DNA Extraction & Inhibition Control Real-Time PCR - Diagenode ...

DIA-EIC/DNA-050
II. Sample Extraction/DNA Isolation
Diagenode suggère plusieurs méthodes d’extraction pour éviter au maximum la présence
d’inhibiteurs de PCR.
• Nuclisens EASYMAG System (Biomerieux)
Echantillons cliniques: prélèvement nasal, crachats, lavage broncho-alvéolaire.
Les procédures de pré-extraction suivantes sont recommandées :
Préparation pour sang total:
• Collecter le sang total dans un tube traité à l’EDTA.
NB: le tube contenant l’échantillon ne doivent pas être laissé à température ambiante plus de 4h
(24 heures à + 4° C) jusqu’aux manipulations suivantes.
• Utiliser 100 µl de sang total pour la procédure d’extraction (Nuclisens Lysis
Buffer).
Préparation de plasma provenant du sang total:
• Collecter le sang total dans un tube traité à l’EDTA.
• Centrifuger 15 minutes à 1,000 g.
• Ouvrir le tube et collecter délicatement la fraction de plasma without disturbing
the buffy coat layer, transférer le plasma dans un nouveau tube de stockage.
NB: Si l’échantillon ne peut être utilisé dans les deux heures, le stocker à -20° C ou -70° C.
• Utiliser 100 µl - 1ml de plasma pour la procédure d’extraction (Nuclisens Lysis
Buffer).
Préparation de sérum provenant du sang total:
• Collecter le sang total dans un tube sec.
• Laisser le tube à température ambiante jusqu’à la coagulation complète.
• Séparer le sérum par centrifugation 15 min./1,000g.
• Ouvrir le tube and transférer le sérum dans un nouveau tube de staockage.
NB: Si l’échantillon ne peut être utilisé dans les deux heures, le stocker à -20° C ou -70° C.
• Utiliser 100 µl-1ml de sérum pour la procédure d’extraction (Nuclisens Lysis
Buffer).
Expertoration, lavage broncho-alvéolaire (LBA):
• 250 µl de crachats
• Ajouter 250 µl de tampon protéinase K (1mg/ml protéinase K, 0,5% SDS, 20
mM Tris-HCl, pH 8.3), vortexer
• Laisser incuber 60 min. à 55°c
• Utiliser les 500 µl de crachats pour la procédure d’extraction (Nuclisens Lysis
Buffer)
Prélèvement de gorge (isolation totale des acides nucléiques):
• Ajouter 1 ml d’une solution saline à l’échantillon, vortexer
• Incuber 1 min. à température ambiante, vortexer
• Essorer l’écouvillon sur le coté du tube puis le retirer.
NB: Si aucune autre manipulation n’est réaliser le même jour, l’échantillon doit être stocké à
-70°C.
• Utiliser les 200µl ainsi obtenus pour la procédure d’extraction (Nuclisens Lysis
Buffer)
Page 5 of 12