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123bio.net - Revues - La mucoviscidose http://www.123bio.net/revues/vchappe/3_ii.html Page 1 of 5 3/27/2009 accueil > revues > la mucoviscidose La mucoviscidose. Auteur : Dr. Valérie CHAPPE McGill University, McIntyre Medical Sciences Building, Dept. of Physiology, Montréal, Québec, Canada. Troisième partie - Le canal CFTR : II - Les multiples fonctions du canal CFTR 1 - Les propriétés du canal 1.1 - conductance et sélectivité En déterminant la relation courant-voltage (I/V), pour un canal unitaire dans un milieu symétrique (même composition ionique de part et d’autre de la membrane), on obtient une droite dont la pente est la conductance unitaire (g). On peut également par cette relation définir le potentiel d’inversion du courant (Erev) pour lequel le flux des ions est nul. Les mesures de conductance d’un canal, et sa séquence de perméabilité donnent des informations sur les propriétés du canal. En effet, les intéractions entre les ions perméants et le pore du canal dépendent de leurs propriétés physiques et de leurs structures respectives. CFTR forme un canal anionique permettant la diffusion passive des ions chlorure. La portion extra-cellulaire du canal ne présente pas de sélectivité anionique et le site précis ainsi que le mécanisme de sélectivité de charge sont inconnus (Dawson et al., 1999). CFTR est hautement sélectif pour les anions plutôt que pour les cations monovalents, bien que cette sélectivité soit imparfaite : le Cl- est 10 à 20 fois plus perméant que Na+ (Anderson et al., 1991b; Bear et al., 1991). Les ions qui sont facilement déshydratés tendent à être plus perméants que les ions qui retiennent plus fortement l'eau d'hydratation . Les boucles intracytoplasmiques qui relient les segments transmembranaires impliqués dans la formation du pore, ne participent pas directement aux mouvements des ions. À l’inverse, les résidus de la boucle extra-cellulaire 1, influencent la sélectivité du canal (Seibert et al., 1997). La partie du pore la plus resserrée a un diamètre d'environ 5,3 Å (Hanrahan et al., 1998). La conductance du canal varie entre 6 et 11pS en fonction du type cellulaire, de la température, et de la concentration des ions. La séquence de perméabilité du canal CFTR est : Br - >Cl - >I - >F - . Cette séquence distingue CFTR des autres canaux chlorure épithéliaux, dans lesquels la perméabilité de l'iodure est plus importante que celle du chlorure (Sheppard et Welsh, 1999). Cependant, dans les domaines transmembranaires la mutation de résidus basiques en résidus acides, modifie la séquence de perméabilité, transformant CFTR d'un canal de faible, en un canal de forte perméabilité à l'iodure, avec une nouvelle séquence : I - >Br - > Cl - > F - . Ce qui correspond à la séquence proposée par J.A. Tabcharani et collaborateurs (1997). Les recherches menées par P. Linsdell et collaborateurs, montrent que des ions différents peuvent passer en même temps à travers le pore (Linsdell et al., 1997a). Le résidu R347, dans le segment transmembranaire 5, sert vraisemblablement de filtre de sélectivité anionique. Il intervient dans le transport multi-anionique en formant des intéractions de charge (Tabcharani et al., 1993; Wigley et al., 1998). Des mutations du résidu T338, dans le segment transmembranaire M6, altèrent l'intéraction entre l'ion perméant et le pore du canal. Les thréonines T338 et T339 procurent une stabilité de structure à l'hélice a 6 grâce à des ponts hydrogènes intra-hélice (Linsdell et al., 1998c). 2 - Régulation des mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal CFTR. La durée d'ouverture du canal est variable en fonction de la température et du modèle cellulaire considéré. Ceci représente certainement les différences d’expression des isoenzymes pouvant réguler CFTR dans une cellule donnée. Pour des températures physiologiques (35°C) la durée d'ouverture du canal CFTR est comprise entre 100 et 250 ms. Les mécanismes qui contrôlent l’ouverture et la fermeture sont des événements séquentiels, impliquant des étapes de phosphorylation suivies de la liaison et l’hydrolyse du MgATP. Le modèle de base sur lequel les études structure-fonction s’appuient propose que des changements de conformation du domaine R, après phosphorylation, permettent le passage des ions chlorure. La levée de l'inhibition imposée par l'état déphosphorylé du domaine R stimule l'interaction entre l'ATP et les domaines NBD.
123bio.net - Revues - La mucoviscidose http://www.123bio.net/revues/vchappe/3_ii.html Page 2 of 5 3/27/2009 On distingue deux étapes dans l’ouverture du canal : 1 - La phosphorylation du domaine R. Son degré de phosphorylation détermine la probabilité d’ouverture. Bien que les résidus phosphorylables du domaine R soient connus, les résidus impliqués dans les mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal sont incertains (Hwang et al., 1993; Hwang et al., 1994). 2 - La liaison et l’hydrolyse de l’ATP sur les sites NBD. Elle entraîne une modification conformationnelle des domaines transmembranaires du canal CFTR. L’hydrolyse des nucléotides triphosphates est indispensable à l’ouverture du canal, et la phosphorylation préalable par la PKA augmente cette réaction. Le canal déphosphorylé est incapable d'hydrolyser l'ATP. Sur des membranes excisées, après phosphorylation par les PKA, le canal peut être ouvert par les nucléotides triphosphates mais pas par les analogues non hydrolysables de l’ATP, l'ADP ni l’AMPc (Schultz et al., 1995). L'hydrolyse de l'ATP représente l’étape limitante à la fois pour l’ouverture et la fermeture du canal. Ces deux événements interviennent sur des sites différents d'une même molécule. Le domaine NBD1 est le site d’hydrolyse de l'ATP couplé à l'ouverture du canal et le domaine NBD2 est le site d’hydrolyse de l'ATP permettant la fermeture du canal. Dans des expériences de protéine de fusion, les activités ATPasiques ont été localisées sur les résidus 433-589 pour le domaine NBD1, et 1208-1399 pour le domaine NBD2 (Seibert et al., 1997; Mathews et al., 1998). L’hydrolyse de l'ATP sur les domaines NBD du canal CFTR est plus lente que celle des autres ATPases. Cette vitesse de réaction correspond d’avantage à celle de l'hydrolyse du GTP au niveau des sous-unités a des protéines G. En 1995, MR Carson et MJ Welsh ont comparé les domaines NBD du canal CFTR aux sous-unités a des protéines G. Sur le plan structural, le motif C spécifique des transporteurs ABC ressemble fortement au site catalytique des GTPases (motif D-X-[G/A]-G-Q). De plus, la liaison et l’hydrolyse de l’ATP sur les domaines NBD du canal CFTR contrôlent la durée d’ouverture et de fermeture du canal, de même que la liaison et l’hydrolyse du GTP contrôlent la durée d’activation des protéines G (Gadsby et Nairin, 1999; Foskett et al., 1998). 2.1 - Phosphorylation par les PKA et les PKC La première étape de l’activation du canal passe par une phosphorylation par les PKA. In vitro (canal isolé), on trouve cinq résidus serines, phosphorylés par la PKA, situés dans le domaine R: 660, 700, 737, 795, et 813. Il existe probablement sur ce domaine d'autres résidus pouvant être phosphorylés par les PKA in vivo (dans les cellules intactes). La phosphorylation sur le domaine R se produit avec une stœchiométrie de 5 à 6 mol/mol après une exposition limitée à la PKA. Les cinétiques de phosphorylation sont influencées par la structure locale de la protéine CFTR, ainsi que par la proximité et l'activité sélective des phosphatases endogènes de la cellule. Sur un canal isolé, la PKC phosphoryle le domaine R avec une stœchiométrie de 2 mol/mol, essentiellement sur les résidus sérines 686-790. Et dans les cellules CHO et Calu-3, la PKCe, régule CFTR (Liedtke et Cole, 1998). La phosphorylation du canal CFTR par les PKC semble stimuler une phosphorylation ultérieure par la PKA (Yurkomauro et al., 1998) puisque l'inhibition de la phosphorylation par les PKC prévient une phosphorylation ultérieure du canal CFTR par la PKA. Ces données suggèrent qu'une phosphorylation de base par les PKA et les PKC soit nécessaire pour entraîner l'activation du canal, en agissant sur des sites de phosphorylation essentiels ou que les PKC activent CFTR indirectement par des phosphorylations au niveau du cytosquelette ou des vésicules de transport. 2.2 - Régulation du canal CFTR par les protéines phosphatases Très rapidement, après phosphorylation par les PKA, la déphosphorylation par des protéines phosphatases inactive le canal. A l’inverse, l’inhibition des protéines phosphatases endogènes, augmente l'efficacité de stimulation du canal CFTR et ralentit son retour à l'état désactivé. Mais peu de choses sont connues sur la spécificité avec laquelle ces différentes phosphatases déphosphorylent les phosphosérines du canal CFTR Chez les eucaryotes, les quatre principaux types de protéines phosphatases sérine/thréonine solubles sont codés par les membres de deux familles de gènes. Les protéines phosphatases PP1, PP2A, et PP2B appartiennent à la famille des PPP, dont la spécificité de substrat est modulée par différentes sous-unités régulatrices. PP2C appartient à la famille PPM de protéines phosphatases dépendantes du magnésium et qui ne possèdent pas de domaine de régulation. Les phosphatases PP2A et PP2C sont critiques pour la régulation du canal CFTR. Ces enzymes comportent des motifs d'ancrage à la membrane, permettant la co-localisation avec CFTR (Becq et al., 1993). La protéine PP2A provoque une déphosphorylation quasi complète du canal CFTR et les phosphatases endogènes PP2C sont des régulateurs puissants de l'activité du canal CFTR. Leurs effets sur l'ouverture et la fermeture du canal unitaire sont distincts de ceux de la PP2A, mais similaires à ceux des phosphatases endogènes dans les cellules CHO, BHK, et T84. L’association de plusieurs phosphatases est nécessaire pour la désactivation complète du canal CFTR (Luo et al., 1998). Le canal CFTR excisé à partir de cellules CHO ou de cellules respiratoires humaines, est désactivé par l’action de phosphatases associées à la membrane. Il est activée par des inhibiteurs de phosphatages (Becq, et al., 1994). Cette régulation a également été montrée dans le cas de certaines mutations comme R117H, G551D et dF508. 2.3 - Régulation par l’ATP Une fois phosphorylé, l'ouverture du canal nécessite de l'ATP cytosolique et du magnésium. En absence d’ATP, le canal CFTR phosphorylé se ferme. L’ADP et les analogues non-hydrolysables de l’ATP inhibent l’activation par
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