Dosage des protéines et electrophorèse - IBMC

Dosage des protéinesPendant une purification il est nécessaire de vérifier la présence de protéine avant de passer à létapesuivante. Il est possible de vérifier la présence aussi bien que l'activité d'une protéine.Les premières étapes se contentent généralement de vérifier la présence de protéines parspectrophotométrie.Plus tard pendant la purification on commencera à vérifier la présence d'une protéine particulière oude son activité:anticorps spécifiquesréaction enzymatique--->produit détectable directement ou indirectementfixation de ligands spécifiques radioactifs ou fluorescentREGLE GENERALE : Il faut toujours garder des aliquotes de matériel à chaque étape pour retracer ledéroulement de la purification et améliorer le protocole.

La spectrophotométrieMéthode analytique quantitative, rapide et non destructive, qui consiste à mesurer l'absorbanceou la densité optique d'une substance chimique donnée en solution. Plus cette espèce estconcentrée plus elle absorbe la lumière dans les limites de proportionnalité énoncées par la loi deBeer-Lambert.La densité optique des solutions est déterminée par un spectrophotomètre préalablementétalonné sur la longueur d'onde d'absorption de l'espèce chimique à étudier.SpectrophotomètreLe monochromateur génère, à partir d’une source de lumière visible ou ultraviolette, une lumière monochromatique, dont lalongueur d’onde est choisie par l’utilisateur.La lumière monochromatique incidente d’intensité I 0 traverse alors une cuve contenant la solution étudiée, et l’appareil mesurel’intensité I de la lumière transmise. La valeur affichée par le spectrophotomètre est l’absorbance à la longueur d’onde étudiée.

Loi de Beer-LambertLorsqu’un faisceau d’intensité I 0 traverse une solution contenant une substance dissoute il estpartiellement absorbé et le faisceau émergeant possède une intensité inférieure:I = I 0. 10 -lc = coefficient d’extinction molaire du solutél = longueur du trajet parcouru par la lumière dans la solutionc = concentration du solutéL’intensité de la lumière transmise diminue de façon exponentielle en fonction de , de c et de l.Transmittance ou transmissionT = I/I 0= 10 -lcLa transmittance est définie comme pourcentage de lumière transmise.

I = I 0. 10 -lcI/ I 0= 10 -lc si on prends le logarithme décimalLog I/ I 0= Log T= -lcLog I 0/ I = Log 1/ T = lcon défini absorbance A le Log I 0 / I = Log 1/ TA = lcLa loi de Beer-Lambert établi, donc, une relation de proportionnalité directe entre A, la concentration du soluté àdoser (c), la longueur (l) du trajet parcouru par la lumière dans la solution et la nature du soluté ().A est une valeur positive sans unité. Elle est d’autant plus grande que l’intensité transmise est faible car A = Log1/ T.Le coefficient d'extinction molaire , caractéristique de la substance étudiée à une longueur d'onde donnée, estexprimé en mol -1 L cm -1 et correspond à l’absorbance à une certaine longueur d’onde d’une solution deconcentration 1M obtenue en utilisant une cuvette de trajet optique de 1 cm ( 1M = A / l .c).x nml l'épaisseur traversée est exprimé en cmc la concentration est exprimé en mol.L -1 .

Remarques-La loi de Beer-Lambert est additive (mais pas la transmittance) : si la solution contient différentessubstances qui absorbent dans une longueur d'onde donnée, l'absorbance totale pour cettelongueur d'onde est la somme des absorbances de chaque substance.- La loi de Beer-Lambert a des limites. A = f(c) n'est linéaire que dans un intervalle deconcentrations réduit : les concentrations ne doivent pas dépasser 10 -2 M (10 mM).AD'autres facteurs peuvent dégrader la loi de Beer-Lambert :c-Erreurs de lecture du détecteur : le domaine de mesure est idéal pour 20%

Quelle méthode de dosage des protéines?Method Range Accuracy Convenience InterferenceUVAbsorbance280 nm 0.05- 2 mg/ml Fair Excellent Detergents, nucleicacids191-194 nm 0.01-Fair Poor0.05mg/ml280-260 nm Fair ExcellentColorimetric Biuret 1-6 mg/ml Good Good Ammonium saltsLowry 0.1-1.5mg/ml Good Fair strong acids, ammoniumsulfateBicinchoninic 0.1-2 mg/ml Good Excellent strong acids, ammoniumsulfate, lip idsDye bindi n g Bradford 0.05-1.4mg/mlGood Excellent

Dosage des protéines: absorption aux UV (280 nm)Systèmes de chromatographie ---> cellule spectrophotométrique.Le tryptophane (Trp, W) et la tyrosine (Tyr, Y) absorbent la lumière UV avec un pic à 280 nmdintensité décroissante.HybrideTryptophaneOTyrosineOH 2 N CH COHH 2 N CH COHCH 2CH 2Formes de résonance de l’anneau benzénique.Il est présent dans le tryptophane et la tyrosine.Absorbance à 280 nm.HNOHLe coefficient d'extinction de chaque protéine variera selon sa richesse en W et Y.

Dosage des protéines: absorption aux UV (280 nm)Le coefficient d'extinction molaire de chaque protéine variera selon sa richesse en W et Y.Dosage de la concentration des protéines totales dun extrait: on utilise le coefficient dextinctionmassique générique pour toutes les protéines qui correspond à labsorbance à 280 nm dunesolution protéique de concentration de 1mg / mL mesuré dans une cuvette de 1 cm. Cette valeurest de 1. 1mg/mL = 1,0280nmMéthode de Warburg-Christian: lecture de labsorbance à 280 nm et à 260 nm (correction pourles acides nucléiques). On calcule le rapport des absorbances 280/260 et on détermine lepourcentage dacides nucléiques dans la solution en utilisant le tableau.RapportA 280nm /A 260nmTeneur en acidesnucléiques (%)1.75 0.01.52 0.51.36 1.01.25 1.51.16 2.01.03 3.00.94 4.00.82 6.00.75 8.00.67 12.0On calcule la concentration des protéines (mg /mL) par larelation suivante:C = d x ( A 280 nm x 1,55 - A 260 nm x 0,76)d = facteur de dilution de la solution protéiqueutilisé pour les mesures dabsorbance.

Dosage des protéines: absorption aux UV (~ 190 nm)Tous les peptides pourraient absorber l'UV aux environs de 190-200nm, mais la plupart destampons absorbent aussi massivement dans cette région...Formes de résonance de la liaison peptidique.Absorbance à 191-194 nm.Cette mesure est moins dépendante de la composition en acides aminées des protéines.NB Toutes les mesures dabsorbance aux UV sont effectuées avec des cuves en quartz, car ellesont les seules à ces longueurs donde à permettre 100% de transmission des rayons.

Dosage des protéines: par méthodes colorimétriques.Ces techniques demandent un traitement del'échantillon à mesurer par une substancechimique qui, au contact des protéines, produiraun changement de couleur que l'on peut quantifierpar spectrophotométrie si on dispose d'unecourbe standard fiable.Méthode du biuretTechnique pour détecter les protéines dans une solution, qui prends son nom de la substancebiuret (H2NCONHCONH2), formée quand l’urée est chauffée (elle présente une liaison de typepeptidique).En conditions alcalines le cuivre (Cu 2+ ) apporté sous forme de sel (sulfate de cuivre) réagit avecles liaisons peptidiques des protéines et la solution se colore en violet avec une absorptionmaximum à 550 nm. Cette coloration ne se développe pas en présence de acides aminées libres.Méthode linéaire : couleur ---> complexe liaison peptidique et ion cuivre Cu 2+ , pas dedépendance de la composition en aa.Peu sensible (1-6 mg/mL): complexe à bas coefficient dextinction.Interférence avec les sels d'ammonium.

Dosage des protéines: par méthodes colorimétriques.Méthode de LowryEn condition alcalines, dans la méthode du biuret, le cuivre (Cu 2+ ) se réduit en oxydant les aaaromatiques. Dans la méthode de Lowry, qui est une modification de la méthode du biuret, le cuivreréduit (Cu + ) est utilisé pour réduire le réactif de Folin (une solution phénolique contenant descomposés de tungstène et de molybdène) qui change sa couleur du jaune au bleu. On lit la réactionà 750 nm.Plus sensible que le biuret, quantités de 0,1-1,5 mg/mL.Elle est sensible à plusieurs agents, dont l'EDTA, le DTT, le -mercapto, l'Hepes, le Tris, le triton X-100, le NP-40, etc.

Dosage des protéines: par liaison de colorantMéthode de BradfordLe bleu de Coomassie se lie à l'arginine (Arg, R), la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W),l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F).En solution, il a une forme cationique rouge qui absorbe à 470nm. Lié aux protéines, il a une formeanionique bleue qui absorbe à 595nm.Il est assez insensible aux agents des tampons, mais est sensible aux détergents.La méthode de Bradford est encore plus sensible que celle de Lowry (5-100 μg/mL enmicroplaque).Blue de Coomassie brilliant

Purification des protéinesTout le long de la procédure de purification il faut déterminer des paramètres précis pour vérifier sinotre procédure est adéquate:1) Volume de la solution2) Concentration protéique3) Activité enzymatiqueCes trois paramètres nous permettrons de calculer:4) Activité spécifique5) Activité totale6) L’enrichissement7) Le rendement

Unités d’activité enzymatiqueUnité enzymatique ou unité internationale (UI): quantité d’enzyme permettant la formation d’unemmole de produit par minute dans des conditions définies de pH, T°C, force ionique,concentration saturante de substrat.Si l’on rapporte le nombre de UI au volume de la fraction de purification, on obtient l’Activitéenzymatique (AE) exprimée en UI/ml. Ce paramètre augmente avec la purification.Si l’on rapporte le nombre de UI à la masse de protéines contenue dans la fraction de purification, onobtient l’Activité spécifique (AS) exprimé en UI/mg. Ce paramètre augmente avec la purificationet il est une mesure de la pureté de la fraction enzymatique.L’Activité totale (AT) correspond au nombre de Ui contenus dans le volume total de la fraction depurification. On l’obtient en multipliant l’AE pour le volume totale de la fraction. Elle estexprimée en Ui. Ce paramètre diminue avec la purification.Le Rendement R correspond à la totalité d’UI en fin de purification divisée par la totalité UI avant lapurification (en %).L’Enrichissement (ou degré de purification, E) correspond à l’AS en fin de purification divisée parl’AS avant la purification.L’Activité Moléculaire (AM) correspond au nombre de UI/μmol d’enzyme.L’Activité spécifique et l’Enrichissement atteignent une valeur maximale lorsque l'enzyme est pure.

Suivi de purification: dosage d’activité enzymatiquePour pouvoir calculer l’activité enzymatique il faut calculer la vitesse initiale de la réaction catalysépar l’enzymes que nous sommes en train de purifier.Phosphatase = catalyse la déphosphorilation du substrat (par ex. L-histidinol phosphatase -dephosphorile le L-histidinol phosphate).Dephosphorilation du paranitrophénylphosphate (PNPP) en paranitrophénol (PNP). 415nm PNP= 18800 M -1 cm -1Cinétique :Temps 0 1’ 2’ 3’ 4’minA 0 0,093 0,191 0,296 0,401B dil 20X 0 0,075 0,146 0,221 0,292Vitesse initiale est la pente de la tangente à la courbe.viA= 0,296-0,093/ 3-1= 0,102 (variation d’absorbance - A- par minute)A = lcA/t = lc/t => c /t = A /t . 1/l => 0,102 . 1 / 18800 mol -1 L cm -1 . cm

A/t = lc/t c /t = A /t . 1/l . d d = facteur de dilution(1 dans notre cas)c /t = 0,102 /min . 1 / 18800 mol -1 L cm -1 cmc /t = AE = 0,102 mol / 18800 L minAE = 0,102 . 10 6 μmol / 18800 10 3 mL . minAE = 0,102 . 10 3 μmol / 18800 mL . minAE = 0,0054 μmol / mL . min Mais μmol / min = UiAE = 0,0054 Ui / mL

ELECTROPHORESE

Electrophorèse sur gel de polyacrylamideLes gels de polyacrylamide sont obtenus par polymérisation de molécules linéaires d’acrylamidepontées par la bis acrylamide.La réaction est réalisée en présence d’un catalyseur (tétraéthylméthyldiamide - TEMED) et d’uninitiateur (persulfate d’ammonium).Réseau de mailles dont la porosité est déterminé par la concentration de l’acrylamide et bisacrylamide.

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide-Dépôt du mélange deprotéines__Déplacement des protéines (et acides nucléiques) :en fonction de la charge sous la force du champélectriqueen fonction de l’encombrement à cause des maillesdu gelChamp électrique_ _ _____ _ _Déplacement du cathode (-) vers l’anode (+) dans l’ordre:de la charge nette (-) croissantede l’encombrement décroissantOn peut effectuer des électrophorèses en conditions natives àpH acide ou basique selon le point isoélectrique de la protéined'intérêt.+

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide: l’appareillage

Electrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamideLe système le plus utilisé pour l'analyse d'un mélange de protéines est le gel de SDS (ou SDS-PAGE, pour sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis).On met 2% de SDS dans le gel d'électrophorèse, dans le tampon de migration et dans le tamponde charge.Le SDS = détergent anionique (1charge négative par molécule) qui dénature les protéines enenveloppant la chaîne polypeptidique selon un ratio de masse de 1,4g SDS pour 1g protéine.Charge négative proportionnelle à leur longueur; même densité de charge par unité de longueur(1charge négative pour 2 aa).On utilise aussi 0,1M -mercaptoethanol (HO-CH2-CH2-SH) dans le tampon de charge deséchantillons. Le -mercaptoéthanol brise les ponts disulfures intra et inter-protéiques.Puisque les protéines sont uniformément chargées par le SDS, leur vitesse de migration sur gelpendant lélectrophorèse, sera proportionnelle à leur seule masse.Les protéines dans le gel sont colorées avec le bleu de Coomassie qui se lie à l'arginine (Arg, R),la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W), l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F).

Electrophorèse sur gel dénaturant à pH discontinuIons glycineGel de concentration(Stacking gel)Cl - prend de l’avance et laisse unvide ionique dans lequel lesprotéines n’avancent pas.Les ions glycine avancentlentement: leur front de migrationporte les protéines qui vont seconcentrer en une bande fineGel de séparation(Running gel)Ions glycineA l’interface entre le gel deconcentration et le gel de séparationles ions glycine deviennent plusmobile (pH 9) et le front de ionsdépasse les protéines qui sontconcentrées en une bandeLes protéines ont maintenant assezd'électrolytes de part et d’autre pourse séparer selon leur poidsmoléculaire.

Electrophorèse sur gel dénaturant à pH discontinu

Electrophorèse sur gel dénaturant à pH discontinuCette technique peut être utilisé pour déterminer le poids moléculaire d’une protéine car dans cescondition la mobilité est directement proportionnelle au Log de la masse moléculaire.On peut aussi déterminer l'oligomèrie d’une protéine en mettant en corrélation le poids moléculairetrouvé par gel filtration (conditions natives) avec ceux des sous-unités trouvés par SDS-PAGE .MobilitéProtéineinconnueMarqueur Protéinede poids inconnuemoléculaireLog MM

Focalisation isoélectrique (FIE)Le principe de base de la focalisation isoélectrique (FIE) est de créer un gradient de pH danslequel les protéines pourront se déplacer soumises à un champ électrique.Arrivées au pH correspondant à leur pHi, les protéines s'immobiliseront puisque leur charge nettesera nulle.De cette façon, il est possible de séparer les protéines d'une préparation selon leur pHi.On peut créer un tel gradient de pH avec desampholytes.Ampholytes = oligomères de faible massemoléculaire (300 à 600 Da) qui portent desgroupes amino (+) et carboxyliques (-)aliphatiques ---> éventail de pHi sous l’effet de E.Ampholytes-CH 2 -N-(CH 2 ) n -N-CH 2(CH2) n RNR 2n = 2 ou 3R = H ou -(CH 2 ) n -COOHAcide phosphoriqueH 3PO 4triéthanoamine

Electrophorèse bidimensionnelleL’électrophorèse bidimensionnelle (E2D) est la combinaison d'une focalisation isoélectrique, quisépare selon le pHi, suivie d'une électrophorèse dénaturante SDS, séparant selon le poidsmoléculaire.E2D = séparer un mélange selon deux paramètres complètement indépendants.Ainsi, une FIE ou une SDS-PAGE peuvent séparer environ 60 à 100 composantes. Combinant cesdeux méthodes dans une E2D, on peut résoudre au-delà de 1000 polypeptides.

Electrophorèse bidimensionnelle2001007050PM3020104 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8pH

Western blotRévéler la présence dune protéine à laide dun anticorps spécifique.Transfert de protéines d'un gel SDS à une membrane pouvant être ensuite traitée avec unanticorps. L'anticorps reconnaît sa protéine cible.Un deuxième anticorps, qui reconnaît le premier, est alors appliqué.Ce second anticorps est d'ordinaire couplé à une phosphatase alcaline qui dégradera soit unsubstrat qui génère la production de photons (chemioluminescence) ou l'apparition locale d'unecoloration foncée.

Western blotCette technique permet de suivre la purification de protéines qui nont pas dactivité enzymatique,si un anticorps spécifique contre la protéine en question est disponible.Cette technique est utilisé lors des premières étapes de purification, quand la protéines d'intérêtest mélangée à beaucoup d’autres protéines.Avec l’avancement de la purification on doit pouvoir suivre la protéines par coloration des gels parCoomassie.