concentrations atteintes à
l’équilibre, à la fin de la réaction. Les techniques de relaxation ont été développées par
Manfred Eigen et ses collaborateurs à partir de la fin des années 1950. Ces travaux lui ont
valu le prix Nobel de Chimie en 1967. Le principe des méthodes de relaxation est basé sur le
fait qu’un équilibre physico-chimique dépend de paramètres extérieurs comme la température,
la pression, ou l’intensité du champ électrique. Ainsi, la variation de la constante d’équilibre
K d’une réaction en fonction de la température dépend de la variation d’enthalpie libre
standard (H 0 ) :
lnK
= H 0
T
P RT (28)
2
sa variation en fonction de la pression dépend de la variation de volume standard (V 0 )
lnK
= V 0
(29)
P
T RT
et sa variation en fonction du champ électrique E dépend de la variation standard du moment
électrique macroscopique M 0 (M 0 représente la variation du nombre de charges des réactifs
et des produits due à la réaction ; elle est parfois appelée le moment électrique de la réaction
ou la polarisation molaire) :
lnK
= M 0
E RT
T ,P
(30)
26

Lorsqu’une perturbation rapide d’un paramètre externe est appliquée à un mélange
réactionnel à l’équilibre, celui-ci va répondre à la perturbation en ajustant la concentration de
chacun des réactants de manière à satisfaire la nouvelle constante d’équilibre. On dit qu’après
la perturbation, le système se « relaxe ». En analysant la réponse du système à la perturbation,
la vitesse de la réaction en question peut être déterminée. Le temps de relaxation () est
l’inverse de la constante de relaxation du système. En général, la relaxation est monoexponentielle,
même dans le cas de réactions complexes : la détermination des constantes
cinétiques de chaque étape à partir des temps de relaxation sera abordée dans le chapitre
suivant. Les méthodes de relaxation ne sont donc applicables qu’aux réactions réversibles,
dont les constantes d’équilibre sont dans une gamme appropriée (voir ci-dessous). La limite
des constantes de vitesse mesurables par les techniques de relaxation est déterminée par la
vitesse à laquelle la perturbation peut-être appliquée au système : de ce point de vue, les
méthodes de relaxation sont très supérieures aux méthodes de flux (Fig. 4).
Deux modes de perturbation
Les techniques de relaxation peuvent être divisées en deux groupes principaux, selon le
mode de perturbation employé : perturbation périodique ou transitoire. Un exemple de
technique utilisant une perturbation périodique est la méthode ultrasonique, dans laquelle des
sons d’une fréquence pouvant varier de moins d’un kHz à plus d’un GHz sont appliqués à
l’échantillon. Si la fréquence de la perturbation () est suffisamment inférieure à la constante
de vitesse de relaxation (1/), le système peut se réajuster rapidement, et les changements de
concentration des réactants suivront la perturbation (Fig. 20). Si au contraire, la fréquence de
la perturbation est beaucoup plus élevée que pour que la vitesse de relaxation, aucun
changement de concentration ne pourra être observé. Lorsque la fréquence de la perturbation
est du même ordre de grandeur que la constante de vitesse de relaxation, les variations de
concentrations sont déphasées (décalées) et leur amplitude est réduite (Fig. 20). La différence
de phase est une mesure de la vitesse de la réaction chimique. L’atténuation de l’amplitude
représente l’énergie de dissipation. Elle peut être mesurée et est reliée à la différence de phase
par une transformée de Fourrier. Dans la méthode ultrasonique, il est possible de déterminer
en mesurant la vitesse du son en fonction de la fréquence ou l’énergie absorbée en fonction de
la fréquence. La technique ultrasonique est très utile dans l’étude du repliement des protéines :
elle permet d’étudier des phénomènes se produisant en des temps de 0,1 ns à plusieurs ms.
27

Figure 20 : Relaxation causée par une perturbation périodique. La courbe pointillée la
variation périodique d’un paramètre extrinsèque (pression, champ électrique, intensité des
ultrasons) et les courbes solides représentent la variation périodique de la concentration des
réactants. est la fréquence de la perturbation et le temps de relaxation.
La manière la plus simple de perturber un système à l’équilibre est d’appliquer une
perturbation transitoire, aussi rapide que possible. Cette technique est utilisée pour des sauts
de température (T-jump), de pression ou de champ électrique. Après la perturbation, un
paramètre physicochimique (absorbance, fluorescence) directement proportionnel à la
concentration d’un réactant est enregistrée en continu tandis que le système s’approche du
nouvel équilibre (Fig. 21).
Figure 21 : Relaxation d’un système à l’équilibre sous l’effet d’une perturbation transitoire.
En pointillés la perturbation transitoire, en trait plein la relaxation du système.
La courbe de relaxation suit l’équation :
c = c 0
e t / (31)
28

où c 0 et c sont les variations de concentration au temps 0 et t, respectivement, et
représente le temps de relaxation.
La limite des temps de relaxation observables par ces techniques est déterminée par la
vitesse du saut et peut atteindre 10 -9 à 10 -6 s pour le saut de température, 10 -7 à 10 -4 s pour le
saut de pression et 10 -8 à 10 -6 s pour le saut de champ électrique.
Comme la majorité des réactions ont un H 0 non nul, la méthode du saut de température
est la plus générale et les appareils de T-jump sont relativement simples. Nous nous
concentrerons par la suite sur cette technique.
La technique du saut de température
Les facteurs gouvernant l’applicabilité de la technique du saut de température sont les
suivants : 1°) les facteurs inhérents à la réaction étudiées, à savoir 1a) la magnitude du
changement de propriété optique accompagnant la réaction, 1b) la variation d’enthalpie
standard H 0 et 1c) la constante d’équilibre K de la réaction, et 2°) les facteurs liés aux
performances de l’appareillage, comme 2a) l’amplitude du saut de température T et 2b) sa
vitesse. D’un manière générale, les réactions générant une variation de 0,001 à 0,01 unités
d’absorbance pour un saut de température de 3 à 6°C et ont des demi-vies allant de la
microseconde à la seconde peuvent être étudiées par la technique du saut de température.
Lorsque le saut de température est suffisamment petit, l’équation (28) se réduit à :
K
K H 0
T (32)
RT 2
et donc la variation relative de la constante d’équilibre est proportionnelle au saut de
température, le coefficient de proportionnalité étant (H 0 /RT 2 ).
Si l’on considère un équilibre unimoléculaire :
A B (33)
dont la constante d’équilibre est définie par :
K = A
B
[ ]
[ ] = A 0
=
(1 )A 0
1
on obtient en différentiant l’équation (34) :
K
K =
(35)
(1 )
La variation de concentration [A] résultant d’un saut de température T est donnée par :
[ A ]= (A ) = A = A (1 ) K
0 0 0 K
= A K
0 K (36)
(34)
29

avec
= (1) (37)
La variation de concentration, et donc la sensibilité de la technique, est maximale lorsque
est maximal, c’est-à-dire lorsque =0,5 et K=1. En pratique, les variations de concentration
deviennent extrêmement faibles lorsque K>100 ou K

température est RC/2 (en s). Si on définit , comme le temps requis pour atteindre 90 % du T
final, on a :
=1,15RC (en s) (42)
Le saut de température sera donc d’autant plus rapide que la résistance de la solution
est faible, c’est-à-dire que la concentration en sels (généralement KNO 3 ou KClO 4 ) est forte.
Cependant, beaucoup d’enzymes sont inhibées à forte concentration saline : par exemple, la
plupart des ADN polymérases sont totalement inhibées par 300 mM de sels monovalent. Il
existe aussi un compromis à trouver entre l’amplitude du saut de température (proportionnel à
C) et sa durée. Typiquement, les valeurs de sont comprises entre 1 et 10 s. Par la suite,
nous établirons des équations permettant d’analyser les signaux de T-jump en supposant que
le saut de température est nettement plus rapide que la réaction étudiée. Mais il est possible
d’établir des équations analogues dans le cas où l’augmentation de température et la réaction
d’intérêt se produisent à des vitesses similaires, en tenant compte de la relation (41).
Figure 22 : Schéma d’un appareillage de saut de température utilisant un condensateur et de sa
cellule.
La durée du saut de température est la caractéristique principale des appareils de t-Jump,
comparable au temps mort du « stopped-flow ». Il est possible d’obtenir des sauts de
température de 10°C en moins de 100 ns (typiquement de 10 à 100 ns) en replaçant le
condensateur par un câble co-axial (constitué de deux cylindres métalliques séparés par un
diélectrique). Contrairement à un condensateur, un câble co-axial possède des propriétés
d’inductance, en plus de sa capacitance. (L'inductance d’un circuit électrique est un
coefficient qui traduit le fait qu’un courant le traversant crée un champ magnétique à travers
31

la section entourée par ce circuit. Il en résulte un flux du champ magnétique à travers la
section limitée par ce circuit.). Son énergie peut être transférée à la solution sous la forme
d’une impulsion rectangulaire.
L’utilisation d’une décharge électrique pour provoquer le saut de température impose
des restrictions sur la composition des tampons, ce qui a conduit au développement d’autres
techniques. Un saut de température de quelques degrés peut être obtenu en 100 ns par des
impulsions de micro-ondes.
Le saut de température peut aussi être obtenu en utilisant des lasers de forte puissance. Il
existe deux approches. La première consiste à utiliser des lasers infrarouges dont les
radiations sont absorbées par l’eau. Pour obtenir un échauffement homogène tout le long du
trajet optique, il faut se placer à une longueur d’onde où l’eau n’absorbe d’une petite fraction
des photons. Il est possible d’utiliser un laser avec une longueur d’onde comprise entre 1,5 et
2 m (pour un trajet optique de 50 m). Des impulsions de plusieurs mJ (jusqu’à 200 mJ) en
quelques ns peuvent être produites de cette manière. Enfin, les sauts de température les plus
rapides sont obtenus en utilisant des lasers émettant dans le visible qui sont utilisés pour
exciter des colorants qui transmettent ensuite leur énergie à l’eau. Une élévation de 10°C est
obtenue en 70 ps. Une étude théorique suggère que la limite de cette approche se situe aux
environs de 20 ps. Dans cette méthode, il importe de vérifier que le colorant n’interfère pas
avec la réaction à étudier.
32

Chapitre 3 : Analyse des cinétiques transitoires
Dans l’étude de la phase transitoire pré-stationnaire des réactions, les données
expérimentales obtenues par les techniques décrites dans le chapitre précédent sont
généralement représentées par une fonction exponentielle, pour les réactions de premier ordre,
ou par la superposition de plusieurs exponentielles. L’analyse des courbes permet de
déterminer une constante apparente d’ordre 1, k cat , qui est l’inverse du temps de relaxation ().
Généralement, k cat est fonction de la concentration des réactants.
L’étape suivante est donc d’étudier k cat est fonction de la concentrations des réactants, y
compris celle de l’enzyme et des substrats, pour élucider le mécanisme réactionnel en termes
d’étapes élémentaires et de déterminer la vitesse de chacune de ces étapes. La procédure
employée est essentiellement similaire à celle utilisée pour les cinétiques pré-stationnaires,
dans laquelle la vitesse initiale, plutôt que la constante de vitesse apparente, est utilisée
comme paramètre reflétant la vitesse.
La différence entre ces deux types de cinétiques est que la cinétique à l’état stationnaire
est basée sur la vitesse de conversion des substrats en produits, indépendamment des
changements d’état de l’enzyme, tandis que la cinétique pré-stationnaire a pour but
l’observation des étapes élémentaires de la réaction en suivant les changements d’état de
l’enzyme. Dès lors, il y a des différences entre ces deux approches quant à l’établissement des
équations de vitesse, puisque l’enzyme est considérée comme catalyseur dans les cinétiques
stationnaires et comme un réactant directement impliqué dans les processus élémentaires
dans les cinétiques pré-stationnaires.
Analyse des méthodes de relaxation proches de l’équilibre (petites perturbations)
Mécanismes à une étape
Les mécanismes à une étape sont caractérisés par un seul temps de relaxation.
Considérons une association réversible bimoléculaire :
A + B
k1
k +1
C (43)
'
Si c i
dénote la concentration de l’espèce i (A, B, ou C) à l’équilibre à la température T’, avant
le saut de température et c i
la concentration à l’équilibre après le saut de température à la
température T, c i
est la variation totale de concentration et c i
est la variation de
concentration au temps t :
c A
= c B
= c C
c = c i
c i
(44)
et
33

c A
= c A
c
c B
= c B
c
c C
= c C
+ c
La variation de la concentration des réactants au cours du temps est donnée par :
(45)
dc A
dt
= dc B
dt
= dc C
dt
= k +1
c A
c B
k 1
c C
(46)
Cette équation est vraie quelle que soit l’amplitude de la perturbation : elle est donc valable
aussi bien pour le T-jump que pour les expériences de stopped-flow. Elle peut être réécrite en
terme de c i
et c au lieu de c i en utilisant les relations (45) :
dc
= k +1
(c A
c)(c B
c) k 1
(c C
+ c)
dt
(47)
= (k +1
c A
c B
k 1
c C
) { k +1
(c A
+ c B
) + k 1 }c + k +1
(c) 2
D’autre par les conditions d’équilibre implique que :
k +1
c A
c B
= k 1
c C
(48)
Et l’équation (47) devient :
dc
dt
= { k +1
(c A
+ c B
) + k 1 }c + k +1
(c) 2 (49)
D’autre part, si la perturbation est faible, le terme en (c) 2 est négligeable :
dc
dt
et
= { k +1
(c A
+ c B
) + k 1 }c c
1
= k (c + c ) + k (51)
+1 A B 1
En général une perturbation est considérée comme faible si c est inférieur à 0,05 c i
.
Les relations (50) et (51) ne sont donc valable que pour les techniques de relaxation, mais pas
pour les techniques de stopped-flow et quenched-flow.
Il faut noter que la relation (50) est une équation de vitesse de premier ordre par rapport
à c. Cela indique que la cinétique d’association peut être approximée par une réaction
d’ordre un, bien qu’il s’agisse d’une réaction bimoléculaire : ce n’est possible que parce que
la réaction est petite.
L’équation (51) montre qu’il est possible de déterminer les valeurs de k +1 et k -1 en
déterminant en fonction de la concentration de A et B.
De même pour les autres mécanismes à une étape, il est possible d’exprimer 1/ en
fonction de k +1 et k -1 .
(50)
34

k +1
A B
k1
A + B C
2A B
nA B
A + C B + C
A + B C + D
A + B 2C
A + B + C D
1/ = k +1
+ k 1
1/ = k +1
(c A
+ c B
) + k 1
1/ = 4k +1
c A
+ k 1
1/ = n 2 k +1
(c A
) n1 + k 1
1/ = (k +1
+ k 1
)c c
1/ = k +1
(c A
+ c B
) + k 1
(c C
+ c D
)
1/ = k +1
(c A
+ c B
) + 4k 1
c C
1/ = k +1
(c A
c B
+ c A
c C
+ c B
c C
) + k 1
35