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Protéines : Structures, Fonctions1. Classifications structurales et évolutives des protéines2. Bioinformatique Structurale. Regard structural sur l’évolution moléculaire• Analyses des séquences de protéines• Evolution des séquences et des structures• Utilisation des bases de données en biologie3. Reconnaissances macromoléculaires :• Protéases• Récepteurs nucléaires• Interactions acides nucléiques – protéines4. Introductions aux méthodes de détermination de structures 3D5. La biologie structurale dans le processus de découverte de nouveauxcomposés à actions thérapeutique.Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les ProtéasesReconnaissances macromoléculaires :Étude structurale de grandes familles de protéines.1. Généralités.• Les 4 grandes classes de protéases• Les bases de données de protéases2. Les protéases à sérine• Mécanisme catalytique• Les 2 familles3. Les protéases à sérine de type trypsine• Repliement• Poche de spécificité4. Les protéases à sérine de type subtilisine• Repliement• Corrélation structure – fonction• Mutagenèse dirigéeStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les ProtéasesHydrolyse d'une liaison peptidique.L’activité protéolytique :- présente dans tous les organismes- vitale pour le fonctionnement normal d’un organismeReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les ProtéasesL’activité protéolytique :• Implications dans de nombreux processus physiologiques :– Réplication, différentiation cellulaire, morphogenèse, angiogenèse,apoptose, homéostasie…• Assure un contrôle fin et approprié des réactions biologiques dans lesorganismes• Santé humaine– Implications dans la colonisation, la croissance, la prolifération denombreuses bactéries pathogènes– Un mauvais contrôle de l’activité protéolytique est impliqué dans denombreuses maladies(cancers, maladies cardiovasculaires et neurodégénératives,…)– Environ 600 protéases identifiées dans le génome humainTurk B., "Targeting proteases: successes, failures and future prospects".2006, Nat Rev Drug Discov. Sep;5(9):785-99Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

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Les Protéases• Hydrolyse d'une liaison peptidique :– Endo-peptidases– Exo-peptidases• 4 (5) grandes classes selon le mécanisme d'action et lanature des groupements impliqués.– 4 manières de réaliser la même réaction– Pas de liens évolutifs entre les 4 classesStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Turk Nature Reviews Drug Discovery 5, 785–799 (September 2006) | doi:10.1038/nrd2092Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les Protéases4 (5) grandes classes :1. Protéases à sérine / thréonine2. Métallo-protéases3. Protéases acides4. Protéases à cystéine (thiol)Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les 4 grandes classes de protéases1. Protéases à sérine / Thréonine• Un groupement -OH agit comme nucléophile attaquant la liaisonpeptidique à couper• Nécessité d’acides aminés supplémentaires :– “ Triade catalytique " : Ser, His, Asp• 2 familles, 2 repliements différents, même mécanisme catalytique• Famille de la trypsine, chymotrypsine• Ser 195 , Asp 102 , His 57• Famille de la subtilisine• Ser 221 , Asp 32 , His 64• " Diade catalytique " : Ser, Lys2. Métallo protéases3. Protéases acides4. Protéases à cystéine (thiol)Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les Protéases4 grandes classes :1. Protéases à sérine / Thréonine2. Métallo-protéases• Ion divalent catalytique : Zinc (Co 2+ ,Mn 2+ )– Exemple : thermolysine3. Protéases acides• 2 Acides aspartiques– Exemples : pepsine, protéases virales• 1 acide glutamique4. Protéases à cystéine (thiol)• Nucléophile -SH• Site Actif : Cys, His• Exemples : papaine, actinidineStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les ProtéasesPour les 4 familles :État intermédiaire où le carbone trigonal de la liaison peptidique coupéepasse d’une hybridation sp 2 à une hybridation sp 3 (coordinationtétraédrique) suite à l'attaque d'un nucléophile.• sérine et cystéines (thiols) protéases:– mécanisme à 2 étapes passant par un intermédiaire réactionnel.– Nucléophile: Ser ou Cys• Métallo-protéases et Peptidases acides:– le nucléophile est une molécule d'eauStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Turk Nature Reviews Drug Discovery 5, 785–799 (September 2006) | doi:10.1038/nrd2092Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les Protéases• Bases de données spécifiques– MEROPS• http://merops.sanger.ac.uk/– PROLYSIS• http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis• Classification– Clan• Famille– Sous famille• Clan– un ancêtre commun• Similarité de structure 3D• Ordre en séquence des résidus catalytiques• Famille– Similarités de séquencesStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les ProtéasesBases de données spécifiques– MEROPS : http://merops.sanger.ac.uk/Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Bases de données spécifiques– MEROPS : http://merops.sanger.ac.uk/Statistiques Mars 2010Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

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Les protéases à sérine1. Généralités.• Les 4 grandes classes de protéases2. Les protéases à sérine• Mécanisme catalytique• Les 2 familles3. Les protéases à sérine de type trypsine• Repliement• Poche de spécificité4. Les protéases à sérine de type subtilisine• Repliement• Corrélation structure – fonction• Mutagenèse dirigéeStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Mécanisme catalytique des protéases à sérineTriade catalytique©MEROPS. PROLYSISReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Mécanisme catalytique des protéases à sérineTriade catalytique©MEROPS. PROLYSISReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Mécanisme catalytique des protéases à sérineCaractéristiques• Triade catalytique His Asp Ser.– Proches dans site actif mais éloignés en séquence.• His57, Asp102, Ser195 Trypsine• Asp32, His64, Ser221 Subtilisine• Fixation et stabilisation de l'état de transition intermédiaire en fournissantdes groupes pouvant former des liaisons hydrogène avec la charge négativecrée sur l'oxygène– Trou de l'oxyanion• Pas de spécificité absolue de substrat. Fixation non spécifique par la chaîneprincipale, possibilité d’hydrolyser après une grande variété de chaîneslatérales• Hydrolyse préférentielle après certains acides aminés– chymotrypsine: grand aromatique– trypsine: Lys ou Arg• Le résidu avant la liaison coupée est orienté dans une poche de l'enzyme.– Poche de spécificité. NomenclatureStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Mécanisme catalytique des protéases à sérine• Rôle de Ser195, His57• Rôle de Asp102. Stabilisation– Conformation de His57– Protonation en Nd1 plutôt que Ne2– Charge positive• H 2OVisualisation l'approche de la molécule H 2Opar cristallographie résolue dans le temps.Science, 1993, 259, 669-673.Jeu de diffraction: 5 à 8 expositions de 25ms.©MEROPS. PROLYSISReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

© 2003 Nature Publishing Group©MEROPS. PROLYSISReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérineLes 2 familles : 2 repliements différents– Les protéases à sérine de type trypsine– Les protéases à sérine de type subtilisine• Mécanisme d’évolution convergenteStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type TrypsineFamille avec le plus grand nombrede structures connues• 240 acides aminés• 2 domaines ß avec un mêmerepliement,– 2 tonneaux à 6 brinsantiparallèles.– Clé grecque + motif 2 brinsantiparallèle avec connexionépingle à cheveux.****Reproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type Trypsine**@Lesk 2001, Introduction to Protein Structure. Oxford University Press.Reproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type TrypsineSite Actif dans une crevasse formée entre les 2 domainesReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type TrypsineReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type TrypsineFamille avec le plus grand nombre de structures connues• 240 acides aminés• 2 domaines ß semblables,• Site Actif dans une crevasse formée entre les 2 domaines• Souvent Hélice à l'extrémité C-terminale• Souvent 3 à 6 ponts di-sulfures• Synthèse initiale sous forme de précurseurs non actif• Évolution par duplication de gène ?– Structure 3D des 2 domaines similaires sans similarité deséquence.– Ancêtre initial domaine 2 ?Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type TrypsineReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type TrypsineExemples : chymotrypsin. PDB code 1GG6.pdbS1: Ser. Hydrolyse préférentielle après grandaromatique trypsin. PDB code 1TPP.pdbS1 : Asp. Hydrolyse préférentielle après Lys, ArgStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type TrypsineStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type TrypsinePoche de spécificité :Quelles sont les bases structurales de l’hydrolyse préférentielleaprès un acide aminé donné ?EnzymeHydrolyse préférentiellePoche P1Résidus"Poche" S1Chymotrypsine Phe Ser 189, Gly 226, Gly 216Trypsine de Boeuf Arg, Lys Asp 189, Gly 226Thr 190, Gly 216Thrombine Humaine Lys Asp 189, Gly 226, Gly 216Elastase Ala Ser 189, Val 216, Thr 226Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type Trypsine : Poche de spécificité.Complémentarité stérique (forme, surface), électrostatiqueSubstrat en P1 / "Poche " S1 ("subsite " S1)Reproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type Trypsine : Poche de spécificité.Complémentarité stérique (forme, surface), électrostatiqueSubstrat en P1 / "Poche " S1Explication parfois simpliste.Mutagenèse dirigée : Trypsine.• Enzyme native Asp189 (S1) coupure préférentielle après Arg• Mutant Asp189Lys– Effets Attendus :• hydrolyse préférentielle après résidus acides• Perte de hydrolyse préférentielle après résidus basiques– Effets observés. Surprises :• Inactif pour hydrolyse après Asp et Glu• faible activité d’hydrolyse après Lys et Arg• même faible activité que l'enzyme non mutée une hydrolyse après Phe etTyr• augmentation de kcat/km de 5000 avec pour une hydrolyse après Leu– Pas d'explication de cette activité pour le mutant D189K. Structure 3D nonconnue.• Effet d'une mutation ponctuelle pas toujours si simple.Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine1. Généralités2. Les protéases à sérine3. Les protéases à sérine de type trypsine4. Les protéases à sérine de type subtilisine• Repliement• Corrélation structure – fonction• Mutagenèse dirigéeStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les Protéases à sérine de type subtilisine• 275 acides aminés.– Pas d'homologie de séquenceavec trypsine• Structure globulaire type /– construction autour d'unfeuillet parallèle à 5 brinsentourés d'hélices.– Site Actif à l'extrémité C-terminale des brins– Asp32, His64, Ser221Reproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les Protéases à sérine de type subtilisineReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - Paris• Structure du site actif similaire à la trypsine construit àpartir d'une architecture différente• Évolution convergenteStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Les Protéases à sérine de type subtilisineMême mécanisme catalytique que Protéase à sérine typetrypsine:• Triade catalytique Ser221, His64, Asp32• Trou de l’oxyanionReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - Paris• Motif -- avec une connectivité gauche– nécessaire au bon positionnement de His64 dans le site actifStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type SubtilisineStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type SubtilisineCorrélations Structure – fonctionMutagenèse dirigée. (TIBS, August 1988, 291-297)– Un grand nombre de structures à haute résolution– Un très grand nombre de mutants, de nombreuses données decinétique– Large gamme de spécificitéModification des propriétés :Catalyse, spécificité pour un substrat, pH, résistance à la chaleur, àl'oxydation et aux agents dénaturantsStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type SubtilisineMutagenèse dirigée. (TIBS, August 1988, 291-297)– Mutations dans le site actif– Mutations en dehors du site actifMutations en Alanine– Éviter problème encombrement stérique– Éviter d’ajouter des charges ou des groupementssusceptibles de faire des liaisons hydrogène.Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type SubtilisineMutations dans le site actif. Triade catalytique• Pratiquement pas d’effet sur leKm• Rôle de la serine catalytique• Après disparition de Ser,presque plus d’effetssupplémentaires• Catalyse résiduelle aprèsdisparition de la triadecomplète :– Contacts hors site actifparticipent aussi au degré decatalyse par fixationpréférentielle de l’état detransition de la réactionK cat /K uncat K cat /K AAASer His Asp 1,9 10 10 7 10 6Ala His Asp 3,0 10 3 1.1Ala Ala Asp 2,5 10 3 0,9Ala His Ala 2,5 10 3 0,9Ala Ala Ala 2,7 10 3 1,0Ser Ala Ala 2,3 10 4 8,4Ser His Ala 2,0 10 5 385Ser Ala Asp 3,4 10 3 1,2Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type SubtilisineMutations dans le site actifHis64Ala Kcat/Km 10 6ModélisationPossibilité compensation par His apportéepar le substratExpérience faite :Gain d’un facteur 4000Notion de catalyse assistée par le substratMutations dans le site actifAsn155Ala Kcat/Km 10 3 Implication de Asn155 dans la stabilisationde l’état de transitionReproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type SubtilisineMutations hors site actif :– Effets de l’encombrement stérique et desinteractions hydrophobes– Effets de la complémentarité électrostatiqueStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type SubtilisineMutations hors site actif.Effets de l’encombrement stérique et des interactions hydrophobes– Mutation Gly166 et effet sur substrat en P1Reproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Mutation Gly166 (S1) et effet sur substrat en P1Résidu en P1© TIBS, August 1988, 291-297Reproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Mutation Gly166 (S1) et effet sur substrat en P1Complémentarité stériqueEfficacité catalytique augmente par dessubstitutions hydrophobes jusqu’à une volumeoptimal puis diminution par (problèmeencombrement stérique)Optimisation du volume pour une fixationproductive.© TIBS, August 1988, 291-297Reproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type SubtilisineMutations hors site actif :– Effets de la complémentarité électrostatique• Observations ( à partir des structures)– Possibilités de ponts salins entre résidus de chargesopposées• résidus en position 156 et 166• résidus du substrat en position P1• Hypothèse : variation de sélectivité en modifiant la chargedu sous-site S1– Mutagenèse dirigée pour changer la charge globale de lapoche P1Structure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type Subtilisine• Mutagenèse dirigéepour changer la chargeglobale du sous-site S1• Effets sur l’hydrolysesélective après:– Glu / Gln– Lys / Met• Conclusion– Possibilités de fabriquerun clivage spécifiquepour des substrats en P1acide ou basique.© TIBS, August 1988, 291-297Reproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3

Protéases à sérine type SubtilisineSubtilisine de B. amyloliquefaciens et B. licheniformis• 86 résidus différents sur 275• des spécificités différentespar rapport à certains substrats.B. LicheniformisB. amyloliquefaciensMutations de seulement 3 résidus (triple mutant)en contact avec le substrat en P1 rendla spécificité des 2 enzymes très proches.© TIBS, August 1988, 291-297Reproduction ULP Strasbourg. Autorisation CFC - ParisStructure des Protéines II. 2011/2012. Chap 3