Cinétique pré-stationnaire et réactions rapides - IBMC

produits. Elle permet ainsi de discriminer entre mécanisme séquentiel ordonné (Bi Bi
ordonné), mécanisme séquentiel aléatoire (Bi Bi aléatoire), mécanisme de Theorell-Chance
(où le second substrat réagit avec le premier complexe enzyme/substrat dans un processus
bimoléculaire) et mécanisme ping-pong (où le premier produit est libéré avant la fixation du
second substrat). Dans le cas de l’inhibition des réactions à un substrat, la cinétique à l’état
stationnaire permet de déterminer l’affinité relative de l’inhibiteur, I, pour E et pour ES. On
distingue ainsi l’inhibition compétitive (I ne se fixe qu’à E), l’inhibition anti-compétitive ou
incompétitive (I ne se fixe qu’à ES) et l’inhibition non compétitive (I a la même affinité pour
E et ES). Tous ces cas ne sont que des cas particuliers de l’inhibition mixte, où I à une affinité
non nulle et différente pour E et ES.
Au plan expérimental, la cinétique à l’état stationnaire présente de nombreux
avantages. Elle est économique : puisque l’on travaille en large excès de substrat(s) par
rapport à l’enzyme, la quantité d’enzyme requise est limitée (E 0 = 10 -10 à 10 -5 M,
généralement 10 -9 à 10 -6 ). Elle est simple : en jouant sur la concentration en enzyme et en
substrat, il est possible de mesurer v sur des domaines de temps allant de quelques minutes à
quelques heures et aucun appareillage sophistiqué n’est requis. Elle est adaptable: la
concentration du (des) substrat(s) ou du (des) produit(s) peut être déterminée par un très grand
nombre de techniques biochimiques ou biophysiques. La caractérisation d’une enzyme
commencera donc toujours par l’étude de la cinétique à l’état stationnaire, malgré ses
limitations.
Dans les cinétiques à l’état stationnaire, on ne suit généralement que la disparition du
substrat ou l’apparition du produit et on obtient généralement peu ou pas d’information sur
le(s) complexe(s) enzyme/substrats.
Considérons une réaction impliquant plusieurs étapes, par exemple :
E + S ES1 ES2 …
k1 k2
k n
k +1
k +2
k + n
ESn
k p
k + p
E + P (14)
où les complexes ES 1 , ES 2 , …ES n peuvent différer par la conformation de l’enzyme ou des
modifications covalentes de celle-ci. Dans le meilleur des cas, la vitesse globale de la
réaction à l’état stationnaire coïncide avec l’étape la plus lente et ne fournit en aucun cas
d’information sur les étapes les plus rapides. Ainsi, si l’étape la plus rapide est mille fois plus
rapide que l’étape la plus lente et qu’une mutation de l’enzyme la ralentit d’un facteur cent,
l’effet ne sera pas détectable en cinétique stationnaire. Pour comprendre le mécanisme d’une
réaction enzymatique, il est nécessaire d’obtenir des informations sur les étapes rapides autant
que sur les étapes lentes.
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