DNA Extraction & Inhibition Control Real-Time PCR - Diagenode ...

DIA-EIC/DNA-050
III. PCR Reaction Set-up (ABI 7000, Icycler Biorad)
25 µl -------------------- master mix 2X
(non inclus: Taqman® Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems (Roche))
5 µl ---------------------- amorces et sonde pour le contrôle ADN d’Extraction & d’Inhibition
5 (or 10) µl ------------- amorces et sonde pour le pathogène humain recherché
5 (or 10) µl ------------- échantillon
Eau si nécessaire.
-----------------------------------
50 µl ---------- Volume final
Attention :
Un nouveau mix doit être préparé pour toute nouvelle PCR. Un master mix (non inclus) et
amorces/sondes incluses dans le kit doivent être placés dans la glace pendant la préparation de
la PCR.
IV. Real Time PCR Instrument Set Up
‣ Système PCR Temps Réel ABI 7000
1. « Open a New File ».
2. Sélectionner « suivant » et cliquer « Next ».
a. Assay: Absolute
b. Container: 96-well plate
c. Template: Blank
3. Cliquer OK.
4. Sélectionner « Detectors ». Si nécessaire, créer de nouveaux détecteurs avec les configurations
« reporter et le quencher » montré ci-dessous.
Detector name Reporter Quencher
DIA-DNA/EIC(YD)-050 Yellow Dye Vic (none)
DIA-DNA/EIC(DR)-050 Orange Dye NED (none)
DIA-DNA/EIC(Cy5)-050 Cy5 Cy5 (none)
5. Sélectionner Passive Reference: Rox.
6. Cliquer Next.
7. Selectionner wells et ajouter les 2 detecteurs pour les puits utilisés.
8. Cliquer Next.
9. Vérifier la configuration en utilisant le « Well Inspector » dans « le Set Up Tab ». Vérifier
que les reporteurs and quenchers sont configurés correctement et que la référence
passive est Rox.
10. Sélectionner « Instrument Tab » et définir le « Thermal Profile » comme décrit cidessous:
Stage Description
1 2 minutes à 50° C (1 cycle)
2 10 minutes à 95° C (1 Cycle)
3 Cycle program (40 Cycles)
Step 1: 15 secondes à 95° C
Step 2: 1 minute à 60° C
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