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3/27/2009 

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La mucoviscidose. 

Auteur : Dr. Valérie CHAPPE 

McGill University, McIntyre Medical Sciences Building, Dept. of Physiology, Montréal, Québec, Canada. 

Première partie - La mucoviscidose 

I - Les phénotypes CF 

II - Implication du canal CFTR 

III - Stratégies de correction des phénotypes CF 

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Deuxième partie - Les épithéliums 

Le transport d’électrolytes 

Les canaux chlorure : 

I - Les canaux chlorure : Les différentes familles de canaux chlorure 

II - Les canaux chlorure : La superfamille des transporteurs ABC 

1 - les protéines de type MDR (Multi Drug Resistance) 

2 - Le canal chlorure CFTR 

3 - Les récepteurs aux sulfonylurés (SUR1 et SUR2) 

III - Les canaux chlorure : Régulation des canaux chlorure par les seconds messagers 

1 - Activation du transport de chlorure par l’AMPc 

1.1 - Régulation du taux d’AMPc par les adénylate-cyclases 

2 - Activation du transport de chlorure par l’ATP 

2.1 - Les récepteurs purinergiques 

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Troisième partie - Le canal CFTR 

I - Structure du canal 

1 - Topologie membranaire 

2 - Les différents domaines du canal CFTR et leurs fonctions 

2.1 - Le domaine régulateur (R) 

2.2 - Les domaines transmembranaires 

2.3 - Les domaines de liaison aux nucléotides (NBD) 

II - Les multiples fonctions du canal CFTR 

1 - Les propriétés du canal 

1.1 - conductance et sélectivité 

2 - Régulation des mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal CFTR. 

2.1 - Phosphorylation par les PKA et les PKC 

2.2 - Régulation du canal CFTR par les protéines phosphatases 

2.3 - Régulation par l’ATP 

3 - Régulation par les seconds messagers 

4 - CFTR et transport d'ATP : divergences sur le thème. 

5 - Les autres types de perméabilités 

6 - CFTR régulateur de la conductance membranaire 

6.1 - Régulation du canal ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channel) 

6.2 - Régulation du canal sodium épithélial (ENaC)


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6.3 - Régulation des canaux potassium (K) 

III - Régulation de la protéine CFTR 

1 - Biosynthèse de la protéine 

2 - Localisation de la protéine fonctionnelle 

3 - Mécanismes d’endocytose et exocytose 

3.1 - Interactions avec le cytosquelette 

3.2 - Rôle des protéines Gi 

4 - Modification des régulations cellulaires par CFTR 

4.1 - Systèmes d’expression. 

4.2 - Problèmes liés à la surexpression 

4.3 - Les changements de pH intracellulaire 

IV - Les mutations du canal CFTR 

1 - Les différentes classes de mutations 

2 - La mutation ΔF508 

V - Pharmacologie du canal CFTR 

1 - Les activateurs du canal CFTR 

2 - Les inhibiteurs du canal CFTR 

3 - Les dérivés xanthines 

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La mucoviscidose, ou fibrose kystique selon la terminologie anglo-saxonne, est la maladie génétique récessive, 

autosomale, léthale, la plus répandue dans les populations européennes et nord-américaines. Environ une 

personne sur 50 est porteuse du gène muté et un enfant sur 2500 naît atteint de cette maladie. Les progrès 

médicaux réalisés dans le traitement de cette pathologie ont fait évoluer l'espérance de vie des patients atteints de 

mucoviscidose, suivant les pays, de la petite enfance à 35-45 ans, avec une importante réduction de la mortalité 

infantile. Cependant, on ne dispose pas à l’heure actuelle de traitements efficaces pour ralentir la destruction des 

tissus pulmonaires et pancréatiques. 

Les premiers rapports médicaux évoquant cette maladie, datent du moyen âge. À cette époque, les médecins 

rapportaient que les enfants dont la peau laissait un goût salé avaient une espérance de vie très limitée. Pendant 

très longtemps les multiples symptômes observés chez des malades atteints de mucoviscidose n'étaient pas 

corrélés entre eux pour diagnostiquer cette maladie. La notion de fibrose kystique pour caractériser l'état 

physiopathologique des tissus respiratoires et pancréatiques est apparue pour la première fois dans les années 30. 

L’appellation mucoviscidosis permit dans les années 40 de différencier cette pathologie, caractérisée par des 

sécrétions de mucus abondant et anormalement épais, des différents désordres pancréatiques connus et englobés 

dans la définition de la fibrose kystique. C’est en 1946 que Andersen et Hodges ont démontré pour la première fois 

que cette maladie est génétique, et résulte d’une mutation récessive autosomale. Il fallut attendre les années 50 

pour voir se développer un test de diagnostic rapide, toujours d’actualité, basé sur l’augmentation de salinité de la 

sueur des malades. Cette observation révèle la contradiction principale observée dans la complexité de cette 

pathologie entre les désordres physiologiques observés au niveau cellulaire concernant le transport d’électrolytes, 

et ceux observés au niveau macroscopique concernant la modification des mucus. 

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I - Les phénotypes CF : 

La mucoviscidose est une maladie qui atteint essentiellement les tissus épithéliaux exocrines. On observe des 

dysfonctionnements dans de multiples tissus tels que les voies respiratoires, le pancréas, le foie, l'intestin, les vas 

déférents, et les glandes sudoripares (Figure 3). Ceci conduit à de nombreux symptômes comme des insuffisances 

respiratoires et pancréatiques, une infertilité masculine, et une modification de la concentration saline de la sueur. 

Les affections pulmonaires sont la principale cause de mortalité chez les patients CF. L’augmentation de viscosité 

du mucus entraîne une occlusion progressive des voies respiratoires et crée un environnement propice aux 

infections bactériennes opportunistes. Les tissus respiratoires des malades CF sont rapidement et abondamment 

colonisés par des bactéries comme Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae et surtout Pseudomonas 

aeruginosa dans les stades tardifs de l’infection. Une fois l'infection bactérienne installée il est très difficile, voir 

impossible, de l’éradiquer. On comprend mal pourquoi ces bactéries sont détruites à la surface des épithéliums 

normaux mais pas des épithéliums CF. D’après Jeffrey J Smith et collaborateurs il faut une faible concentration en 

NaCl dans les fluides recouvrant les épithéliums respiratoires pour permettre la destruction de ces bactéries. A 

l’inverse, la forte concentration en NaCl mesurée dans le cas des épithéliums CF expliquerait la persistance des 

infections bactériennes (Smith et al., 1996). 

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II - Implication du canal CFTR : 

Depuis 1989 nous savons que des mutations du gène CF, localisées sur le chromosome 7 au locus q31, sont 

associées à la mucoviscidose. Le gène CF de 250 kpb identifié par John Riordan (1989) code pour une protéine 

transmembranaire de 1480 acides aminés : la protéine CFTR. L’activité du canal CFTR est principalement associée 

à la diffusion de chlorure et à la régulation d’autres canaux ioniques épithéliaux. Ce canal chlorure, activé par 

l’AMPc, appartient à la superfamille des transporteurs ABC. Le canal CFTR est exprimé dans les tissus épithéliaux 

sécréteurs des glandes sudoripares, du pancréas, de l'intestin, des canaux biliaires, des systèmes génitaux, dans 

les voies respiratoires, ainsi que dans les cellules cardiaques. 

Plus de 700 mutations de cette protéine ont été recensées. Elles induisent des dysfonctionnements ou un défaut de 

localisation du canal CFTR à la membrane plasmique apicale des cellules épithéliales. Cependant, la délétion d’une 

phénylalanine en position 508, notée ΔF508, représente 70% des mutations observées dans les cas de 

mucoviscidose. La protéine CFTR-ΔF508 est dégradée très tôt au cours de sa biosynthèse, et moins de 1% de ce 

mutant se retrouvera adressé à la membrane. 

Les épithéliums CF ne sécrètent pas de chlorure en réponse à l'AMP cyclique, et présentent une absorption accrue 

de sodium. Ce dérèglement dans le transport d’électrolytes a pour conséquence une augmentation importante de la 

viscosité du mucus recouvrant les voies aériennes. La sévérité de la maladie et le nombre d'organes atteints varient 

en fonction du type de mutation du canal CFTR (Figure 4). Les hétérozygotes, pour lesquels 50% de la protéine est 

fonctionnelle, ne présentent pas de symptômes (Pileweski et Frizzell, 1999). Bien que de nombreux progrès aient 

été réalisés dans la connaissance de la biologie et de la biochimie du canal CFTR, on comprend mal l'importance 

des désordres physiopathologiques observés notamment au niveau des voies respiratoires. 

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III - Stratégies de correction des phénotypes CF : 

De nombreuses stratégies sont utilisées pour pallier les désordres physiologiques observés dans les différents 

tissus CF (Figure 5). Ces études concernent tous les aspects de la biologie et de la biochimie du canal CFTR. Elles 

incluent notamment des tentatives de thérapie génique, des essais de modulation du transport d’électrolytes par 

activation d'autres canaux chlorure présents dans les membranes apicales des épithéliums, des études de 

pharmacologie pour développer des molécules activatrices des canaux CFTR présents à la membrane et des 

essais de modulation de l'adressage de la protéine. 

Les essais de thérapie génique ont pour but de délivrer directement dans les cellules le gène codant pour la 

protéine CFTR sauvage, afin de rétablir une expression du gène et un adressage correct à la membrane apicale. 

De nombreux véhicules pouvant transférer le gène CFTR sont étudiés. Actuellement aucun traitement efficace n’a 

été découvert. 

À côté de ces essais impliquant directement le canal CFTR, des tentatives médicales visent à diminuer les 

problèmes respiratoires. Dans ce sens, des tentatives ont été réalisées dans l'espoir de fluidifier le mucus. 

Malheureusement, peu d’effets bénéfiques ont été mesurés. 

Un autre aspect des affections pulmonaires est l’importante inflammation de ces tissus. L'utilisation de fortes doses 

d'ibuprofène administrées chez de jeunes enfants avant que n'apparaissent les processus d'inflammation et 

d'infection pulmonaire pourrait ralentir le déclin des fonctions pulmonaires. 

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Deuxième partie - Les épithéliums : 

La caractéristique principale d’un épithélium est de former une barrière continue entre deux compartiments pour y 

maintenir des compositions asymétriques. Dans l’organisme les épithéliums forment une barrière continue entre 

l’environnement extérieur et le milieu interne (épithélium pulmonaire) ou délimitent des espaces spécialisés 

(glandes endocrines) tout en permettant un transport sélectif d’ions, de solutés et de macromolécules. 

Les cellules épithéliales sont polarisées avec un domaine apical en contact avec un compartiment muqueux et un 

domaine basal en contact avec un support (lame basale). L’adressage des constituants de la membrane dans ces 

deux domaines est asymétrique (Wilson, 1997). La ségrégation des composants de chaque domaine est assurée 

par la jonction serrée qui procure l’étanchéité de l’épithélium. La membrane apicale des cellules épithéliales est 

généralement recouverte de microvillosités et dans les épithéliums spécialisés (cellules intestinales), on peut 

observer une bordure en brosse. La membrane latérale est en contact avec les cellules adjacentes par des 

desmosomes ou des jonctions communiquantes qui assurent les communications intercellulaires. 

Cette polarisation est aussi le reflet de l'organisation interne des cellules épithéliales. Les éléments du cytosquelette 

forment un réseau permettant l’organisation spatiale des organites selon un axe basolatéral-apical, et maintiennent 

l’intégrité de la barrière cellulaire. 

Le transport d’électrolytes : 

Les flux trans-épithéliaux dépendent de la régulation et de la localisation des protéines de transport (Caplan, 1997). 

Ces protéines sont des canaux ioniques et des transporteurs ou co-transporteurs. 

L’absorption de Na+ et la sécrétion de Cl- sont des éléments majeurs de la fonction épithéliale. Si l’on considère 

des épithéliums sécréteurs (Figure 1), la Na/K ATPase produit la force motrice nécessaire au transport actif de 

chlorure. Les ions Cl- entrent dans la cellule à travers la membrane basolatérale, par des co-transporteurs de type 

Na+/K+/2Cl-, les ions K+ ressortent de la cellule du côté basal par des canaux potassium, et les ions Cl- sortent du 

côté apical par diffusion passive à travers les canaux chlorure. Cette sécrétion de Cl- apicale peut être régulée par 

des seconds messagers. 

Le canal CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) apparaît être une des clefs de la 

régulation par l’AMPc du transport de chlorure dans les cellules épithéliales (Morris et Frizzell, 1994). 

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I - Les différentes familles de canaux chlorure : 

Les canaux chlorure sont présents dans la membrane de la plupart des cellules eucaryotes et jouent un rôle 

important dans l’excitabilité membranaire, la régulation du volume cellulaire, le transport transépithélial et la 

régulation du pH intracellulaire. Les différents types de canaux chlorure peuvent être activés par des ligands, par le 

calcium intracellulaire, par l’AMPc, par les protéines G ou encore par des variations du potentiel de membrane, des 

déformations mécaniques ou des variations de volume. 

Il est difficile d’établir une classification des canaux chlorure car d’une part les mécanismes d’activation des 

différents canaux se recoupent et ne correspondent pas forcement à des caractéristiques structurales, d’autre part 

peu de canaux chlorure ont été clonés. 

Sur un plan structural, on peut distinguer trois classes de canaux chlorure (Figure 2) : 

1 - les récepteurs canaux, activés par des ligands. Cela inclus les récepteurs GABAA et glycine. Ces canaux 

s’assemblent en hétéropentamères, chaque monomère possédant quatre segments transmembranaires. 

2 - Le canal CFTR, qui est un canal chlorure activé par l’AMPc. Le canal CFTR est composé de deux domaines 

possédant chacun six segments transmembranaires. Il fait partie de la superfamille des transporteurs ABC (ATP 

Binding Cassette). 

3 - La famille des canaux CLC. La topologie exacte de ces canaux n’est pas encore connue, ils possèdent environ 

douze segments transmembranaires et fonctionnent sous forme multimérique. A l’heure actuelle neuf gènes codant 

pour des protéines CLC sont connus. 

Les canaux chlorure peuvent également être classés en fonction de leur conductance unitaire. On distingue ainsi 

les canaux chlorure de conductance élevée : entre 200 et 500 pS (canaux Cl - maxi), les canaux rectifiants sortants 

(ORCC : Outwardly Rectifying Chloride Channel) et les canaux de faible conductance, généralement inférieure à 20 

pS (Becq et al., 1992; Jentsch et Günther, 1996b; Foskett, 1998; Jentsch, 1996a). 

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II - La superfamille des transporteurs ABC : 

Les transporteurs ABC font partie d'une superfamille parmi les plus importantes. On retrouve des membres de cette 

famille dans toutes les espèces, allant des procaryotes aux eucaryotes. L’analyse de séquence et les éléments 

communs semblent indiquer que les différents transporteurs ABC proviennent d'une protéine ancestrale commune 

(Saurin et al., 1999). 

En utilisant l'hydrolyse de l'ATP, ces transporteurs sont capables de transporter à travers les membranes cellulaires 

des éléments très variables tels que des acides aminés, des peptides, des protéines, des ions organiques et 

inorganiques, certaines toxines, voir même des antibiotiques. 

Sur le plan structural, la présence de deux domaines pouvant lier l'ATP, les domaines NBD (Nucleotides Binding 

Domains), est une caractéristique des membres de cette famille. La topologie membranaire exacte des 

transporteurs ABC est difficile à déterminer car on connaît seulement la structure cristalline de la protéine HisP 

(Histidine Perméase bactérienne) et du domaine F1 de l'ATPase mitochondriale (Hung et al., 1998; Annereau et al, 

1997a). 

On retrouve trois séquences caractéristiques très conservées chez les membres de cette famille : 

- Les séquences Walker A et B, qui sont les sites de liaison de l'ATP. Bien que caractéristiques, ces séquences ne 

sont pas spécifiques des transporteurs ABC car on les trouve dans beaucoup de protéines ATPases. 

Walker A : G/A-X4-G-K-T/S 

Walker B : R/K-X3-G-X3-L-h4-D 

- Une séquence C particulière aux transporteurs ABC, utilisée pour déterminer l’appartenance d’une protéine à 

cette superfamille. Cette " signature " très spécifique aux membres de cette famille, est située entre les sites 

Walker. 

Séquence C : L-S-X-G-X-R. (La lettre X désigne n’importe quel acide aminé, la lettre h désigne un acide aminé 

hydrophobe). 

Les régions membranaires déterminent le type de molécules transportées, et l’énergie d’hydrolyse de l’ATP sur les 

domaines NBD sert à la translocation des diverses molécules à travers les membranes. 

Bien que la structure des transporteurs ABC varie, on retrouve des éléments communs. Les transporteurs ABC 

sont fonctionnels sous forme de monomères, d’homodimères, d’hétérodimères ou de polymères. 

Parmi les transporteurs ABC les plus caractéristiques et les plus étudiés du fait de leurs implications dans 

certaines pathologies humaines, on trouve : 

1 - les protéines de type MDR (Multi Drug Resistance) comme la p-glycoprotéine ou les MRP. Ces protéines 

d'origine multi-génique sont présentes chez de nombreuses espèces. Leur structure très conservée contient un 

domaine N-terminal hydrophobe, et deux ensembles de 6 segments transmembranaires reliés chacun à un 

domaine NBD. Les MDR sont capables de transporter un grand nombre de drogues cytotoxiques, et de ce fait sont 

impliquées dans le rejet de drogues anticancéreuses. 

2 - Le canal chlorure CFTR. Sa structure est comparable à celle des MDR, mais il possède en plus un large 

domaine cytoplasmique reliant les deux sous-ensembles : segments transmembranaires et domaines NBD. Des 

mutations de ce canal sont impliquées dans une maladie génétique, la mucoviscidose.





3 - Les récepteurs aux sulfonylurés (SUR1 et SUR2), glycoprotéines présentes dans les cellules b-pancréatiques, 

les cellules cardiaques et les cellules des muscles squelettiques. Les protéines SUR sont impliquées dans la 

régulation des canaux potassium dépendants de l’ATP 

(Croop, 1998). 

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III - Régulation des canaux chlorure par les seconds messagers 

Les canaux chlorure sont présents dans toutes les cellules, de la bactérie à l'homme. Leurs fonctions et leurs 

régulations sont très variées. Beaucoup de stimuli peuvent les activer comme le calcium, l'AMP cyclique, les 

variations de pH, les ligands extra-cellulaires, et les modifications du volume cellulaire. Dans les membranes 

apicales d'une même cellule se trouvent des canaux Cl- multiples et variés. On observe généralement une 

régulation complexe du transport de Cl- impliquant à la fois des canaux sensibles au calcium et des canaux 

sensibles à l’AMPc, ou encore des régulations croisées par ces seconds messagers permettant l’activation par 

l’ATP de canaux sensibles à l’AMPc (Allert et al., 1992; Gérard et al., 1994; Stutts et al., 1994, 1995; Merlin et al., 

1998; Woo et al., 1998; Selbie et Hill, 1998). 

1 - Activation du transport de chlorure par l’AMPc 

Le transport de chlorure transépithélial peut être modulé par des variations du taux d'AMP cyclique intracellulaire 

(Frizzell et al., 1986; Gray et al., 1990; Pollard et al., 1991; Copello et al., 1993; Becq et al., 1993; Heming et al., 

1994). La conductance chlorure activée par l’augmentation du taux d'AMP cyclique étant déficiente dans les 

épithéliums CF, l'activation du canal CFTR est généralement associée à cette conductance. 

La modulation du taux de base d'AMP cyclique est le résultat de l'activation des adénylate-cyclases par la liaison 

d’un ligand sur un récepteur à 7 fragments transmembranaires couplé aux protéines G. Les protéines G permettent 

la transduction et l'amplification du signal généré par l'occupation d’un récepteur par son agoniste (Figure 6). La 

diversité des réponses obtenues provient de la régulation des différentes isoformes d’effecteurs présents dans une 

cellule. La résultante de ces stimulations multiples correspond au maintien d'un niveau de base de seconds 

messagers. La modification de ce niveau permet d’obtenir une réponse physiologique. 

Les protéines G sont associées à la membrane plasmique, du côté intracellulaire, et forment des hétérotrimères αβγ 

identifiés par leur sous-unités α (Tableau 1). Les sous-unités α sont codées par quinze gènes différents, dont 

certains transcrits subissent des épissages alternatifs. 5 gènes codent pour les sous-unités β, et 11 pour les sousunités 

γ. Un même récepteur peut être couplé à différents types de protéines G. Par exemple le récepteur β2- 

adrénergique peut se coupler aux protéines Gi ou Gs (Daaka et al.,1997). 

Mais la variabilité des signaux de transduction des différents récepteurs provient également du fait que les sousunités 

a et bg régulent différemment les nombreuses isoformes d’effecteurs exprimés dans un type cellulaire 

donné. De plus, l’effet mesuré dépendra de la distribution spatiale des protéines G, des canaux ioniques et des 

adénylate-cyclases de la cellule. En général, les récepteurs couplés aux protéines Gs entraînent une augmentation 

du taux d'AMP cyclique intracellulaire par activation des adénylate-cyclases. Les récepteurs couplés aux protéines 

Gq/11 mobilisent le calcium intracellulaire par activation des phospholipases C et accumulation d’IP3. 

Ces protéines peuvent également réguler directement des canaux ioniques comme les canaux K, Ca 2+ , et Cl - en 

modulant l’activité d’un canal ou son recyclage à la membrane par modification du transport vésiculaire, du 

compartiment endosomial vers la membrane plasmique. Les protéines Gαi2,3 interviennent dans les mécanismes 

de recyclage à la membrane plasmique des canaux CFTR et ORCC (Schwiebert et al., 1992; 1994; 1995). 

1.1 -Régulation du taux d’AMPc par les adénylate-cyclases 

Les effecteurs des protéines G régulant le taux d’AMPc sont les adénylate-cyclases (AC). Ces enzymes ont des 

structures comparables à celles des transporteurs ABC. Leur séquence comprend entre 1080 et 1148 acides 

aminés avec 92 % de similarité entre les différents sous-types. Les AC sont formées de 2 ensembles de six 

segments transmembranaires, chaque ensemble étant suivi d'un grand domaine cytoplasmique qui contient des 

sites de liaison à l'ATP. Les AC sont régulées de manière complexe par de multiples effecteurs tels que les PKC,





les sous-unités βγ et α des protéines G, ou des modifications locales du calcium intracellulaire. Les différentes 

isoformes d’AC (Tableau 2) sont classées en trois familles (Mons et Cooper, 1995; Cooper et al., 1995): 

- Le type I : comprend les adénylate-cyclases I, III, et VIII. Cette famille est peu régulée par les protéines Gα s. 

- Le type II : comprend les isoenzymes II, IV, et VII qui ne sont pas régulées par les protéines Gαi. Les AC II et IV 

peuvent être co-stimulées par les sous-unités α s et βγ des protéines Gi (Federman et al., 1992). 

- Le type V : regroupe les isoenzymes V et VI. 

2 - Activation du transport de chlorure par l’ATP 

Dans de nombreuses cellules épithéliales il existe une conductance chlorure activée par l’ATP extra-cellulaire 

distincte de la perméabilité sensible à l’AMPc. Bien qu’inconnues sur le plan moléculaire, les perméabilités 

sensibles à l’ATP et à la voie de signalisation du calcium, sont assimilées à des canaux chlorure par le fait de leur 

sensibilité aux différents agents pharmacologiques spécifiques des canaux Cl-. 

L’ATP extra-cellulaire active le transport de chlorure par sa liaison aux récepteurs P2-purinergiques couplés à la 

voie de signalisation du calcium (Marunaka, 1993; Chao et al., 1995; Sahi et al., 1996; Chan et al., 1996; Chan et 

al., 1997; Ho et al., 1997; Zeng et al., 1997). 

L’effet de l'ATP dépend de plusieurs paramètres : 

1 - du type de récepteur purinergique (P2) présent à la surface. On mesurera ainsi des différences dans l'efficacité 

de stimulation et le type de réponse obtenue, 

2 - de la présence et de l'activité d’ecto-ATPases à la surface cellulaire, 

3 - de la présence de canaux Cl- sensibles au calcium. (Figure 7). La liaison de l’ATP sur son récepteur entraîne 

l’activation de phospholipases C (PLC). Dans les cellules de mammifères, il existe plus de 10 isoformes de 

phospholipases C (PLC), regroupées en trois familles: PLC-β, PLC-δ , et PLC-γ. L’hydrolyse par les PLC des 

phosphatidylinositol 4,5 biphosphate (PIP2) d’une part, et des phosphatidylinositol 4-monophosphate (PIP) et 

phosphatidylinositol (PI) d’autre part, conduit respectivement à l'accumulation d’IP3 et de diacyl glycérol (DAG). La 

liaison de l’IP3 sur son récepteur, au niveau du réticulum endoplasmique, provoque la libération du stock interne de 

calcium. Le DAG est un activateur des PKC. 

Cette phase rapide de la réponse ATP (augmentation transitoire du niveau de calcium interne durant quelques 

secondes à une minute) est généralement suivie d’une phase lente due à l’activation des phospholipases A2 

cytosoliques (PLA2c) par le calcium interne libéré. Les PLA2c hydrolysent les phospholipides membranaires 

provoquant la libération d’acide arachidonique. Les métabolites de l’acide arachidonique vont alors activer l’entrée 

de calcium par des canaux calciques. Cette deuxième étape d’augmentation du taux de calcium interne va de 

nouveau activer les PLA2c, et les PLC (Willars, 1996). Cela conduit alors à un nouveau cycle d’activation de la voie 

de signalisation du calcium (formation d’IP3 et de DAG, libération du stock interne, activation des PLA2c). L’arrêt de 

cette stimulation est en partie due à un rétrocontrôle négatif par les PKC, dont la stimulation va conduire à une 

inhibition des PLC et à la recapture du calcium par le réticulum endoplasmique. 

Ce sont les métabolites de l’acide arachidonique et le calcium qui vont activer la sortie de chlorure au pôle apical 

des cellules épithéliales. Cette régulation du transport de chlorure par l’ATP via la voie de signalisation des 

récepteurs P2 est largement décrite dans les cellules épithéliales FRTL-5 (Fischer Rat Thyroid cell Line), (Martin, 

1992; Carrasco, 1993; Bizzarri et Corda, 1994; Shimegi et al., 1994; Törnquist et al., 1994; Ekokoski et Törnquist, 

1993; Wang et al., 1995; Laglia et al., 1996). 

2.1 - Les récepteurs purinergiques 

Dans les années 70, Burnstock propose l’existence de récepteurs extra-cellulaires spécifiques pour expliquer les 

effets physiologiques de l’adénosine (récepteurs P1) et de l’ATP (récepteurs P2). En 1985, il a proposé de 

subdiviser la famille des récepteurs P2 en deux groupes : les P2x et les P2y, à partir de leurs différences d’affinité 

aux agonistes : α,β-méthylène ATP pour les P2x et 2-méthylthioATP pour les P2y. 

La classification actuelle des récepteurs P2 est basée sur leurs voies de transduction et leurs structures (Figure 8). 

On distingue ainsi la famille des récepteurs ionotropiques (P2x), qui font partie des canaux ioniques activés par les 

ligands, de celle des récepteurs métabotropiques (P2y) couplés aux protéines G, essentiellement Gq/11 et dans 

certains cas aux protéines Gi/o. 

La famille des récepteurs P2x compte 7 membres notés P2x1 à P2x7 ayant entre 30 et 50 % d’homologie de 

séquence. Ils sont formés de 2 segments transmembranaires, et d’une large boucle extra-cellulaire contenant des





résidus cystéines conservés formant des ponts dissulfures. Les domaines NH2 et COOH sont intracellulaires et 

contiennent des sites consensus de liaison aux protéines kinases. Les récepteurs P2x s'assemblent pour former 

des hétéromultimères, et le site de liaison de l’ATP implique la boucle extra-cellulaire de plusieurs monomères. La 

pharmacologie, les cinétiques d’activation et de désactivation, et la perméabilité au calcium sont variables en 

fonction des différents sous-types de récepteurs P2x. 

La famille des récepteurs métabotropiques P2y comprend 11 membres notés P2y1 à P2y11 ayant 25 à 55 % 

d’homologie de séquence. Ils fonctionnent sous forme de monomères bien que dans beaucoup de tissus on 

observe la co-expression de plusieurs sous-types. Ces récepteurs sont formés de 7 segments transmembranaires, 

le domaine N-terminal est extra-cellulaire alors que le domaine C-terminal est intracellulaire et porte des sites de 

liaison aux protéines kinases. Les diversités structurales au niveau des boucles intracellulaires et du domaine 

COOH entre les différents sous-types influencent le couplage de ces récepteurs avec les différentes protéines G : 

Gq/11 ou Go/i. 

Les sous-types de récepteurs P2y présentent des caractéristiques pharmacologiques différentes. Les P2y1,3 et 6 

sont préférentiellement activés par les nucléotides diphosphates, alors que les récepteurs P2y2 et P2y4 sont 

seulement activés par les nucléotides triphosphates. Les signaux de transduction de ces récepteurs sont multiples, 

ils activent les PLA2, PLC, PLD et les protéines kinases. Ils peuvent être couplés positivement ou négativement aux 

adénylate-cyclases. 

D’autres sous-types de récepteurs P2 ont été décrits : 

1 - les P2T, qui sont essentiellement exprimés dans les plaquettes, et pour lesquels l’ADP est un agoniste et l’ATP 

un antagoniste. 

2 - Les P2u, qui correspondent aux P2y2 et P2y4, et ont une distribution assez large. L’ATP et l’UTP sont des 

agonistes et l’α,β-méthylène ATP ou le 2-méthylthio ATP sont sans effet. Ce sous-type de récepteur P2 peut se 

coupler aux protéines Gq/11 ou aux protéines Gi/o sensibles à la toxine de pertussis (Mosbacher et al., 1998). 

Comme ils sont présents à la membrane apicale des cellules épithéliales des voies respiratoires chez l’homme, une 

attention particulière est donc portée sur les récepteurs P2y2 dans les études menées sur les épithéliums 

respiratoires de phénotype CF (Abbracchio et Burnstock, 1998). 

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Troisième partie - Le canal CFTR : 

I - Structure du canal : 

1 - Topologie membranaire : 

Le canal CFTR est une glycoprotéine composée de 1480 acides aminés. L’analyse de séquence indique la 

présence de deux fois six segments transmembranaires putatifs (TMD), et trois domaines intracellulaires : deux 

domaines de liaison aux nucléotides notés NBD1 et NBD2 (Nucleotide Binding Domain), et un domaine régulateur 

R. D’après les profils d'hydrophobicité, 80 % des acides aminés sont dans le cytoplasme, 16% dans les segments 

transmembranaires et 4% dans les boucles extra-cellulaires. Les domaines N et C terminaux de la protéine sont 

cytoplasmiques (Akabas et al., 1997; Tuesnàdy et al., 1997). 

La topologie membranaire exacte du canal CFTR est encore incertaine car les seules structures tridimensionnelles, 

disponibles pour les membres de la superfamille des transporteurs ABC, dont CFTR fait partie, sont celles de la 

protéine HisP (Histidine Perméase bactérienne) et du domaine F1 de l'ATPase mitochondriale. 

Les premières représentations de l’insertion du canal CFTR dans la membrane plasmique, menées par 

comparaison avec les modèles de protéines contenant des domaines de liaison à l’ATP, étaient essentiellement 

basées sur la structure de l’adénylate-kinase (ADK), bien que l’on ne trouve que 12% d’homologie dans les 

séquences conservées, entre le domaine NBD1 du canal CFTR et le domaine de liaison à l’ATP de l’ADK. Les 

modèles plus récents sont basés sur des comparaisons avec l’ATPase-F1. Dans ce cas, on trouve 28% 

d’homologie entre le domaine NBD1 du canal CFTR et les domaines NBDa et NBDb de l’ATPase (Hung et al., 

1998; Annereau et al., 1997a; Annereau et al., 1997b; Bianchet et al., 1997). En opposition avec le modèle 

généralement proposé (Figure 9), des études montrent qu’après purification et incorporation dans une bicouche 

lipidique, le domaine NBD1 isolé (résidus 426-588) peut fonctionner comme un canal Cl- (Arispe et al., 1992). Cela 

suggère que ce domaine soit capable de s'insérer dans la membrane plasmique, avec une portion extra-cellulaire. 

Sur le plan structural, NBD1 ressemble à l’histidine perméase bactérienne (HisP), dont les domaines de liaison à 

l’ATP sont accessibles du coté extra-cellulaire (Baichwal et al., 1993). L’expression de NBD1 dans des cellules 

épithéliales montre qu’il peut s’insérer dans la membrane et créer une conductance Cl- (Clancy et al., 1997). Les 

domaines NBD1 et NBD2 exprimés dans des cellules d'insectes (Hi5) sont accessibles du côté extra-cellulaire 

(Gruis et al., 1997). 

Les nombreuses études qui se poursuivent actuellement permettront certainement, dans les années à venir, de 

connaître avec plus de certitude la topologie membranaire exacte du canal CFTR. 

2 - Les différents domaines du canal CFTR et leurs fonctions 

La connaissance des intéractions entre les différents domaines fonctionnels est essentielle pour la compréhension 

de la régulation et de la fonction du canal CFTR. 

2.1 - Le domaine régulateur (R) 

Ce domaine correspond aux résidus 590 à 831 codés par l’exon 13. Il est très spécifique du canal CFTR puisque 

les autres membres de la famille ABC ne possèdent pas de domaine régulateur. 

La phosphorylation du domaine R par les protéines kinases A et C (PKA, PKC) est un prérequis à l'ouverture du 

canal par le MgATP (Riordan et al., 1989). L’état déphosphorylé du domaine R maintient le canal fermé alors que 

des modifications de conformation interviennent dans le passage à l’état ouvert (Cotten et Welsh, 1997). 

Ce domaine est en fait composé de 2 sous-domaines : 

1 - RD1, allant des résidus 590 à 672. Cette séquence très conservée dans les différentes espèces est impliquée 

dans la maturation de la protéine ainsi que dans l'ouverture du canal en modulant des interactions dynamiques 

entre le domaine NBD1 et les sites de phosphorylation du domaine R (Pasyk et al., 1998). 

2 - RD2, pour les résidus 672 à 831 (Dulhanty et Riordan, 1994) correspond, à l’inverse, à une séquence très





variable entre les espèces. Les résidus serines phosphorylables sont compris dans cette portion du domaine R, ce 

qui lui confère un rôle important dans le fonctionnement du canal CFTR. 

2.2 - Les domaines transmembranaires (Figure 10) 

Par analogie avec les autres protéines canalaires, on considère que les domaines transmembranaires (TMD1 et 

TMD2), interviennent dans la formation du pore. Alors que le domaine TMD2 est peu impliqué, TMD1 joue un rôle 

important dans la conductance et dans la sélectivité (Devidas et Guggino, 1997). Les segments membranaires M1, 

M5, M6, et M12 sont impliqués dans la zone formant le pore (Tabcharani et al., 1992; McCarthy et al., 1993; 

McDonough et al., 1994; Schwiebert et al., 1998). M1 et M6 ont une structure secondaire essentiellement formée 

d’une hélice α dont une des faces est exposée dans la lumière du canal. (Akabas et al., 1994; Akabas et al., 1997). 

De plus, des changements de conformation du segment M6 (passage d’une hélice α à un feuillet β) influent sur la 

sélectivité et l'ouverture du canal (Wigley et al., 1998). 

2.3 - Les domaines de liaison aux nucléotides (NBD) 

Dans la séquence des NBD se trouvent les sites consensus de liaison à l'ATP, Walker A et B (Walker et al., 1982), 

ainsi qu’une séquence commune à tous les transporteurs ABC : LSGGQXQR (ou motif C). Le motif C est situé à la 

surface des domaines NBD, proche des sites de liaison de l'ATP (Clancy et al., 1997). La structure secondaire des 

NBD (Figure 11 et Figure 12) consiste essentiellement en un feuillet β (60-70 %) central, entouré par des hélices α 

(10 %). Selon les auteurs, les limites des domaines NBD1 et NBD2 varient légèrement. Pour NBD1 la limite 

inférieure varie du résidu F434 (codé par l'exon 9) à L441, et la limite supérieure est comprise entre I586 (codé par 

l'exon 12) et K684 avec une extension possible jusqu'à F650. Le domaine NBD2 est formé des résidus L1127 à 

L1480 (Bianchet et al., 1997). 

Les deux domaines NBD coopèrent dans la régulation des mécanismes d'ouverture et de fermeture ATPdépendents 

du canal CFTR. NBD1 est impliqué dans l’ouverture du canal, alors que NBD2 est impliqué dans les 

deux événements. La liaison de l’ATP sur NBD2, qui possède une activité ATPasique faible (Bianchet et al., 1997), 

entraîne un changement de conformation de NBD1. Il a été proposé que l'ATP et le GTP puissent se lier sur le 

même site (Randak et al., 1996). NBD2 pourrait se comporter comme une sous-unité liant le GTP, et a été comparé 

aux sous-unités α des protéines G. 

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II - Les multiples fonctions du canal CFTR 

1 - Les propriétés du canal 

1.1 - conductance et sélectivité 

En déterminant la relation courant-voltage (I/V), pour un canal unitaire dans un milieu symétrique (même 

composition ionique de part et d’autre de la membrane), on obtient une droite dont la pente est la conductance 

unitaire (g). On peut également par cette relation définir le potentiel d’inversion du courant (Erev) pour lequel le flux 

des ions est nul. Les mesures de conductance d’un canal, et sa séquence de perméabilité donnent des 

informations sur les propriétés du canal. En effet, les intéractions entre les ions perméants et le pore du canal 

dépendent de leurs propriétés physiques et de leurs structures respectives. CFTR forme un canal anionique 

permettant la diffusion passive des ions chlorure. La portion extra-cellulaire du canal ne présente pas de sélectivité 

anionique et le site précis ainsi que le mécanisme de sélectivité de charge sont inconnus (Dawson et al., 1999). 

CFTR est hautement sélectif pour les anions plutôt que pour les cations monovalents, bien que cette sélectivité soit 

imparfaite : le Cl- est 10 à 20 fois plus perméant que Na+ (Anderson et al., 1991b; Bear et al., 1991). Les ions qui 

sont facilement déshydratés tendent à être plus perméants que les ions qui retiennent plus fortement l'eau 

d'hydratation . 

Les boucles intracytoplasmiques qui relient les segments transmembranaires impliqués dans la formation du pore, 

ne participent pas directement aux mouvements des ions. À l’inverse, les résidus de la boucle extra-cellulaire 1, 

influencent la sélectivité du canal (Seibert et al., 1997). 

La partie du pore la plus resserrée a un diamètre d'environ 5,3 Å (Hanrahan et al., 1998). La conductance du canal 

varie entre 6 et 11pS en fonction du type cellulaire, de la température, et de la concentration des ions. 

La séquence de perméabilité du canal CFTR est : Br - >Cl - >I - >F - . Cette séquence distingue CFTR des autres 

canaux chlorure épithéliaux, dans lesquels la perméabilité de l'iodure est plus importante que celle du chlorure 

(Sheppard et Welsh, 1999). Cependant, dans les domaines transmembranaires la mutation de résidus basiques en 

résidus acides, modifie la séquence de perméabilité, transformant CFTR d'un canal de faible, en un canal de forte 

perméabilité à l'iodure, avec une nouvelle séquence : I - >Br - > Cl - > F - . Ce qui correspond à la séquence proposée 

par J.A. Tabcharani et collaborateurs (1997). Les recherches menées par P. Linsdell et collaborateurs, montrent 

que des ions différents peuvent passer en même temps à travers le pore (Linsdell et al., 1997a). Le résidu R347, 

dans le segment transmembranaire 5, sert vraisemblablement de filtre de sélectivité anionique. Il intervient dans le 

transport multi-anionique en formant des intéractions de charge (Tabcharani et al., 1993; Wigley et al., 1998). Des 

mutations du résidu T338, dans le segment transmembranaire M6, altèrent l'intéraction entre l'ion perméant et le 

pore du canal. Les thréonines T338 et T339 procurent une stabilité de structure à l'hélice a 6 grâce à des ponts 

hydrogènes intra-hélice (Linsdell et al., 1998c). 

2 - Régulation des mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal CFTR. 

La durée d'ouverture du canal est variable en fonction de la température et du modèle cellulaire considéré. Ceci 

représente certainement les différences d’expression des isoenzymes pouvant réguler CFTR dans une cellule 

donnée. Pour des températures physiologiques (35°C) la durée d'ouverture du canal CFTR est comprise entre 100 

et 250 ms. Les mécanismes qui contrôlent l’ouverture et la fermeture sont des événements séquentiels, impliquant 

des étapes de phosphorylation suivies de la liaison et l’hydrolyse du MgATP. Le modèle de base sur lequel les 

études structure-fonction s’appuient propose que des changements de conformation du domaine R, après 

phosphorylation, permettent le passage des ions chlorure. La levée de l'inhibition imposée par l'état déphosphorylé 

du domaine R stimule l'interaction entre l'ATP et les domaines NBD.





On distingue deux étapes dans l’ouverture du canal : 

1 - La phosphorylation du domaine R. Son degré de phosphorylation détermine la probabilité d’ouverture. Bien que 

les résidus phosphorylables du domaine R soient connus, les résidus impliqués dans les mécanismes d’ouverture 

et de fermeture du canal sont incertains (Hwang et al., 1993; Hwang et al., 1994). 

2 - La liaison et l’hydrolyse de l’ATP sur les sites NBD. Elle entraîne une modification conformationnelle des 

domaines transmembranaires du canal CFTR. L’hydrolyse des nucléotides triphosphates est indispensable à 

l’ouverture du canal, et la phosphorylation préalable par la PKA augmente cette réaction. Le canal déphosphorylé 

est incapable d'hydrolyser l'ATP. Sur des membranes excisées, après phosphorylation par les PKA, le canal peut 

être ouvert par les nucléotides triphosphates mais pas par les analogues non hydrolysables de l’ATP, l'ADP ni 

l’AMPc (Schultz et al., 1995). 

L'hydrolyse de l'ATP représente l’étape limitante à la fois pour l’ouverture et la fermeture du canal. Ces deux 

événements interviennent sur des sites différents d'une même molécule. Le domaine NBD1 est le site d’hydrolyse 

de l'ATP couplé à l'ouverture du canal et le domaine NBD2 est le site d’hydrolyse de l'ATP permettant la fermeture 

du canal. Dans des expériences de protéine de fusion, les activités ATPasiques ont été localisées sur les résidus 

433-589 pour le domaine NBD1, et 1208-1399 pour le domaine NBD2 (Seibert et al., 1997; Mathews et al., 1998). 

L’hydrolyse de l'ATP sur les domaines NBD du canal CFTR est plus lente que celle des autres ATPases. Cette 

vitesse de réaction correspond d’avantage à celle de l'hydrolyse du GTP au niveau des sous-unités a des protéines 

G. En 1995, MR Carson et MJ Welsh ont comparé les domaines NBD du canal CFTR aux sous-unités a des 

protéines G. Sur le plan structural, le motif C spécifique des transporteurs ABC ressemble fortement au site 

catalytique des GTPases (motif D-X-[G/A]-G-Q). De plus, la liaison et l’hydrolyse de l’ATP sur les domaines NBD du 

canal CFTR contrôlent la durée d’ouverture et de fermeture du canal, de même que la liaison et l’hydrolyse du GTP 

contrôlent la durée d’activation des protéines G (Gadsby et Nairin, 1999; Foskett et al., 1998). 

2.1 - Phosphorylation par les PKA et les PKC 

La première étape de l’activation du canal passe par une phosphorylation par les PKA. In vitro (canal isolé), on 

trouve cinq résidus serines, phosphorylés par la PKA, situés dans le domaine R: 660, 700, 737, 795, et 813. Il 

existe probablement sur ce domaine d'autres résidus pouvant être phosphorylés par les PKA in vivo (dans les 

cellules intactes). La phosphorylation sur le domaine R se produit avec une stœchiométrie de 5 à 6 mol/mol après 

une exposition limitée à la PKA. Les cinétiques de phosphorylation sont influencées par la structure locale de la 

protéine CFTR, ainsi que par la proximité et l'activité sélective des phosphatases endogènes de la cellule. Sur un 

canal isolé, la PKC phosphoryle le domaine R avec une stœchiométrie de 2 mol/mol, essentiellement sur les 

résidus sérines 686-790. Et dans les cellules CHO et Calu-3, la PKCe, régule CFTR (Liedtke et Cole, 1998). La 

phosphorylation du canal CFTR par les PKC semble stimuler une phosphorylation ultérieure par la PKA (Yurkomauro 

et al., 1998) puisque l'inhibition de la phosphorylation par les PKC prévient une phosphorylation ultérieure du 

canal CFTR par la PKA. Ces données suggèrent qu'une phosphorylation de base par les PKA et les PKC soit 

nécessaire pour entraîner l'activation du canal, en agissant sur des sites de phosphorylation essentiels ou que les 

PKC activent CFTR indirectement par des phosphorylations au niveau du cytosquelette ou des vésicules de 

transport. 

2.2 - Régulation du canal CFTR par les protéines phosphatases 

Très rapidement, après phosphorylation par les PKA, la déphosphorylation par des protéines phosphatases inactive 

le canal. A l’inverse, l’inhibition des protéines phosphatases endogènes, augmente l'efficacité de stimulation du 

canal CFTR et ralentit son retour à l'état désactivé. Mais peu de choses sont connues sur la spécificité avec 

laquelle ces différentes phosphatases déphosphorylent les phosphosérines du canal CFTR 

Chez les eucaryotes, les quatre principaux types de protéines phosphatases sérine/thréonine solubles sont codés 

par les membres de deux familles de gènes. Les protéines phosphatases PP1, PP2A, et PP2B appartiennent à la 

famille des PPP, dont la spécificité de substrat est modulée par différentes sous-unités régulatrices. PP2C 

appartient à la famille PPM de protéines phosphatases dépendantes du magnésium et qui ne possèdent pas de 

domaine de régulation. Les phosphatases PP2A et PP2C sont critiques pour la régulation du canal CFTR. Ces 

enzymes comportent des motifs d'ancrage à la membrane, permettant la co-localisation avec CFTR (Becq et al., 

1993). La protéine PP2A provoque une déphosphorylation quasi complète du canal CFTR et les phosphatases 

endogènes PP2C sont des régulateurs puissants de l'activité du canal CFTR. Leurs effets sur l'ouverture et la 

fermeture du canal unitaire sont distincts de ceux de la PP2A, mais similaires à ceux des phosphatases endogènes 

dans les cellules CHO, BHK, et T84. L’association de plusieurs phosphatases est nécessaire pour la désactivation 

complète du canal CFTR (Luo et al., 1998). Le canal CFTR excisé à partir de cellules CHO ou de cellules 

respiratoires humaines, est désactivé par l’action de phosphatases associées à la membrane. Il est activée par des 

inhibiteurs de phosphatages (Becq, et al., 1994). Cette régulation a également été montrée dans le cas de 

certaines mutations comme R117H, G551D et dF508. 

2.3 - Régulation par l’ATP 

Une fois phosphorylé, l'ouverture du canal nécessite de l'ATP cytosolique et du magnésium. En absence d’ATP, le 

canal CFTR phosphorylé se ferme. L’ADP et les analogues non-hydrolysables de l’ATP inhibent l’activation par





l’ATP, de manière compétitive, par interaction spécifique sur le domaine NBD2 (Riordan, 1993). Bien que, l’AMP- 

PNP ne puisse pas ouvrir le canal CFTR phosphorylé, une fois le canal ouvert il peut s’y lier fortement et le bloquer 

dans cette conformation pour quelques minutes. La liaison de l’AMP-PNP se produit probablement au niveau de 

l’extrémité C-terminale du domaine NBD (Gadsby et al., 1998). Bien que, la probabilité d'ouverture du canal 

augmente en fonction de la concentration en ATP intracellulaire, c’est le rapport entre ATP et ADP qui est le plus 

important dans la régulation du canal CFTR. Des changements dans l'état métabolique de la cellule qui modifient 

ce ratio régulent l'activité du canal (Welsh et Anderson, 1993). 

3 - Régulation par les seconds messagers 

L'activation du canal CFTR par la protéine kinase A est stimulée par l'AMPc. Le niveau d'AMPc est contrôlé par la 

balance entre sa synthèse par les adénylate-cyclases et son hydrolyse par les phosphodiestérases. Dans les 

cellules provenant d'épithéliums respiratoires, l'activité du canal CFTR sauvage est particulièrement sensible à 

l'activité de la phosphodiestérase de type III. L'inhibition de ce type de phosphodiestérase élève considérablement 

le niveau d'AMPc intracellulaire, entraînant une augmentation importante de l'efflux de chlorure (Kelley et al., 1995). 

Il est également possible d’activer le canal CFTR par des mécanismes indépendants de l’AMPc. Une étude menée 

dans des cellules provenant de carcinomes mammaires de souris C127i, transfectées avec le gène codant pour le 

canal CFTR humain, a montré que l’ATP extra-cellulaire peut activer le transport de chlorure. La stimulation du 

canal CFTR par des analogues de l'ATP suggère une stimulation impliquant les récepteurs P2 purinergiques 

(Cantiello et al., 1994). Dans des cellules CFPAC transfectées avec le gène codant pour la protéine CFTR 

sauvage, il a été noté que le transport de chlorure est régulé par le récepteur P2y2, ainsi qu’une implication des 

récepteurs adénosine. Cependant, ces résultats ne peuvent pas exclure la possibilité d'une interaction directe de 

l'adénosine sur CFTR (O’Reilly et al, 1998). 

4 - CFTR et transport d'ATP : divergences sur le thème Ces dernières années une nouvelle hypothèse 

sur une des multiples fonctions attribuées à la protéine CFTR a été émise par les chercheurs des groupes de HF 

Cantiello, JF Engelhardt et WB Guggino, selon laquelle le canal CFTR serait perméant à l’ATP. Les observations 

montrent que les cellules qui expriment de manière endogène ou après transfection le canal CFTR (les cellules 

mammaires C127i, pulmonaires Calu-3, pancréatiques CFPAC, ou encore intestinales T84 et Caco-2) sécrètent de 

l’ATP après activation de la voie de signalisation de l’AMPc. Dans le cas de la mutation dF508, ils ne constatent 

plus de sortie d’ATP stimulée par l'AMP cyclique. Le rôle physiologique attribué au transport d’ATP par CFTR est la 

régulation du pH intracellulaire et la libération d’acide arachidonique après activation de la voie de signalisation des 

récepteurs P2 purinergiques. Ces récepteurs de haute affinité à l’ATP sont exprimés dans de nombreux épithéliums 

et notamment dans ceux exprimant le canal CFTR (Cantiello et al., 1997). 

A l’inverse, un grand nombre de laboratoires montrent qu’indépendamment d’une sécrétion cellulaire d’ATP, il n’y a 

pas de conductance ATP dépendante de l’AMPc à travers le canal CFTR. La différence de sécrétion d'ATP en 

fonction de la présence ou de l’absence du canal CFTR dans les épithéliums, est provoquée par des stimulations 

mécaniques des cellules indépendamment du canal CFTR (Grygorczyk et Hanrahan, 1997; Watt et al., 1998). Par 

ailleurs, sur des cellules issues de systèmes épithéliaux non respiratoires, on ne retrouve pas de conductance 

unitaire ou macroscopique de l'ATP associée à CFTR. Enfin, des études sur des canaux CFTR incorporés dans 

des bicouches lipidiques (bilayer) montrent que ce canal ne transporte pas l'ATP (Li et al., 1996b). 

L’ensemble de ces résultats montrent que les mécanismes ou les régulations de la sécrétion ou du transport d'ATP, 

sont certainement très différents en fonction du type d'épithélium étudié. Une hypothèse avancée pour expliquer 

ces divergences est qu’un canal présent dans les solutions purifiées du canal CFTR, fonctionne comme une 

protéine transportant l'ATP. Deux possibilités sont alors avancées : 1°) un autre canal conduisant l'ATP de manière 

spécifique serait associé à CFTR dans ces vésicules, 2°) CFTR nécessiterait un signal additionnel ou des 

régulateurs qui permettraient le transport d'ATP (Schwiebert et al., 1999). Dans ce sens des études menées sur les 

cellules MDCK, démontrent la présence d'un canal ATP concomitant avec la présence du canal CFTR (Sujita et al., 

1998). 

5 - Les autres types de perméabilités 

La complexité des mécanismes de régulation du canal CFTR et l’importance des dysfonctionnements observés 

dans les épithéliums de phénotypes CF, font émerger des hypothèses mettant en cause d’autres fonctions pour 

CFTR que le seul transport de chlorure. 

La perméabilité d’anions polyatomiques de taille connue, a été étudiée dans les cellules CHO transfectées de 

manière stable avec le gène CF humain codant pour le canal CFTR sauvage. Les anions polyatomiques testés du 

côté externe, donnent la séquence de perméabilité suivante NO3- > Cl - >HCO3-> formate> acétate. A l’inverse, le 

pyruvate, le propanoate, le méthane sulfonate, l'éthane sulfonate, et le gluconate ne sont pas perméants, quel que 

soit le côté de la membrane duquel ils sont testés. La perméabilité dépend de l'énergie d'hydratation des ions 

(Linsdell et al., 1997b). 

Le canal CFTR est également perméant au tripeptide glutathion : g-glutamyl-cystéinyl-glycine (GSH), qui 

représente l’antioxydant extra-cellulaire le plus abondant dans les poumons. Ils contiennent environ 400μM de 

GSH, ce qui représente cinquante fois la concentration trouvée dans le plasma et 100 fois celle trouvée dans les





fluides de beaucoup d'autres tissus. La concentration en GSH dans les épithéliums présentant un phénotype CF est 

fortement réduite (Linsdell et Hanrahan, 1998a). 

Le canal CFTR permet également le passage de manière très asymétrique d'anions organiques de grande taille 

uniquement lorsqu’ils sont présents du côté intracellulaire. Cette asymétrie n'est pas observée avec des anions plus 

petits. Les inhibiteurs d'ATPases, qui bloquent le canal en configuration ouverte, détruisent cette asymétrie, 

permettant l'influx de gros anions. L'hydrolyse de l'ATP est donc nécessaire au maintien de l’asymétrie (Linsdell et 

Hanrahan, 1998b). 

Le transport de GSH et l'efflux d'anions organiques de grande taille représentent de nouvelles fonctions 

physiologiques pour le canal CFTR. 

6 - CFTR régulateur de la conductance membranaire 

Avant qu’on ne lui reconnaisse des fonctions de canal chlorure, on attribuait surtout à CFTR des propriétés de 

régulation de la conductance membranaire (Stutts et al., 1997; Egan et al., 1995). 

6.1 - Régulation du canal ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channel) 

L’ORCC est un canal chlorure régulé par l'AMPc dont on a longtemps pensé qu’il pouvait être la protéine, impliquée 

dans la régulation de la conductance membranaire, déficiente dans la mucoviscidose. Les études d’interactions 

entre CFTR et d’autres canaux ioniques membranaires montrent que la présence du canal CFTR fonctionnel est 

indispensable à l'activation du canal ORCC par les PKA. Dans les systèmes de membranes artificielles, CFTR 

régule le canal ORCC par des interactions membranaires ou cytoplasmiques (Scwiebert et al., 1999). EM 

Schwiebert et collaborateurs, proposent également que l’intéraction entre CFTR et le canal ORCC dans les cellules 

épithéliales, soit liée à un mécanisme autocrine/paracrine impliquant l'ATP. Nous avons démontré que l'expression 

du canal CFTR dans des cellules d’insectes de type Hi-5, confère au canal ORCC endogène une sensibilité à la 

glibenclamide, qui est un inhibiteur spécifique du canal CFTR (Julien et al., 1999). 

6.2 - Régulation du canal sodium épithélial (ENaC): 

L’absorption accrue de sodium, dans les épithéliums respiratoires CF, montre un contrôle négatif du canal sodium 

épithélial sensible à l’amiloride par CFTR (Mall et al., 1998). 

Des études récentes montrent que les domaines NBD1 et R du canal CFTR interagissent directement avec la partie 

C-terminal du canal ENaC exprimé chez la levure, ou dans des fibroblastes transfectés de manière stable avec ces 

deux canaux. 

Plusieurs possibilités sont avancées pour expliquer la régulation négative du canal ENaC par CFTR : 

1 - les transporteurs de la famille ABC, de type MDR (Multi Drug Resistance), peuvent transporter des substrats 

comme les phospholipides à travers les membranes. Donc des messagers phospholipidiques, pourraient jouer un 

rôle dans la modulation du canal ENaC par CFTR; 

2 - cela serait directement le résultat de l’interaction entre CFTR et certaines sous-unités du canal ENaC. 

3 - CFTR et le canal ENaC pourraient interagir grâce à des éléments du cytosquelette associés à la membrane. 

Cette interaction serait impliquée dans la capacité du canal CFTR à interférer avec la régulation par la PKA du 

canal ENaC. Ces 2 canaux peuvent être affectés par des interactions avec le cytosquelette, notamment le 

cytosquelette d'actine. 

6.3 - Régulation des canaux potassium (K) 

CFTR est non seulement capable de réguler directement, ou indirectement d'autres canaux ioniques, mais aussi de 

transférer des effets modulateurs d’agonistes et d'antagonistes sur d'autres protéines. 

Les sulfonylurés, sont des inhibiteurs de canaux K sensibles à l'ATP. Or, le composé sulfonyluré glibenclamide 

inhibe l'activité du canal CFTR, ce qui suggère un lien entre CFTR et la famille des canaux K sensibles à l’ATP. Les 

canaux K sont exprimés dans beaucoup de tissus. La sensibilité aux sulfonylurés des canaux K pancréatiques, est 

conférée par la protéine SUR, une protéine de liaison aux sulfonylurés, membre de la famille des transporteurs 

ABC, et les sulfonylurés tels que la glibenclamide et le tolbutamide sont utilisés contre le diabète. La protéine SUR, 

est une molécule de 140 kDa, qui a les caractéristiques pharmacologiques d'un récepteur de haute affinité. 

Contrairement au canal CFTR qui cumule à la fois des fonctions de transport de chlorure et de régulateur de la 

conductance membranaire, la protéine SUR exprimée seule, ne montre pas d'activité canalaire, suggérant qu'elle 

se comporte seulement comme un régulateur des canaux ioniques. 

Les canaux K sensibles à l'ATP, sont un sous-groupe de la superfamille des canaux K rectifiants entrants (KIR). 

Les canaux KIR ont été identifiés sur la membrane basolatérale des cellules des épithéliums respiratoires, où ils 

interviennent dans le recyclage du potassium. Dans les cellules CFPAC, on a montré que la présence du canal 

CFTR, influence l’activation par l’AMPc des canaux potassium épithéliaux (Loussouarn et al., 1996). Il a récemment 

été suggéré que des canaux K similaires existent sur la membrane apicale des cellules épithéliales des voies 

respiratoires. Un membre de cette famille a été identifié dans le poumon: ROMK1. La famille des canaux ROMK est 

constituée de plusieurs isoformes de canaux K sensibles à l'ATP. Le canal ROMK2 présente une sensibilité faible





et très variable aux composés sulfonylurés tels que la glibenclamide. Par leur co-localisation dans le canal 

collecteur du rein, il est possible que le canal CFTR régule l'activité du canal ROMK2. 

CFTR pourrait êt re couplé avec ROMK1 ou ROMK2, dans la membrane cellulaire, procurant un domaine 

manquant à ces canaux et, restaurant ainsi une sensibilité aux sulfonylurés. Les mécanismes qui contrôlent les 

interactions entre CFTR et ROMK2 pourraient impliquer une protéine de régulation ou des éléments du 

cytosquelette. 

La phosphorylation atténue la réponse aux sulfonylurés et altère les interactions entre CFTR et ROMK2. De la 

même manière que pour les interactions entre CFTR et les canaux ORCC ou ENaC, l’interaction entre CFTR et 

ROMK2 nécessite la présence du domaine NBD1 du canal CFTR fonctionnel (McNicholas et al., 1996). Des études 

récentes suggèrent la possibilité d'un complexe formé entre le canal CFTR et le canal ROMK1 (Ho et al., 1998). 

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III - Régulation de la protéine CFTR 

1 - Biosynthèse de la protéine 

Le gène codant pour la protéine CFTR est localisé sur le chromosome 7, dans la bande Q 31. Il mesure 250 kb et 

comprend 27 exons. A l’état naturel, il est synthétisé peu de protéine CFTR, moins de 1000 copies par cellules 

(Chang et al., 1998). Dans les cellules épithéliales, l’ARNm du canal CFTR (6,5 kb) est traduit en une protéine 

membranaire de 1480 acides aminés, contenant une séquence signal, non-clivable, dont dépend son adressage à 

la membrane apicale (Chen et Zhang, 1996). En positions 894 et 900 se trouvent deux sites potentiels de liaison 

d’olygosaccharides, ce qui donne une forme mature de la protéine de 168 kDa. Seule la protéine mature pourra 

gagner la surface pour former un canal chlorure (Kopito et al., 1999). 

Durant sa maturation dans le réticulum endoplasmique la protéine CFTR est associée aux protéines chaperonnes 

HSP 70. La maturation de la protéine CFTR sauvage est peu efficace, seulement 30% des précurseurs 

nouvellement synthétisés seront transformés en molécules matures. En effet, 70 % du précurseur sauvage et 100% 

des précurseurs mutés dont le repliement est incorrect sont rapidement dégradés (demi-vie de 20 à 40 minutes) par 

le proteasome, après ubiquitination, avant d'atteindre l’appareil de Golgi (Jensen et al., 1995). La durée de la liaison 

entre CFTR et les protéines chaperonnes HSP, ainsi que l’étape de libération des ribosomes, module la 

dégradation cytosolique du canal CFTR (Ward et al., 1995). Le blocage des protéines immatures au niveau du 

réticulum est un phénomène sensible à la température, et aux mutations dans le domaine NBD1 (Kopito, 1999). Le 

faible taux de maturation de la protéine CFTR n’est pas une caractéristique des transporteurs ABC dont certains 

atteignent un degré de maturation de 100%, dans des modèles cellulaires recombinants comme les cellules de la 

lignée HEK 293. 

Après la dissociation de la protéine CFTR avec les protéines chaperonnes, elle acquiert sa structure 

tridimensionnelle. 20 à 40% de la protéine mature transite alors vers l'appareil de Golgi. Au cours de sa biosynthèse 

la protéine passe par différentes étapes de glycosylation. D'abord synthétisée sous forme d'un précurseur (135 kDa 

mesuré en gel d’électrophorèse) contenant des chaînes olygosaccharidiques sensibles à l'endoglycosidase H, le 

précurseur donne ensuite naissance à une forme mature (150 à 160 kDa) contenant des chaînes 

olygosaccharidiques complexes et résistantes à l'endoglycosidase H. 

2 - Localisation de la protéine fonctionnelle 

Le canal CFTR fonctionnel est principalement localisé sur la membrane apicale des cellules épithéliales polarisées. 

Cependant le canal est également fonctionnel dans les membranes d’autres compartiments cellulaires : 

- En l’absence de jonctions serrées, les cellules perdent leur polarisation. La protéine CFTR fonctionnelle est alors 

retenue au niveau du réseau trans-golgien (Morris et al., 1994; Pasky et al., 1997). 

- Dans les bordures en brosse (Benharouga et al., 1997), et majoritairement dans les endosomes de cellules 

rénales (Crawford et Maloney, 1998). 

- Enfin, dans les membranes nucléaires, CFTR peut être associé à un canal régulé par l’ATP (Pasky et al.,1997). 

3 - Mécanismes d’endocytose et exocytose 

La dégradation de la protéine CFTR est un phénomène lent (plus de 24 heures). A l’inverse, son endocytose est un 

mécanisme rapide, avec 50% d’internalisation en quelques minutes. CFTR interagit alors avec les complexes 

adaptateurs spécifiques de la membrane plasmique (Bradbury et al., 1994). 

Dans les cellules épithéliales, la présence de la protéine CFTR endogène a été détectée dans les vésicules





enrobées de clathrine ainsi que dans les endosomes (Webster et al., 1994). Et son activité canalaire est impliquée 

dans la régulation des mécanismes de fusion des endosomes (Biwersi et al., 1996). Dans ces cellules, les 

mécanismes d'endocytose et d'exocytose du canal CFTR sont régulés par l'AMP cyclique. L’activation du canal par 

l'AMPc a un effet inhibiteur sur son endocytose (Bradbury et al., 1992; Prince et al., 1994). Cette régulation permet 

d'augmenter la quantité de canaux CFTR présents à la membrane apicale, à partir d’un stock interne constant. Cela 

apporte un mécanisme additionnel à la stimulation directe du transport de chlorure par l'AMPc (Wei et al., 1996). 

3.1 - Interactions avec le cytosquelette 

Le cytosquelette joue un rôle très important dans le maintien de la polarité des cellules épithéliales. Plus 

particulièrement, le cytosquelette d'actine semble avoir un rôle central dans le contrôle de la sécrétion 

d’électrolytes. En effet, la dépolymérisation des filaments d’actine module la vitesse de passage du canal CFTR de 

la membrane apicale vers les compartiments internes (Morris et al., 1997) par un mécanisme indépendant de l’AMP 

cyclique, et impliquant une interaction directe entre l'actine, des protéines associées à l'actine et CFTR (Cantiello et 

al., 1996). A partir d’observations montrant que sa séquence contient des sites potentiels de liaison à l’actine, la 

protéine CFTR peut être considérée comme une nouvelle protéine de liaison à l’actine (Prat et al., 1995). 

3.2 - Rôle des protéines Gi 

Les protéines de liaison au GTP (protéines G) régulent toute une variété de canaux ioniques, incluant les canaux 

Cl-, directement au niveau membranaire et indirectement par les seconds messagers et les protéines kinases. E.M 

Schwiebert et collaborateurs ont montré que, dans les épithéliums respiratoires, les protéines Gα-i2 sont inhibitrices 

du transport de chlorure par le canal CFTR (Schwiebert et al., 1992). Les Gα-i2 régulent le transport des vésicules 

vers la membrane apicale. Leur inhibition par la toxine de pertussis stimule l’exocytose du canal CFTR, ce qui 

restaure le transport de chlorure dans des cellules isolées, provenant de patients atteints de mucoviscidose 

(Schwiebert et al., 1994). 

4 - Modification des régulations cellulaires par CFTR 

4.1 - Systèmes d’expression 

Beaucoup de lignées cellulaires non-épithéliales ont été utilisées, en tant que systèmes d’expression hétérologues, 

pour l’étude de la fonction, de la structure et de la biosynthèse de la protéine CFTR (Chang et al., 1998). Ces 

systèmes sont également utilisés pour produire de la protéine en grande quantité pour l’analyse in vitro, après 

purification du canal. Cependant de nombreuses difficultés subsistent, liées aux différents modèles cellulaires 

utilisés. 

4.2 - Problèmes liés à la surexpression 

Une des principales difficultés rencontrée dans l’étude du canal CFTR, est le faible taux d’expression endogène, 

rendant difficile les études structure-fonction menées sur le canal purifié. L’expression dans les bactéries, qui 

permettrait de disposer de la protéine en grande quantité, s’est avérée très difficile. En effet, cela provoque une 

forte diminution de la croissance des clones, et une toxicité de nature incertaine, attribuée à une séquence en aval 

de l’exon 6. 

Dans les modèles eucaryotes, l’hyper-expression du canal CFTR affecte profondément les caractéristiques 

physiologiques des cellules. Par injection intranucléaire d’ADNc du canal CFTR, R. Mohammad-Panah et 

collaborateurs montrent que l’hyper-expression du canal CFTR perturbe la physiologie des épithéliums. Les canaux 

CFTR sont activés en permanence, ne sont plus régulables par l’AMPc, et surtout perdent leurs propriétés de 

régulation des autres canaux ioniques (Mohammad-Panah et al., 1998). Ces modifications ont également été 

observées dans d’autres modèles cellulaires comme NIH/3T3 (Stutts et al., 1993). On ne connaît pas les raisons de 

l’activation permanente du canal CFTR dans les cas de surexpression. Le même phénomène est observé dans le 

cas du canal potassium KV1.3 (modification des caractéristiques du courant et de la pharmacologie). L’explication 

qui paraît la plus probable est l’existence de formes constitutivement actives du canal CFTR en proportion très 

faible dans les système d’expression endogène, l’hyper-expression permettrait de visualiser ces canaux. 

4.3 - Les changements de pH intracellulaire 

Les modifications observées dépendent des cellules utilisées. Là encore on retrouve dans les nombreux travaux de 

recherche, concernant la régulation de la protéine CFTR, des contradictions en fonction des modèles cellulaires. La 

présence du canal CFTR (endogène ou transfecté) peut conduire à une acidification du pH du cytoplasme ou des 

endosomes. 

Les cellules exprimant la P-glycoprotéine (Multi Drug Resistance) ont un pHi plutôt alcalin et la co-expression du 

canal CFTR et MDR tend à rééquilibrer le pH cellulaire (Wei et al., 1995; Wei et al., 1997). L’activation par l’AMPc 

du canal CFTR exprimé dans les cellules CFPAC (Elgavish et al., 1991), les fibroblastes NIH 3T3 et les cellules 

épithéliales mammaires C127 (Poulsen et al., 1994), conduit également à une acidification du pHi. 

Dans les cellules coliques épithéliales T84 et les fibroblastes Swiss 3T3, l’activation du canal CFTR abaisse le pH





des endosomes (Biwersi et al., 1994). 

A l’inverse, dans les endosomes (précoces et tardifs) des cellules L transfectées, CFTR ne modifie pas 

l’acidification, soit que le canal n’est pas fonctionnel dans ces compartiments, soit qu’il manque un cofacteur (Root 

et al., 1994). Dans le cas de cellules exprimant le mutant dF508 (qui est dégradé au niveau du réticulum 

endoplasmique) il n’y a pas de différence de pH dans les endosomes ni dans le compartiment trans-golgien par 

rapport aux cellules transfectées avec le gène sauvage (Dunn et al., 1994; Seksek et al., 1996). 

Il a été suggéré que CFTR régule le mouvement des vésicules de transport indépendamment de son activité sur le 

pHi. L’activation du canal CFTR par la forskoline, dans les cellules fibroblastiques 3T3, induit une augmentation de 

la fusion des endosomes de 1.3 à 2.65 fois en moins de 10 minutes. Ce mécanisme est indépendant d’une 

augmentation de l’endocytose ou de l’acidification des endosomes et nécessite un transport de chlorure (Biwersi et 

al., 1996). 

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IV - Les mutations du canal CFTR 

1 - Les différentes classes de mutations 

Le gène codant pour la protéine CFTR impliquée dans la mucoviscidose à été découvert en 1989, et depuis, plus 

de 700 mutations ont été recensées dans ce gène. La plupart sont des mutations ponctuelles qui impliquent 

seulement quelques nucléotides. La fréquence des mutations varie selon les populations avec une distribution 

reflétant probablement des différences dans leur apparition durant l'évolution, dans les pressions de sélection 

exercées et dans la migration des populations. Bien que cela soit rare, plusieurs mutations peuvent apparaître sur 

le même chromosome et deux changements sur le même allèle peuvent provoquer des phénotypes plus sévères 

ou au contraire avoir un effet de compensation. 

Dans certaines populations, un petit nombre de mutations représentent la majorité des allèles CF. La plupart des 

mutations sont rares et spécifiques de certaines familles. Les tests de détection sont donc réalisés en fonction des 

mutations essentielles recensées dans une population. Dans les populations caucasiennes et nord-européennes, la 

mutation ΔF508 apparaît avec une fréquence allélique de 67%. Cette mutation représente 48% des allèles CF dans 

la population afro-américaine et 30% dans les populations américaines d’origine asiatique. La présence de cette 

mutation dans les populations américaines natives est rare. 

Dans l’ensemble des mutations recensées, 40% sont des mutations faux-sens, 18% des mutations non-sens, 18% 

des mutations altèrent des codons essentiels pour l’épissage, 22% des mutations modifient le cadre de lecture, les 

2% restant correspondent à des mutations localisées dans le promoteur ou à des délétions dans le cadre de 

lecture. 

Les mutations sont classées en 6 groupes correspondant aux dysfonctionnements moléculaires observés 

(Figure 13) : 

I - Les mutations nulles, pour lesquelles il n’y a pas de protéine. Cela correspond à un défaut de synthèse, il n'y a 

pas de transcription du gène en ARNm stable ni ayant la bonne longueur. Cela entraîne une perte de fonction. 

Environ 50% des mutations du canal CFTR affectent la synthèse de l'ARNm. 

II - La deuxième classe de mutations correspond à un défaut de maturation de la protéine. La protéine 

mutante n'est donc pas adressée au bon endroit, en général elle reste localisée dans le cytoplasme. Dans ce cas 

encore, très peu de protéines fonctionnelles arrivent à la membrane apicale des épithéliums. La mutation ΔF508 est 

incluse dans cette classe. 

III - Les protéines mutées sont présentes à la membrane apicale. Ces mutants sont correctement synthétisés et 

localisés, mais ne peuvent pas être activés ou ont une fonction de canal Cl- anormale. 

Dans la classe III sont incluses les mutations G551D et G551S situées dans le domaine NBD1 et S1255P et 

G1349D dans le domaine NBD2, qui modifient la liaison et l'hydrolyse de l'ATP ainsi que la phosphorylation du 

domaine R. 

IV - Cette classe correspond à des mutations qui affectent la conductance et les mécanismes d'ouverture et 

de fermeture du canal. Certaines sont localisées dans les domaines transmembranaires formant le pore du canal. 

V - Les mutations de la classe 5 influencent la quantité d’ARNm ayant une longueur totale correcte, ainsi 

que la quantité de protéines fonctionnelles. Cette classe inclut des mutations dans le promoteur et des 

mutations qui modifient l'épissage alternatif ou provoquent une synthèse de la protéine inefficace. 

VI - La 6ème classe correspond à des mutations qui affectent la régulation des autres canaux par CFTR


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(Pileweski et Frizzell, 1999; Mickle et al., 1998). 

Sur le plan clinique, la relation génotype/phénotype est très difficile à établir, due à la faible représentation de 

beaucoup de mutations et aux effets environnementaux modifiant le phénotype vrai. De plus, un même phénotype 

peut correspondre à des désordres cellulaires différents (Fanen et al., 1997). D'où l’intérêt de développer des 

modèles animaux ou cellulaires pour étudier ces relations. 

2 - La mutation ΔF508 

Cette mutation de classe II est responsable de 70 % des cas de mucoviscidose. Les homozygotes sont 

diagnostiqués à un âge très précoce par des insuffisances pancréatiques et un taux élevé de NaCl dans la sueur 

(Ward et al., 1994). 

Localisé dans le domaine NBD1 (codé par l'exon 10), cette délétion d’une phénylalanine en position 508, ne modifie 

pas le cadre de lecture et n’a pas d’effet sur la liaison de l’ATP. La mutation perturbe le repliement du domaine 

NBD1 et empêche la maturation complète de la protéine. ΔF508 est probablement impliquée dans des interactions 

hydrophobes critiques pour assurer un repliement correct et une bonne structuration tridimensionnelle de la 

protéine, avant la structuration des sites de liaison à l'ATP (Qu et al., 1997). 

Dans les systèmes d'expression exogène transfectés avec des ADNc codant pour la protéine CFTR portant la 

mutation ΔF508 (CFTR-ΔF508), on obtient une protéine non glycosylée, localisée dans le cytoplasme (Demolombe 

et al., 1994). L'absence de glycosylation suggère que la protéine n'entre pas dans l’appareil de Golgi. Elle est 

dégradée dans le réticulum endoplasmique par le proteasome et d'autres complexes protéolytiques. La rétention de 

la protéine dans le réticulum endoplasmique, compartiment cellulaire dans lequel la protéine est fonctionnelle 

(Pasyk et Foskett, 1995), est due au moins en partie, aux protéines chaperonnes de type "heat-shock protein" (HSP 

70) et la calnexine (Jiang et al.,1998). Cependant, lorsqu’elle est correctement adressée à la membrane plasmique, 

la protéine CFTR-ΔF508 fonctionne comme un canal chlorure activé par l'AMP cyclique (Frizzell et al., 1995). 

Les propriétés du canal mutant, étudié après insertion dans des membranes artificielles, ne sont pas différentes de 

celles de la protéine sauvage. Par contre, des études menées sur la protéine exprimée à la membrane de cellules 

de mammifères, montrent des différences fonctionnelles comme un temps de fermeture du canal plus long. Dans 

les cellules d’insectes, comme dans les oocytes de xénopes, il n'a pas été constaté d’arrêt dans la maturation du 

canal CFTR- ΔF508. Probablement à cause de la faible température à laquelle sont maintenues ces cellules, ce qui 

crée un système permissif pour l’adressage à la membrane (Riordan, 1993). La combinaison de certains agents 

pharmacologiques comme la forskoline et le milrinone (inhibiteur de phosphodiestérases de classe III), permettent 

une restauration partielle du transport d'électrolytes médié par CFTR dans les épithéliums de souris homozygotes 

pour la mutation ΔF508 (Kelley et al., 1997). 

La mutation R553M corrige, in vitro, le défaut de repliement dû à la mutation ΔF508. In vivo, le double mutant 

ΔF508/R553M corrige seulement partiellement le transport à la membrane, et la protéine mature n’est que 

partiellement fonctionnelle. 

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V - Pharmacologie du canal CFTR 

Pour rétablir le transport de chlorure dans les épithélium CF, de nombreuses stratégies ont été développées. à côté 

des études de thérapie génique, d’activation de canaux environnants autres que CFTR, ou encore de modulation 

des processus d'adressage membranaire, un ensemble d'études porte sur des drogues pouvant améliorer le 

transport de chlorure par CFTR (Figure 5). Cette pharmacologie a pour but l'amélioration du transport de chlorure 

par activation directe des canaux CFTR présents à la membrane ou encore par activation indirecte en agissant sur 

des récepteurs membranaires environnants. à côté de l'apport de ces études dans la compréhension de la 

pathologie et dans l'amélioration des traitements de malades atteints de mucoviscidose, la pharmacologie, par 

l’étude des modes d’action des molécules utilisées, permet également d’améliorer nos connaissances sur la 

régulation du canal et sur son rôle dans les mécanismes de régulations cellulaires 

Parmi les molécules testées, on distingue d'une part les molécules capables d'inhiber le canal, qui sont des 

bloqueurs du canal CFTR, et d'autre part des molécules pouvant activer le canal, appelées ouvreurs. Malgré cette 

dénomination des différentes molécules testées, on ne dispose pas à ce jour d’une pharmacologie spécifique. En 

effet, les études pharmacologiques sur le canal CFTR sont menées à partir de molécules dont les effets portent sur 

des récepteurs membranaires, des seconds messagers, voir même à partir de molécules dont on ne connaît que 

des effets physiologiques généraux sur le transport d’électrolytes à travers les épithéliums. De ce fait, on ne connaît 

généralement pas précisément les mécanismes par lesquels les activateurs ou les inhibiteurs modulent la sortie de 

chlorure par le canal CFTR. 

Depuis quelques années, nous avons pour objectif l’étude des relations structure/fonction de molécules activatrices 

du canal CFTR afin de déterminer les bases structurales de l’effet de ces molécules (dérivés xanthines et MPB) sur 

le transport de chlorure et la détermination de leur mode d’action. 

1 - Les activateurs du canal CFTR (Figure 14) 

La génistéine : ce composé fait partie de la classe des flavonoïdes naturels. 

C’est l’inhibiteur de l’activité tyrosine kinase du récepteur à l’EGF le plus puissant dans cette classe de molécules. 

La génistéine agit par un mécanisme compétitif avec l’ATP (Ki : 13.7 μM), et peut se lier aux récepteurs adénosine 

(Ki = 5 μM). Par ailleurs, par son action sur la topoisomérase II, la génistéine intervient dans les cassures de l’ADN 

et donc probablement dans l’apoptose. 

Cette molécule est également un puissant activateur du canal CFTR dont le mécanisme a beaucoup été discuté. 

Elle n’agit pas par une activation des protéines kinases A, C ou G car il n'y a pas d'augmentation d’AMPc 

intracellulaire, de calcium, ou de GMPc. Il est nécessaire d'avoir de l'ATP et une phosphorylation préalable du canal 

CFTR par les PKA pour avoir un effet de la génistéine (Weinreich, et al., 1997). On constate alors un maintien de 

l’état ouvert du canal, peut-être par inhibition de l’effet des phosphatases, ou une interaction directe au niveau des 

domaines NBD sur les sites de liaison à l’ATP. 

En ce qui concerne les protéines CFTR mutées, la génistéine n'a pas d'effet direct sur le mutant ΔF508, mais en 

présence d'AMP cyclique ou de forskoline, on observe une forte synergie d’activation du transport de chlorure 

(Hwang et al., 1997). La stimulation combinée de génistéine et de forskoline permet également l'activation de 

certains mutants comme G551D qui sont présents à la membrane mais non activables par la forskoline seule. 

L’idée générale qui se dégage pour le mode d’action de cette molécule est celle d’une action directe sur le canal, 

au niveau des domaines NBD. Cependant cette interprétation des résultats ne correspond pas aux effets observés 

avec la mutation ΔF508, pour laquelle on peut supposer un effet de la génistéine sur l’adressage. 

Le NS-004 : C'est un benzimidazolone substitué. 

Ces molécules ont d'abord été définies comme des ouvreurs des canaux K à large conductance dépendants du





calcium, les canaux BK ou maxi K. A l’inverse, ils inhibent les canaux Kv, ainsi que des canaux calcium voltagedépendants. 

Les effets du NS-004 sur le canal CFTR sont assez proches de ceux de la génistéine. Cette molécule active le 

canal, même en présence d’inhibiteurs de PKA, pour des concentrations comprises entre 0,1 et 1 μM, et le mutant 

ΔF508 pour des concentrations supérieures à 10 μM, sans augmenter la concentration en AMP cyclique. Le NS- 

004 est décrit comme un ouvreur du canal CFTR. Bien que la probabilité d'ouverture des canaux phosphorylés 

augmente en présence de NS004, cette molécule n'a pas d'effet sur le canal CFTR après qu'il se soit 

spontanément désactivé. In vitro le NS004 n'inhibe pas les protéines phosphatases (Schultz et al., 1999) . 

Le milrinone : c'est un inhibiteur de phosphodiestérases de type III. Il a été proposé que le milrinone stimule CFTR 

en augmentant le taux d'AMPc intracellulaire. Cependant le mode d'action exacte de cette molécule n'a pas encore 

été déterminé. Le milrinone active à la fois le canal sauvage et le canal mutant ΔF508. Il a un effet additif sur 

l’activation des canaux CFTR par la forskoline ou par des agonistes de l'AMP cyclique ce qui suggère un 

mécanisme indépendant de la voie de l’AMPc. Des études récentes menées in vivo sur des souris transgéniques 

ainsi que des essais cliniques sur des sujets humains atteints de mucoviscidose, concluent que le milrinone n’induit 

pas la sécrétion de chlorure dans les voies aériennes CF (Smith et al., 1999). 

Les inhibiteurs de protéines phosphatases 

La régulation du canal CFTR implique des étapes de phosphorylation et de déphosphorylation. L’inactivation 

spontanée du canal qui conduit à sa fermeture est induite par l'action de protéines phosphatases sur le domaine 

régulateur. 

Parmi les activateurs du canal CFTR on trouve des composés capables d'inhiber les phosphatases, ce qui permet 

le maintien du canal à l'état ouvert. Différents inhibiteurs de phosphatases ont donc été testés, principalement sur 

des fragments membranaires excisées provenant de cellules CHO transfectées avec le gène codant pour la 

protéine CFTR, ou encore de cellules épithéliales des voies respiratoires humaines. Ces études conduisent à deux 

types de résultats. D'une part, l’utilisation de ces molécules permet d'avoir une activation spontanée du canal, sans 

stimulation préalable de la voie AMPc, ceci dans le cas de la protéine sauvage et dans le cas de protéines mutées 

présentes à la membrane. D’autre part, la classification de l'efficacité de ces inhibiteurs de phosphatases est : 3- 

isobutyl 1-méthyl xanthine (IBMX) > Br-tétramisol (dérivé du lévamisol) > vanadate > théophylline > ATP > 

calyculine A > acide okadaique > leupeptine (Becq et al., 1994; Becq et al., 1996). 

Les dérivés benzimidazolones : ce sont des régulateurs de la conductance K 

La conductance K au niveau des membranes basolatérales joue un rôle important dans la sécrétion apicale du 

chlorure. La modulation des canaux K sensibles aux calcium (Kca) par différentes drogues a donc été envisagée 

afin d'améliorer le transport de chlorure. Les molécules testées sont des dérivés des benzimidazolones, les 

benzoxazoles : chlorzoxazone et zoxazolamine, ainsi que des ouvreurs de canaux Kca comme le 1-EBIO. Par 

augmentation de la conductance K basolatérale, ces dérivés permettent le maintien de la sécrétion de chlorure 

dans les voies respiratoires humaines (Shultz et al., 1999). 

Les psoralènes 

Les psoralènes sont des composés naturels que l'on trouve dans une grande variété de plantes. Ils sont connus 

depuis très longtemps comme inducteurs de la re-pigmentation de la peau après une exposition solaire. L'utilisation 

la plus fréquente des psoralènes est le traitement des psoriasis, et de nombreuses photodermatoses. Cependant le 

mécanisme sous-tendant cet effet thérapeutique est inconnu. Une explication réside peut-être dans la capacité des 

psoralènes de s’intercaler dans la double hélice d'ADN inhibant ainsi la réplication, ce qui par conséquent bloque la 

prolifération cellulaire. Cette propriété a été utilisée dans les techniques de transfert de gènes utilisant des vecteurs 

viraux rendus non pathogènes et non réplicatifs après une exposition combinée aux ultraviolets et aux psoralènes. 

Les virus inactivés par les psoralènes sont utilisés dans les études de thérapie génique. 

Un des psoralènes les plus utilisés : le 8-MOP, est un puissant inhibiteur du cytochrome P450, des canaux K 

sensibles à l'ATP et " delayed rectifier " des cellules b pancréatiques. Par comparaison avec certains inhibiteurs de 

ces canaux K tels que la glibenclamide et le tolbutamide ayant un effet connu d’inhibition du canal CFTR, les 

psoralènes ont été testés sur le transport de chlorure. Le 8-MOP augmente la sécrétion de Cl- uniquement lorsque 

la conductance K est stimulée par le calcium. L’augmentation du transport de chlorure observée est due au canal 

CFTR (Devor et al., 1997). 

Le sodium 4-phénylbutyrate (4PBA) 

C’est un régulateur de la transcription. Cette molécule, représente une classe assez particulière d’agents 

pharmacologiques utilisés dans la restauration des défauts de transport de chlorure. Contrairement aux molécules 

décrites plus haut, le 4PBA a pour effet l'augmentation du nombre de canaux CFTR-ΔF508 présents à la membrane





cellulaire, par un mécanisme d’échappement au système de dégradation des protéines. Son mode d'action est 

inconnu mais semble différent de celui du butyrate qui est un régulateur de l'expression du gène CFTR. Bien que 

cette molécule soit déjà utilisée en thérapie humaine pour les traitements de pathologies dues à des désordres 

dans le cycle de l’urée, son efficacité et son utilité dans le traitement de la mucoviscidose restent à démontrer 

(Rubenstein et al., 1997). 

2 - Les inhibiteurs du canal CFTR (figure 15) 

Les sulfonylurés et diarylsulfonylurés 

Les composés de cette famille ont été étudiés et développés dans un premier temps pour leurs effets sur la 

régulation de la glycémie. Le composé ayant la plus haute affinité (< 1nM): la glibenclamide, est un agent de 

régulation de l’hypoglycémie. L'effet des sulfonylurés sur la sécrétion d'insuline pancréatique est médié par 

l’inhibition de canaux K sensibles à l'ATP. 

L’inhibition du canal CFTR par la glibenclamide est sensible au pH et dépend du voltage et de la concentration en 

chlorure externe. Son demi-effet est de l'ordre de 30 mM (Sheppard et Robinson, 1997). Glibenclamide et 

tolbutamide diminuent la probabilité d'ouverture de manière dose-dépendante par des interactions directes avec le 

canal. Le site d’interaction supposé est situé dans le pore du canal, ce qui entraîne une compétition avec les ions 

Cl-. Des analyses cinétiques montrent que la glibenclamide et le tolbutamide interagissent exclusivement avec le 

canal dans son état ouvert et interrompent le transport de chlorure. 

Du fait de son interaction directe avec le canal, la glibenclamide est très souvent utilisée comme contrôle de 

l'implication du canal CFTR dans un transport de chlorure donné. Cependant, les effets de la glibenclamide doivent 

être étudiés et analysés avec précaution car, pour des concentrations < 10nM la glibenclamide peut agir sur la 

protéine SUR et pour des concentrations μM, la glibenclamide peut avoir de multiples effets, notamment l’inhibition 

de canaux K et chlorure, ainsi que de nombreuses enzymes dont les PKA. 

Dans le même groupe de molécules, les diarylsulfonylurés ont une sélectivité beaucoup plus grande et un effet 

beaucoup plus important sur l’inhibition du canal CFTR. Leur mode d'action est comparable à celui de la 

glibenclamide et du tolbutamide par interactions avec l'état ouvert du canal (Schultz et al., 1999). 

Les arylaminobenzoates 

Le DPC et l’acide flufénamique sont décrits comme étant des bloqueurs du canal CFTR. Ils bloquent l'ouverture du 

canal lorsqu'ils sont exposés directement sur la face intracytoplasmique. Ce blocage est totalement réversible est 

implique une liaison au niveau de résidus des domaines transmembranaires 6 et 12 formant le pore. 

Le MOPS : 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid 

Cette molécule serait capable d’entrer dans le pore du canal lorsque celui-ci commence à s’ouvrir, suite à 

l’hydrolyse de l’ATP sur le domaine NBD1, par des liaisons au niveau de résidus bordant le pore, bloquant ainsi la 

conduction des anions à mi-parcours. 

L’étude de cette inhibition un peu particulière du transport d’anion dans le canal CFTR permet de mieux 

appréhender les questions de régulation des processus séquentiels d’ouverture et de fermeture du canal (Ishihara 

et Welsh, 1997). 

3 - Les dérivés xanthines 

Les méthylxanthines telles que la caféine, la théophylline, et la théobromine sont des composés naturels que l’on 

trouve dans certaines plantes comme le café, le thé ou le cacao et donc dans les boissons fabriquées à partir de 

ces plantes. 

Des analyses sur les effets, notamment de la caféine, ont été réalisées chez les adultes, et récemment, l’attention a 

également été portée sur les effets des méthylxanthines chez les enfants et les adolescents. Ces analyses sont 

primordiales lorsque l'on considère l'utilisation de telles molécules dans le traitement de pathologies comme la 

mucoviscidose qui atteignent les enfants et les jeunes adultes. 

Des études épidémiologiques menées aux Etats-Unis montrent que, comme pour les adultes, une large majorité 

d’enfants consomment de la caféine chaque jour, principalement à travers les boissons. Les méthylxanthines sont 

très bien absorbées par l’organisme. Après ingestion orale, 99 % de la caféine est absorbée en 45 minutes avec 

une demi-vie de 4h. Le pic de concentration plasmatique de la théophylline apparaît en 1,5 à 2 heures avec une 

demi-vie de 6h et la demi-vie de la théobromine est de 7h. Les méthylxanthines sont distribuées dans tout le corps, 

elles peuvent traverser la barrière placentaire et sont retrouvées dans le lait maternel. Leur élimination se fait grâce 

au métabolisme du foie. Ainsi, les drogues qui entrent en compétition pour les enzymes de dégradation vont tendre 

à augmenter la demi-vie des méthylxanthines, à l’inverse, les drogues qui induisent ces enzymes vont tendre à faire 

diminuer la demi-vie des méthylxanthines.





En dehors des effets de stimulation sur le système nerveux central, la famille des alkylxanthines est aussi connue 

pour ses effets sur la relaxation des muscles lisses, notamment au niveau bronchial (effet broncho-dilatateur), la 

stimulation des muscles cardiaques et un effet diurétique. Au niveau cellulaire, de multiples effets sont observés : la 

mobilisation du calcium intracellulaire pour des doses très élevées de xanthines, l’inhibition de phosphodiestérases, 

l’inhibition des phosphatases, et l’inhibition des récepteurs à l’adénosine. 

Les effets sur le comportement humain des méthylxanthines sont principalement attribués à l’antagonisme du 

récepteur adénosine, bien que les tentatives pour reproduire les effets de la caféine en modulant les récepteurs 

adénosines n’aient pu le démontrer (Hughes et Hale, 1998). 

Une des xanthines la plus étudiée est l’IBMX. Cette molécule est capable d'activer à la fois le canal CFTR sauvage 

et la protéine mutée, avec cependant une efficacité moins importante. L’IBMX a des effets multiples, c’est un 

inhibiteur de phosphatases et de phosphodiestérases. Sur des membranes excisées, ou des vésicules 

membranaires, on enregistre une importante activation du courant chlorure en présence d’IBMX, principalement 

due à une inhibition des phosphatases membranaires, et par conséquent une diminution de la désactivation 

spontanée des canaux CFTR. 

L'activation du canal par inhibition des phosphodiestérases, inhibition de phosphatases, ou une liaison directe au 

canal CFTR des alkylxanthines reste à déterminer (Schultz et al., 1999). 

Une autre série d’alkylxanthines étudiées dans les mécanismes de régulation du transport de chlorure, correspond 

aux dérivés antagonistes des récepteurs adénosines. Cette classe de dérivés comprend des composés substitués 

en position 8, comme le 8-cyclopentyl-1,3-dipropyl xanthine (CPX), les dérivés aminés (XAC) (Jacobson et al., 

1988), et les dérivés 1,3-diallyl-8-cyclohexylxanthine (DAX). Ces dérivés augmentent l'efflux de chlorure dans des 

cellules pancréatiques exprimant le canal CFTR-ΔF508. La réponse est biphasique, les faibles concentrations (10 à 

30 nM) induisent une stimulation, et les fortes concentrations (100nM à 10mM) à l'inverse inhibent l'efflux de 

chlorure (Eidelman et al., 1992). 

Le transport de chlorure à travers le canal CFTR sauvage n'est pas modulé par le CPX ni par le XAC. Bien que les 

premières études l’aient laissé supposer, l'action de ces deux composés sur le canal ΔF508 ne passe 

vraisemblablement pas par un antagonisme des récepteurs adénosine. Les dérivés DAX et CPX se lient 

directement au domaine NBD1 du canal CFTR (Kd = 17nM pour NBD1-ΔF508 et Kd = 1nM pour le NBD1 sauvage) 

et améliorent la fréquence et la durée d’ouverture du canal ainsi que son incorporation dans des bicouches 

lipidiques (Arispe et al., 1998). Une classification dans la capacité de liaison au domaine NBD1 a été proposée 

(Cohen et al.,1997). 1) Pour le domaine NBD1 sauvage : DA-CPX > DAX > CPX > caféine > adénosine >> IBMX > 

2-thio CPX. 2) Pour le domaine NBD1-ΔF508 : DAX > CPX > caféine > DA-CPX > adénosine >> IBMX >2-thio CPX. 

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http://www.123bio.net/revues/vchappe/tab1.html 




La mucoviscidose - Tableau 1 :





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La mucoviscidose - Tableau 2 : 

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http://www.123bio.net/revues/vchappe/fig1.html 




La mucoviscidose - Figure 1 : 

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La mucoviscidose - Figure 6 :





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3/27/2009





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Figure 13 : les différentes classes de mutations de la protéine CFTR : Les mutations de la protéine CFTR sont 

regroupées en différentes classes. Cela correspond aux étapes de biosynthèse de la protéine perturbées par les 

mutations, ou à une perte de fonction du canal CFTR. 

Merci à Nicole ZSÜRGER pour la figure.





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3/27/2009





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